12第十二章實驗動物胚胎工程技術

1、12工程:通過構想、設計，按照人們的意愿制作、改造某一事物，以達到預想的目的。 生物工程： 按照工程學原理，對生物體或生物大分子進行改造或利用，用于生產、研究、檢定和創(chuàng)造新物種的綜合性科學技術。 遺傳（基因）工程 蛋白質工程 酶工程 細胞工程 微生物工程 胚胎工程 組織工程 分子水平分子水平細胞水平細胞水平組織水平組織水平3胚胎工程（embryonic engineering）又稱胚胎技術,是指用工程學的原理對動物的胚胎進行某種技術操作或改造，使之獲得人們所需要動物的一系列生物技術的總稱,包括以下四大技術體系：一、胚胎操作基本技術 1.超數排卵和卵母細胞、精子、受精卵的采集 2.體外受精 3.

2、胚胎性別控制 4.胚胎分割 5.胚胎培養(yǎng) 6.胚胎移植 7.胚胎冷凍保存二、體細胞克隆技術 三、干細胞技術四、外源基因導入技術4 1 1在畜牧業(yè)方面：在畜牧業(yè)方面：通過建立超數排卵、受精卵通過建立超數排卵、受精卵/ /卵母卵母細胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細胞克隆以及胚胎移植技術，加快良種家畜的繁殖和家細胞克隆以及胚胎移植技術，加快良種家畜的繁殖和家畜品種的改良。畜品種的改良。 5已在乳腺表達的生物活性蛋白并進入臨床2期或3期試驗：抗凝血酶一抗胰蛋白酶蛋白c乳鐵蛋白乳糖酶2在生物制藥方面：通過轉基因技術將具有藥用價值的生物活性蛋

3、白的基因整合到宿主的染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表達。通過收集、純化這些體液中的生物活性蛋白，用于預防和治療某些人類的疾病。6 3在醫(yī)學方面：通過建立卵母細胞的采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術，用于不孕癥的治療；通過對胚胎培養(yǎng)和檢測，剔除具有遺傳性疾病的胚胎，達到優(yōu)生優(yōu)育的目的。 4在生命科學研究方面：闡明哺乳動物早期胚胎發(fā)生、發(fā)育機制等基礎理論 5在拯救瀕危野生動物方面：通過野生動物生殖細胞和組織的冷凍保存、體細胞克隆和胚胎移植技術，擴大野生動物的種群。78胚胎操作的整個過程局限在胚胎的早期發(fā)育9解剖取附睪尾部解剖取附睪尾部精子的獲取和培養(yǎng)精子的獲取和培養(yǎng)1.精子的采集

4、嚙齒類小動物精子的采集大都從體成熟雄性動物的附睪獲取。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 大動物的精液采集可采用假陰道或電刺激方法促進雄性射精，收集精液。102.卵母細胞和受精卵的采集 在哺乳動物中獲得卵母細胞的途徑有兩條：從體內成熟并排到輸卵管中去，需通過處死動物或外科手術獲取；如果在交配后，則可獲取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或剛死亡的雌性動物的卵巢，從卵巢中分離卵母細胞經培養(yǎng)而得。小鼠解剖取輸卵管小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細胞從輸卵管壺腹部取卵母細胞/ /受精卵的方法受精卵的方法11 3.超數排卵（superov

5、olation）技術：通過注射激素刺激卵巢大量排卵。經超數排卵處理，動物卵巢大量的卵泡同時成熟并排出，排卵數可增加幾倍至十幾倍，一次可獲得大量的卵細胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（fsh）、人絨毛膜促性腺激素(hcg)和孕馬血清促性腺激素（pmsg）、孕酮和前列腺素（pg）等，以前三種常用。12檢查陰栓：妊娠0.5天中午12時中午12時上午8時24小時24小時20小時注射pmsg注射hcg小鼠超數排卵程序放到種公鼠籠內受精卵注射pmsg注射hcg晚上5-6時晚上5-6時24小時24小時卵母細胞采 集15小時13 體外受精（in vitro fertilization）是指成熟精子與

6、卵母細胞在體外環(huán)境下完成受精的過程。這一過程包括卵母細胞的收集或未成熟卵母細胞的培養(yǎng)成熟、精子的獲取、獲能處理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。 體外受精聯(lián)合胚胎移植技術（ivf）又稱試管嬰兒。 二、體外受精二、體外受精14 性別控制的研究，是畜牧業(yè)生物技術中一項重要的高新技術。這項技術的應用，可以使畜牧上大動物的繁殖按照人們的意愿只生產同一性別動物。 在醫(yī)學上，性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進行性肌營養(yǎng)不良，為x連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異?；虻话l(fā)病。攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，則可避免男性患兒的出生。 三、胚胎性別控制三、胚胎性別控制1

7、5性別控制技術1. 通過對x精子與y精子分離以控制性別2. 在胚胎移植前對胚胎的性別進行鑒定以控制性別3. 通過控制飼料特性、受精環(huán)境如改變精液或陰道的ph值等來控制性別。 16（一）分離x精子與y精子以控制性別 分離x精子與y精子的依據：x、y精子在體積、密度、電荷、運動性和dna含量、表面抗原等方面存在差異。將x和y精子分離再通過人工授精可以有效地達到性別控制的目的。 目前將x和y精子分離的方法有沉降法、電泳法、免疫法和流式細胞儀法等。流式細胞儀法是當前分離x、y精子較準確的方法，具有重復性、科學性和有效性的特點。17 應用流式細胞儀分離x和y精子的原理：x精子的dna含量比y精子的高。對

8、于奶牛，x精子比y精子dna含量高3.8，由于染料著色量與精子dna含量成正比，因此x精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光就比y精子強。正常人染色體正常人染色體18 具體的做法是：先用dna特異性染料對精子進行活體染色，然后精子連同少量稀釋液逐個通過激光束。探測器根據精子的發(fā)光強度把電信號傳遞給計算機，計算機指令液滴充電使發(fā)光強度高的液滴帶正電，弱的帶負電。即x精子帶上正電荷，y精子帶上負電荷。當經過高壓電場時會向不同方向偏轉，達到分離的目的。19（二）對胚胎進行鑒定以控制性別 在胚胎移植前對胚胎的部分組織用染色體檢查、間接免疫熒光法和pcr法進行性別鑒定。其中pcr法因有可靠的操作程序，具有高效、快

9、速的特點，近年來得到迅速的發(fā)展。 y染色體短臂上有決定雄性的dna片段-sry基因(sex-determining region of y-chromosome,全稱:y染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別鑒定提供了可靠的途徑。2021受精卵受精卵2 2細胞胚細胞胚4 4細胞胚細胞胚8 8細胞胚細胞胚桑椹胚桑椹胚囊囊 胚胚 胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預某一發(fā)育過程的可能性。行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預某一發(fā)育過程的可能性。四、胚胎培養(yǎng)四、胚胎培養(yǎng)22胚胎培養(yǎng)一般應用于以下幾個方面： 1未成熟卵母細胞通過體

10、外培養(yǎng)，成熟后進行體外受精。 2受精卵通過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保存。 3冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。 4通過研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，不斷完善胚胎培養(yǎng)條件，揭示胚胎細胞的生長發(fā)育和分化的奧秘。 目前胚胎培養(yǎng)技術已經可以將未成熟卵在體外成熟，并通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。即使如此，在體外胚胎培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動物的子宮內。23 -胚胎工程的最后一道工序 將受精卵或發(fā)育到一定時期的早期胚胎,移植到受體動物生殖管道的一定部位,能在子宮內著床、生長、發(fā)育、分娩、出生仔代動物的技術稱為胚胎移植。幾乎所有的

11、胚胎工程技術在體外完成對胚胎的操作后，都需經過胚胎移植這一步驟，得到我們所要的動物。五、胚胎移植五、胚胎移植24體外培養(yǎng)的胚胎必須移植到同步發(fā)情的雌性動物生殖管道內。解決同步發(fā)情的方法有兩種：1.利用自然同期發(fā)情的母畜，此法在實踐上較難辦到；2.通過注射某些藥物(如孕激素、雌激素等)誘發(fā)同期發(fā)情。 不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2細胞胚胎應移植到輸卵管內，而桑椹胚和囊胚期胚胎應移植到子宮內，以跟正常妊娠生殖生理變化同步。25同一種屬內的不同品種品系可互相進行胚胎移植。如近交系c57bl/6j小鼠的胚胎可移植到雌性封閉群icr的生殖管道內；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西蘭兔的生殖

12、管道內。這一特點在畜牧業(yè)特別有用，如為了加快良種奶牛的繁殖，可將良種奶牛的胚胎移植到普通黃牛的生殖管道內，借腹懷胎。 26 胚胎冷凍保存（embryo cryopreservation）技術是指在低溫（-196液氮內）條件下利用低溫保護劑保存生殖細胞及胚胎的一門技術。 六、胚胎冷凍保存六、胚胎冷凍保存27（一）胚胎冷凍保存的機制 低溫降低了胚胎內的生化反應速度。并且溫度越低，保存時間就越長。 低溫損傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結冰，溶液濃度提高，胞內水分大量滲出，導致細胞的強烈收縮和細胞處于高濃度的溶液中時間過長，從而造成化學損傷；如果冷卻速度過快，胞內水分來不及通過細胞膜向外滲出

13、，胞內溶液過冷而結冰，從而造成物理損傷。 同樣，在復溫（解凍）過程中，如果復溫速率不當也可能引起細胞內結冰（重結冰）而損傷。28 采用低溫保護劑防止低溫損傷： 二甲基亞砜（dmso）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（hes）等可以避免或減少結冰的程度與速度，降低細胞周圍未凍結溶液中的電解質濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物理和化學損傷。29 （二）胚胎冷凍保存技術的應用 1. 應用于實驗動物的保種和珍稀或瀕危動物種質保存。 應用于實驗動物胚胎的長途運輸。 應用于實驗動物的生物凈化。 應用于實驗動物育種和野生動物的實驗動物化。3031 克?。╟lone）的概念 克隆

14、是指無性繁殖或拷貝。 無性生殖在植物中很常見，在動物中過去認為是不可能的。 動物克隆是指生物體通過體細胞核移植生產出基因型幾乎與供體完全相同的后代。32 核移植（nuclear transfer）是指將動物細胞的細胞核移植到另一個體的去核卵母細胞胞質中，通過電激活，使供體核重編程序，形成的重構卵發(fā)育成胚胎，最后通過胚胎移植，使之發(fā)育成個體。 如果受體去核卵和供體移入的核來自同種動物，則稱種內核移植，來自不同的種則稱為種間核移植。 核移植由于沒有經過精子和卵子的受精過程，核移植動物的全部遺傳信息來自供體核細胞，等于是復制了提供細胞核的動物，因而把它俗稱為“克隆”。 33 根據供體核的來源不同，核

15、移植包括以下幾種： 1.胚胎細胞核移植：未著床的囊胚（未分化）2.胚胎干細胞核移植（未分化）3.胎兒成纖維細胞：出生前的胎兒（未分化或低分化）4.成年體細胞（已分化）3435 加快良種家畜的繁殖速度 與體細胞轉基因技術結合，能制備大家畜轉基因動物 拯救瀕危野生動物 治療性克隆，用于再生醫(yī)學363738一、概述干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞。根據發(fā)育階段，可將干細胞分為胚胎干細胞(embryonic stem cells，es細胞)和成體干細胞(adult stem cells，as細胞)。es細胞存在于囊胚期胚胎的內細胞團中，是全能性、無限增殖的干細胞，在胚胎的生長發(fā)育

16、過程中具有分化形成胎兒所有類型細胞、組織和器官的潛能。as細胞是es細胞定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細胞的能力，即分化為相應組織和器官中細胞的“專能”細胞，包括神經干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。3940誘導性多潛能干細胞” (induced pluripotent stem cells, ips 細胞)2006 年, takahashi 等首次發(fā)現導入特定的轉錄因子基因能夠使已分化的細胞重編程回歸到胚胎細胞狀態(tài)。他們通過慢病毒載體介導將oct4、sox2、c-myc 和klf4 4 種轉錄因子基

17、因導入小鼠皮膚成纖維細胞, 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細胞, 命名為“誘導性多潛能干細胞” (induced pluripotent stem cells, ips 細胞)。這一研究克服了es細胞和as細胞應用存在的諸多問題，展現了廣闊的應用前景，受到了整個生命科學領域的廣泛關注。目前研究中較為理想的供體細胞主要有血細胞(如t 細胞和b 細胞等)、脂肪細胞和皮膚成纖維細胞。41二、胚胎干細胞（es細胞) 來源：es細胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的內細胞群分離出來的未分化細胞。 內細胞群:具有未分化特性，可進一步分裂,分化形成內

18、、中、外三個胚層。 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經系統(tǒng)等， 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內胚層將分化為肝、肺和腸等。 由于內細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認為具有全能性。當內細胞群分離出來后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，我們稱之為es細胞。42 目前除了從目前除了從小鼠、大鼠小鼠、大鼠和和人人分離得到并建立分離得到并建立eses細胞系外，細胞系外，還未從其它動物的囊胚中分離還未從其它動物的囊胚中分離到到eses細胞系。細胞系。43 （二）es細胞的培養(yǎng) es細胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級，對培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合，es細胞容易發(fā)生

19、分化，從而失去es細胞的特性。 未分化es細胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過的成纖維細胞飼養(yǎng)層（feeder cell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細胞為es細胞提供細胞因子來維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，lif）能更有效地維持未分化的es細胞。 44（三）es細胞的鑒定 es細胞是一種正常的胚胎性干細胞，具有正常的染色體核型和體內外分化的潛能。在建系之初需要對其核型、分化能力和細胞標志物進行鑒定 1核型 2體外分化試驗 將es細胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數天后形成胚樣小體（embryoid bodies）的內皮樣大

20、型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞的分化。 3體內分化試驗 將es細胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下，2周后注射部位出現腫塊，病理檢查為畸胎瘤?；チ鰞炔坑卸喾N細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經細胞、成纖維細胞以及干細胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4es細胞的標志物 oct-4: oct-4（也叫oct-3或oct3/4）屬pou轉錄因子一員，它在全能胚胎干細胞(es)和生殖細胞表達。該表達對于維持干細胞的自我更新和多能性是必要的。es的分化導致oct-4的下調。 sseas: 人es細胞表達ssea-3和ssea-4，但不

21、表達ssea-1。小鼠es細胞表達ssea-1，但不表達ssea-3或ssea-4。 45（四）胚胎干細胞的應用1.用于研究哺乳動物個體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律由于es細胞可分化為胚胎內胚層、中胚層和外胚層中任何一種類型細胞，因此可用遺傳標記的es細胞(如標記半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通過組織化學染色追蹤es細胞的分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的es細胞已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。 46 2.在體外研究細胞的分化規(guī)律 es細胞僅在飼養(yǎng)層細胞上或在添加白血病抑制因子(lif)或白細胞介素-6(il-6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當培養(yǎng)液中添加分化誘導劑

22、，如牛黃酸(ra)、二甲基亞砜(dmso)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可誘導es細胞發(fā)生不同類型的分化，通過研究es的分化特點可揭示細胞分化和凋亡機理。473.用于研究基因的功能和制備基因敲除動物 由于用es細胞可進行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的es細胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細胞。 通過篩選獲得陽性細胞，然后用嵌合體或細胞核移植技術獲得轉基因動物。用于研究未知基因的生物學功能。484. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學上尚未攻克的頑癥。利用es細胞可以誘導分化形成新的

23、組織 細胞的特性，移植es細胞可使壞死或退化的部位得以修復并恢復正常功能。目前，在動物實驗方面，用es細胞誘導分化出的某些組織細胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。49 5.培育出人造組織器官，用于器官移植 隨著組織工程技術的發(fā)展，通過es細胞體外誘導分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。50三、成體干細胞1. 成體干細胞（as細胞）的來源as細胞位于出生后體內分化成熟的組織之中，具有自我更新和分化潛能，它在分裂時可產生兩個子代細胞，一個與原來干細胞完全一致，另一個向前分化，形成相應組織的多功能干細胞，通過分化增殖和更

24、新衰老細胞來構筑相應的器官，維持正常生理功能?，F在可從骨髓和血液、胎盤、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪、滑膜等多種組織中獲取各種多能干細胞。512. as2. as細胞的培養(yǎng)和誘導定向分化細胞的培養(yǎng)和誘導定向分化取所要分離as細胞的組織，用酶消化法分散細胞進行體外培養(yǎng)。再用各種技術從體外培養(yǎng)細胞中分離as細胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺as細胞。同es細胞一樣，as細胞的誘導定向分化需要細胞因子、激素等刺激，如il-l、il-11、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（gdnf）等。通常情況下，供體干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。然而在某些情況下干細胞的分化并不遵循這種規(guī)律，如神經外胚層來源的

25、nsc能分化為中胚層來源的細胞如肌細胞，肌肉干細胞會分化為各種血細胞系等。所有干細胞中，來源于骨髓的干細胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為造血干細胞(hsc)和骨髓間質干細胞(msc)。523. as細胞的鑒定各種as細胞都有自己的標記物，可利用標記物進行鑒定。4. as細胞的應用疾病的替代治療和移植治療 如用造血干細胞治療白血病，造血干細胞在體外誘導分化成心肌細胞來修復受損傷的心肌，治療心力衰竭。骨髓來源干細胞及其他來源干細胞都可以分化得到成骨細胞，通過將細胞與支架材料結合后移植于骨骼受損部位，用于修復骨骼缺損。53四、誘導性多潛能干細胞1.ips細胞的來源ips 細胞建立的過程主要包括

26、: 分離和培養(yǎng)宿主細胞； 通過病毒介導或基因轉染的方式將若干個多能性相關的基因（oct4、sox2、c-myc 和klf4）導入宿主細胞； 將病毒感染后的細胞種植于飼養(yǎng)層細胞上, 用es細胞專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng), 同時在培養(yǎng)液中根據需要加入相應的小分子化合物，以促進重編程。2.ips細胞的培養(yǎng)和誘導定向分化其培養(yǎng)條件和誘導定向分化的條件基本與es細胞相同。3.ips細胞的鑒定ips 細胞的鑒定與es細胞相同。54如何獲得人es細胞傳統(tǒng)技術 1. 用病人的皮膚細胞核移植到人去核卵母細胞人卵母細胞來源問題2. 用病人的皮膚細胞核移植到動物去核卵母細胞倫理問題新技術1. 用es細胞特異轉錄基因導入人皮

27、膚細胞，直接轉化成誘導多能干細胞（ips）(2007年）安全問題2. mirnas直接將皮膚細胞轉化為ips(2010年） 以病毒為載體，向老鼠的成纖維細胞中注入4個基因，將其改造為細胞，然后在此基礎上培育出一個老鼠胚胎，再把它植入代孕實驗鼠的體內。20天后，一只黑色的小老鼠出生。 554.ips細胞的應用ips 細胞與es細胞相比,具有很多優(yōu)勢。ips細胞的來源更方便、更豐富，可以通過有限的幾個轉錄因子基因轉染直接誘導各種不同動物的體細胞來獲取多能性干細胞，而不需要通過es細胞途徑，克服了許多動物至今未分離出es細胞的問題。ips細胞的產生不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克服了使用人胚胎進

28、行實驗的倫理問題，可見ips細胞必然成為未來相當長一段時間內的研究熱點。目前, 科學家們已經成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細胞中誘導并獲得ips 細胞。5657 將外源基因導入到胚胎內主要有以下幾種方法：將外源基因導入到胚胎內主要有以下幾種方法：一、直接導入受精卵或早期胚胎內一、直接導入受精卵或早期胚胎內 顯微注射法：顯微注射法： 在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源dnadna直接注入到受體的受精卵直接注入到受體的受精卵雄性原核內。雄性原核內。 逆轉錄病毒載體法：逆轉錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉錄病毒載體，感染受體細胞時，外源基因可將外源基因克隆

29、到逆轉錄病毒載體，感染受體細胞時，外源基因可整合到宿主細胞染色體內。用于轉基因和基因治療。整合到宿主細胞染色體內。用于轉基因和基因治療。 精子載體法：精子載體法： 將外源將外源dnadna與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源dnadna帶入卵內。帶入卵內。 58二、將外源基因轉染胚胎干細胞或體細胞，再將轉染的細胞作為供體二、將外源基因轉染胚胎干細胞或體細胞，再將轉染的細胞作為供體核移植到去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎。核移植到去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎。 1.1.將外源基因轉染胚胎干細胞或體細胞：將外源基因轉染胚胎干細胞或體細胞： 電穿孔法：

30、電穿孔法：細胞暴露于高電壓時，細胞膜為高電壓瞬時擊穿，從細胞暴露于高電壓時，細胞膜為高電壓瞬時擊穿，從而使外源而使外源dnadna被攝入細胞中。被攝入細胞中。 脂質體法：脂質體法：脂質體是一種人造膜，將外源脂質體是一種人造膜，將外源dnadna裝入脂質體，與培裝入脂質體，與培養(yǎng)細胞一起溫育，即可將外源養(yǎng)細胞一起溫育，即可將外源dnadna導入受體細胞。導入受體細胞。 基因槍法：基因槍法： deae- deae-葡聚糖介導法：葡聚糖介導法： 磷酸鈣介導法：磷酸鈣介導法： 592.帶有外源基因的es細胞通過崁合體技術進入囊胚胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細胞組合起來，由此而發(fā)育形成的動物稱

31、為嵌合體動物。由于嵌合體動物是兩類遺傳背景不同的胚胎發(fā)育形成的，不同細胞群體互相嵌合構成了器官和組織，但嵌合體動物攜帶的兩種遺傳特性不能同時遺傳給下一代的同一個體。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細胞是否在嵌合體動物體內分化成生殖細胞（精子或卵子）。分化成生殖細胞的親本的遺傳特性能傳給后代。60嵌合體動物的制備：1.聚合法 用聚合法制作嵌合體動物，是將遺傳上不同（例如毛色不同）的兩個816細胞胚胎用物理方法聚合起來。2.注射法 注射法是將胚胎干細胞或其他胚細胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。613.帶有外源基因的體細胞通過克隆技術進入胚胎將帶有外源基因的體細胞作為供體，通過核

32、移植技術克隆到去核卵母細胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕動物的子宮中。出生后動物的基因型與供體的基因型完全一致。62 外源基因進入細胞后的命運 外源dna進入細胞后有三種命運： 1被胞內酶降解。 2以游離狀態(tài)存在。游離的未整合外源dna只要有真核細胞能識別的啟動子、編碼基因以及poly(a)信號等，一般都能得到表達，但隨著細胞衰老，表達力下降。這種表達不能傳代，稱為暫時表達。 3整合到受體細胞染色體（只有少數）。整合到受體細胞基因組的外源基因，能隨細胞分裂遺傳到子細胞，稱為穩(wěn)定表達。63顯微注射法顯微注射法逆轉錄病毒感染逆轉錄病毒感染精子介導轉基因精子介導轉基因電穿孔電穿孔電穿孔電穿孔脂質體

33、轉染脂質體轉染磷酸鈣轉染磷酸鈣轉染生殖細胞或生殖細胞或早期胚胎早期胚胎eses細胞細胞體細胞體細胞隨機整合隨機整合定點整合或定點整合或隨機整合隨機整合定點整合或定點整合或隨機整合隨機整合64 外源基因整合到受體細胞染色體可分為以下兩種情況： 隨機插入（random insertion）：外源基因進入細胞后，隨機插入到任意的染色體內。如果插入到一個基因內，可能導致該基因的失活。另外，插入外源基因受鄰近調控序列的影響，其表達可能高，也可能低。 定點整合（targeted integration）：實現定點整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點整合部位的同源dna序列，即所謂的同源臂（homolo

34、gous arm）。當外源基因載體進入細胞后，同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近，通過同源重組，將外源基因載體置換到染色體相應的位置上，實現了定點整合。我們把這種技術形象地稱之為“基因打靶”。65 隨機整合（random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 插入到致死基因序列內：胚胎死亡 插入到功能基因序列內：基因失活 插入到調控區(qū)下游：外源基因表達增強/減弱66 定點整合（targeted integration） 同義詞：基因打靶（gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來并加以改造，再導入同種細胞內。該基因序列可以與細胞基因組內的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因置換到基因組內，實現靶基因敲除、替換或改造。67 同源重組（homologous reco