高通量測(cè)序與腫瘤課題思路

1、新一代測(cè)序技術(shù)（）新一代測(cè)序技術(shù)（）加速腫瘤個(gè)體化診療進(jìn)程加速腫瘤個(gè)體化診療進(jìn)程 基因基因IT的突破和個(gè)體化醫(yī)學(xué)的突破和個(gè)體化醫(yī)學(xué)Genetic IT & Personalized Medicine基因突變和過(guò)高或過(guò)低基因表達(dá)是大多數(shù)慢性疾病基因突變和過(guò)高或過(guò)低基因表達(dá)是大多數(shù)慢性疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)發(fā)生的分子基礎(chǔ)（系統(tǒng)，規(guī)范，標(biāo)準(zhǔn)）（系統(tǒng)，規(guī)范，標(biāo)準(zhǔn)）Genetics/Epigenetics人類估計(jì)人類估計(jì)20,000-25,000蛋白質(zhì)編碼基因蛋白質(zhì)編碼基因3 billion DNA base pairs人基因組測(cè)序人基因組測(cè)序: 基因基因組數(shù)據(jù)庫(kù)組數(shù)據(jù)庫(kù)(& Epigene

2、tics)人外顯子組人外顯子組(RNA)測(cè)測(cè)序序:基因組表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)基因組表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(&ncRNA) 個(gè)體生命特性和生物學(xué)功能個(gè)體生命特性和生物學(xué)功能正?；蚣膊≌；蚣膊?11年前完成人類基因組計(jì)劃年前完成人類基因組計(jì)劃讓人們看到曙光，慢性病的治愈良方馬上就能出現(xiàn)。如今，讓人們看到曙光，慢性病的治愈良方馬上就能出現(xiàn)。如今，靈丹妙藥依然難求，但低成本，快速，測(cè)序海量數(shù)據(jù)而新知靈丹妙藥依然難求，但低成本，快速，測(cè)序海量數(shù)據(jù)而新知識(shí)正在讓一部分病人受益，科技進(jìn)步帶來(lái)挑戰(zhàn)，復(fù)雜的生物識(shí)正在讓一部分病人受益，科技進(jìn)步帶來(lái)挑戰(zhàn)，復(fù)雜的生物學(xué)也在從中作梗，給病人治愈帶來(lái)難度和變數(shù)而也為技術(shù)進(jìn)學(xué)也在從中

3、作梗，給病人治愈帶來(lái)難度和變數(shù)而也為技術(shù)進(jìn)步確立了新的目標(biāo)。步確立了新的目標(biāo)?；蛲蛔兒瓦^(guò)高或過(guò)低基因表達(dá)是大基因突變和過(guò)高或過(guò)低基因表達(dá)是大多數(shù)慢性疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)多數(shù)慢性疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ) 基因突變基因突變 (DNA): 基因表達(dá)的改變基因表達(dá)的改變 (RNA): 遺傳生殖細(xì)胞突變: 突變的蛋白和正常蛋白表達(dá)的改變. 單個(gè)和多個(gè)基因突變 體細(xì)胞突變: 突變蛋白和正常蛋白表達(dá)的改變 遺傳單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 感染 生活方式 環(huán)境等分子箱（ molecular bins ）的概念 每一個(gè)癌癥都有獨(dú)特的分子異常改變。根據(jù)分子異常改變制定相應(yīng)的治療方案，每個(gè)患者對(duì)治療的療效也會(huì)不同。 如何

4、確定molecular bins？通過(guò)基因測(cè)序可確定分子異常改變、突變、突變譜、表觀遺傳異常、表達(dá)譜、甲基化譜等。 摘自吳一龍點(diǎn)評(píng)ASCO2013肺癌-分子靶向篇 流程圖流程圖細(xì)胞細(xì)胞/腫瘤黑盒腫瘤黑盒個(gè)體基因的百科全個(gè)體基因的百科全書書DNA測(cè)測(cè)序序需要特定的專業(yè)知識(shí)需要特定的專業(yè)知識(shí)/技能技能團(tuán)隊(duì)團(tuán)隊(duì)才能去理解句子才能去理解句子, 段落段落, 章節(jié)章節(jié), 整本基因書整本基因書?Point mutationsTruncationsInsertionFusion Cancer Genetic diseasesChen SY Confidential,保密突變突變X生物生物/病理學(xué)的后果？病理學(xué)

5、的后果？治療靶標(biāo)？治療靶標(biāo)？多學(xué)科專家組成多學(xué)科專家組成的的醫(yī)學(xué)基因信息分析團(tuán)隊(duì)醫(yī)學(xué)基因信息分析團(tuán)隊(duì): 遺傳學(xué)家遺傳學(xué)家, 腫瘤學(xué)家腫瘤學(xué)家, 免疫學(xué)家免疫學(xué)家, 醫(yī)生醫(yī)生, 生物信息學(xué)專家生物信息學(xué)專家7提綱腫瘤個(gè)體化診療背景測(cè)序技術(shù)的革命性發(fā)展新一代測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用檢測(cè)流程腫瘤個(gè)體化配藥 腫瘤個(gè)體化配藥： 對(duì)于每一腫瘤藥物只有1030%的患者能夠響應(yīng)治療。但目前醫(yī)生用藥前無(wú)法預(yù)知哪位患者能夠響應(yīng)某一藥物治療。這一情況造成巨大浪費(fèi)并耽誤對(duì)患者治療。 2010年腫瘤藥物市場(chǎng)600億美元，由于事先不知患者是否對(duì)藥物響應(yīng)，近450億美元的藥物沒(méi)有起到作用。 協(xié)同開(kāi)發(fā)個(gè)體腫瘤基因靶標(biāo)預(yù)測(cè)及FDA藥

6、物個(gè)體化匹配，建立個(gè)體腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)找到藥物敏感的標(biāo)簽基因至關(guān)重要。 目前：FDA批130多種腫瘤藥物對(duì)應(yīng)80多種基因靶標(biāo)，有的基因靶標(biāo)并無(wú)對(duì)應(yīng)的藥物，利用基因靶標(biāo)的標(biāo)簽基因表達(dá)譜掃描FDA非腫瘤藥物作用于腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)譜數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)尋找匹配藥物“藥物新用”給FDA非腫瘤藥物找到抗癌用途。已有成功報(bào)道。腫瘤診療的進(jìn)展和未來(lái)的趨勢(shì)從單個(gè)基因檢測(cè)到多基因檢測(cè)，確立腫瘤基因型，減少對(duì)病種（組織從單個(gè)基因檢測(cè)到多基因檢測(cè)，確立腫瘤基因型，減少對(duì)病種（組織學(xué)層次）的依賴學(xué)層次）的依賴按照突變基因組合（pattern）對(duì)腫瘤分型，選擇適用靶向藥物/藥物組合。檢測(cè)原癌基因、抑癌基因、DNA錯(cuò)配修復(fù)基

7、因的基因型為目前的基因檢測(cè)組合。未來(lái)：更多的基因突變+基因mRNA表達(dá)水平+甲基化+microRNA水平+蛋白水平+的綜合分型？off-label用藥從單基因突變型用藥從單基因突變型/野生型到按突變野生型到按突變pattern用藥：用藥：突變?cè)跊](méi)有FDA批下來(lái)的適用癥中出現(xiàn)，藥物有效，稱為off-label用藥，如貝伐單抗。單一用藥到復(fù)合用藥：腫瘤治療的組合用藥單一用藥到復(fù)合用藥：腫瘤治療的組合用藥 多基因檢測(cè)，綜合性分析10癌癥的發(fā)生是個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，潛伏期長(zhǎng)達(dá)癌癥的發(fā)生是個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，潛伏期長(zhǎng)達(dá)5-20年年癌細(xì)胞數(shù)量癌細(xì)胞數(shù)量103 106 109 1010-11 1012 11形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)

8、 免疫分型免疫分型 免疫球蛋白電泳免疫球蛋白電泳 免疫組化免疫組化 基因定性、定量基因定性、定量 基因突變檢測(cè)基因突變檢測(cè) MSI WHO規(guī)范化腫瘤綜合檢測(cè)規(guī)范化腫瘤綜合檢測(cè)-MICM分類標(biāo)準(zhǔn)分類標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)免疫學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)分子生物學(xué)分子生物學(xué) 常規(guī)病理常規(guī)病理 血細(xì)胞涂片血細(xì)胞涂片 核型分析核型分析 熒光原位雜交熒光原位雜交MICM癌癥診斷的分子化侵襲性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移侵襲性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移宏宏 觀觀惡性增殖與無(wú)控生長(zhǎng)惡性增殖與無(wú)控生長(zhǎng)細(xì)細(xì) 胞胞遺傳學(xué)表型的改變遺傳學(xué)表型的改變分分 子子2022-5-2021世紀(jì)腫瘤治療的策略的轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)（分子診斷技術(shù)） 2004年 ASCO會(huì)議預(yù)測(cè)：5-10

9、年后進(jìn)入 “個(gè)體化療”時(shí)代 2009年ASCO會(huì)議倡議：吹響腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的號(hào)角 2011年ASCO會(huì)議：腫瘤“個(gè)體化醫(yī)療”進(jìn)入快車道局部治療時(shí)代化療時(shí)代個(gè)體化治療時(shí)代第一代第一代第二代第二代第三代第三代“尋找與破壞尋找與破壞”（Seek & Destroy）“靶向與控制靶向與控制”（Target & Control） 2004年ASCO會(huì)議預(yù)測(cè)：5-10年后進(jìn)入 “個(gè)體化療”時(shí)代 2009年ASCO會(huì)議倡議：吹響腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的號(hào)角 2011年ASCO會(huì)議：腫瘤“個(gè)體化醫(yī)療”進(jìn)入快車道Pro. Eschenbach （NCI） 免疫治療免疫治療 治療不再是僅由腫瘤位置所決定，

10、更多的是由病人和腫瘤的基因?qū)W決定。 ASCO主席 Sandra Swain 我們?cè)谀[瘤和免疫細(xì)胞的重要靶標(biāo)上越來(lái)越有更好的目標(biāo)。 ASCO癌癥交流委員會(huì)主席 Bruce Roth肺腺癌的驅(qū)動(dòng)基因肺腺癌的驅(qū)動(dòng)基因Modified from Kris M, et al. IASLC 2012 Targeted Therapies Conference.KRASEGFR未知60%KRAS未知75%200419992005-2013未知25%KRASEGFRRETROS1MEKHER2METBRAFPIK3CAALKNRASNTRK115Cancers, like individuals, are d

11、istincteven at the molecular level藥物基因組學(xué)催生分子靶向藥物 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路 原癌基因和抑癌基因 細(xì)胞因子及受體 抗腫瘤血管形成 自殺基因通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因選擇靶向治療可以延長(zhǎng)患者通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因選擇靶向治療可以延長(zhǎng)患者OS14家LCMC成員單位入組1102例轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者檢測(cè)KRAS, EGFR, HER2, BRAF, PIK3CA, AKT1, MEK1，NRAS 突變，ALK 重排和 MET擴(kuò)增1007例至少一個(gè)基因檢測(cè)的患者中，622例（62%）檢測(cè)到至少一個(gè)驅(qū)動(dòng)基因狀態(tài)的改變；733例行全部10個(gè)基因檢測(cè)的患者中，465例（63%）檢測(cè)到至少一個(gè)基因狀

12、態(tài)改變Johnson BE, et al. 2013 ASCO Abstract 8019.LCMC Incidence of Mutation Detected通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因選擇靶向治療可以延長(zhǎng)患者通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因選擇靶向治療可以延長(zhǎng)患者OS279例(28%)伴驅(qū)動(dòng)基因突變患者的數(shù)據(jù)用于選擇靶向治療或入組靶向研究在有后續(xù)臨床隨訪信息的938例患者中，總生存分析如下：中位生存時(shí)間 (年)伴驅(qū)動(dòng)突變沒(méi)有接受靶向治療的患者(n=313)伴某種驅(qū)動(dòng)突變接受靶向治療的患者(n=264)不伴驅(qū)動(dòng)突變的患者 (n=361)P0.0001結(jié)論： 伴有已確定驅(qū)動(dòng)突變的患者中，接受靶向治療者的生存時(shí)間較未接受靶向治療

13、者明顯延長(zhǎng) 多重基因組檢測(cè)有助于臨床醫(yī)生選擇適當(dāng)?shù)幕颊哌M(jìn)行靶向治療和入組靶向治療臨床研究Johnson BE, et al. 2013 ASCO Abstract 8019.NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變譜：歐美人群驅(qū)動(dòng)基因突變譜：歐美人群迄今晚期NSCLC患者中開(kāi)展的規(guī)模最大的生物標(biāo)志物研究Barlesi F, et al. 2013 ASCO Abstract 8000; Giaccone G, et al. 2013 ASCO Abstract 7513.首個(gè)評(píng)估生物標(biāo)志物配對(duì)治療療效的前瞻性臨床研究NSCLC腺癌基因突變譜：亞洲研究腺癌基因突變譜：亞洲研究EGFR依然是亞裔腺癌最常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因

14、Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Wu YL, et al. 2011. 370例中國(guó)肺腺癌201例日本肺腺癌2022-5-20驅(qū)動(dòng)基因指導(dǎo)下的驅(qū)動(dòng)基因指導(dǎo)下的NSCLC臨床研究不斷深入臨床研究不斷深入Crizotinib 治療ROS1重排的晚期NSCLC33例ROS1陽(yáng)性NSCLC患者入組，31例接受crizotinib治療，在25例療效可評(píng)價(jià)患者中: ORR為56%，8周和16周DCR為76%和60%。 中位PFS尚未達(dá)到，因?yàn)?0%的患者仍在隨訪中，6個(gè)月PFS率為71%。主要毒副作用是視覺(jué)障礙、惡心及腹瀉。結(jié)論：結(jié)論： 雖然該研究仍在繼續(xù)，但

15、足以說(shuō)明雖然該研究仍在繼續(xù)，但足以說(shuō)明 crizotinib治療治療ROS1陽(yáng)性陽(yáng)性NSCLC有效。有效。Sai-Hong Ignatius Ou,et al. 2013 ASCO Abstract 803222基因多態(tài)性對(duì)藥物作用的影響藥代動(dòng)力學(xué)藥效動(dòng)力學(xué)藥物療效和毒性的個(gè)體差異基因多態(tài)性藥物靶點(diǎn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物代謝酶由于個(gè)體差異的存在。 僅有20%40%的患者從已批準(zhǔn)的藥物中獲益； 70%80%的藥物在臨床試驗(yàn)中被淘汰； 許多已被批準(zhǔn)藥物由于毒副作用而退出市場(chǎng)。GT突突變變野生型野生型突變型突變型 基因多態(tài)性（SNP）在人群中普遍存在； 人類基因組平均每1200bp就有一個(gè)SNP。不同患者不

16、同患者相同癌癥相同臨床分期相同病理分級(jí)影響因素影響因素相同的藥物相同的計(jì)量患者對(duì)藥物反應(yīng)正?；颊邔?duì)藥物不敏感用藥后產(chǎn)生毒副作用癌癥藥物治療個(gè)體化革命性的測(cè)序技術(shù)發(fā)展革命性的測(cè)序技術(shù)發(fā)展Sanger Sequencing 1977Next-Generation Sequencing 2004Ion Semiconductor Sequencing 2010The Chip is the Machine第一代測(cè)序 新一代測(cè)序 半導(dǎo)體芯片測(cè)序第一代測(cè)序的局限性u(píng)操作繁瑣，測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)u一次只能對(duì)單個(gè)基因的一個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序u樣本需求量大（微克級(jí)）u背景噪音難克服，難以確認(rèn)低頻突變u樣本中腫瘤含量要求高u

17、價(jià)格昂貴新一代測(cè)序技術(shù)新一代測(cè)序技術(shù)（nextgeneration sequencing）Roche454， Genome Sequencer FLXABI (Life)SOLiD 4 System Illumina/Solexa Hiseq 2000第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)高通量高通量27高通量測(cè)序加速腫瘤個(gè)體化用藥進(jìn)程高通量測(cè)序加速腫瘤個(gè)體化用藥進(jìn)程u一次能對(duì)多個(gè)基因多個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序u操作自動(dòng)化，測(cè)序時(shí)間短u樣本需求量?。{克級(jí)）u樣本中腫瘤含量需求少u可以確認(rèn)低頻突變(5%)u價(jià)格低廉28半導(dǎo)體芯片測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)半導(dǎo)體芯片測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)捷簡(jiǎn)捷光學(xué)電子信號(hào)光學(xué)電子信號(hào)快速快速個(gè)小時(shí)完

18、成測(cè)序個(gè)小時(shí)完成測(cè)序可擴(kuò)展性可擴(kuò)展性革命性的突破革命性的突破樣本采集樣本采集血血/組織組織/FFPE 提提取取DNA /RNA 建建 庫(kù)庫(kù) 模模板板 制制備備 測(cè)序測(cè)序 /驗(yàn)證驗(yàn)證Sh生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析醫(yī)學(xué)信息分析醫(yī)學(xué)信息分析 報(bào)告報(bào)告 生成生成檢測(cè)流程檢測(cè)流程缺一不可缺一不可/個(gè)體化分析個(gè)體化分析深度分析深度分析初步分析初步分析藥物藥物反應(yīng)反應(yīng)疾病疾病風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)腫瘤腫瘤突變突變?nèi)笾螆F(tuán)隊(duì)：技術(shù)，信息，醫(yī)學(xué)腫瘤樣本腫瘤樣本測(cè)序測(cè)序腫瘤基因腫瘤基因突變突變基因多態(tài)性基因多態(tài)性分析分析腫瘤突變譜腫瘤突變譜基因多態(tài)性基因多態(tài)性個(gè)體化個(gè)體化腫瘤腫瘤治療指導(dǎo)治療指導(dǎo)石蠟包埋組織切片或組織塊新鮮冰凍組織血液和骨髓其他檢測(cè)流程腫瘤個(gè)體化用藥基因檢測(cè)報(bào)告腫瘤個(gè)體化用藥基因檢測(cè)報(bào)告腫瘤個(gè)體化用藥基因檢測(cè)報(bào)告CDKVEGF損傷修復(fù)基因損傷修復(fù)基因MDM2反饋調(diào)節(jié)反饋調(diào)節(jié)p21切斷腫瘤血供切斷腫瘤血供GD-AIFBAI-1TSP血管生成因子血管生成因子抗血管生成因子抗血管生成因子p53Ku70 DNA-PK ATM 逆轉(zhuǎn)放療抗性逆轉(zhuǎn)放療抗性MDR逆轉(zhuǎn)化療抗性逆轉(zhuǎn)化療抗性細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞周