PTLC和柱色譜

1、淺談淺談（硅膠硅膠）制備型薄層色譜與制備型薄層色譜與（硅膠硅膠）柱色譜的操作問題柱色譜的操作問題結(jié)合我們實驗室中具體操作 一般我們實驗中應(yīng)用最多的是以硅膠 吸附劑為固定相的薄層色譜和柱色譜。 雖然很多化學實驗書中都敘述了（硅 膠）制備型薄層色譜與（硅膠）柱色譜的操作技術(shù)的實驗方法，但大多數(shù)都是比較雷同地泛泛地描述，而且有些描述在實驗室中并不適用。例如，很多書中都提到裝柱時先在底層鋪一層石英砂，加入固定相后再在頂部鋪一層石英砂。比較繁瑣，而且效果“？”，在實驗室中不適用。 吸附色譜的原理： 吸附色譜是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附 力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不

2、易被硅膠吸附， 整個過程即是吸附、吸附、 解吸、解吸、 再吸附、再吸附、 再解吸再解吸過程。第一部分（第一部分（硅膠）制備型薄層色譜硅膠）制備型薄層色譜(PTLC)(PTLC) 一、制板操作一、制板操作 二、二、點樣點樣操作操作 三、回收分離組分三、回收分離組分 四四、常見常見問題及注意事項問題及注意事項第二部分第二部分（硅膠）柱色譜的操作問題（硅膠）柱色譜的操作問題 一一、裝柱、裝柱 二二、上樣、上樣 三三、洗脫劑的使用、洗脫劑的使用 四四、洗脫洗脫的技巧的技巧第一部分（第一部分（硅膠）制備型薄層色譜硅膠）制備型薄層色譜(PTLC)(PTLC)一、一、制制板操作：板操作： 我們實驗室常用的制

3、板操作（手工制備硅膠硬板）： 1. 溶解制備0.5%CMC-Na溶液 (為何用0.5%CMC-Na溶液？) 先說一下先說一下CMC-Na （1）.結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): （2）物理和化學性質(zhì)）物理和化學性質(zhì)： 纖維素羧甲基醚的鈉鹽，為白色或乳白色纖維狀粉末或顆粒，幾乎無味，具吸濕性具吸濕性。 易于分散在水中成透明膠狀溶液，在乙醇乙醇等有機溶劑中不溶。1%水溶液水溶液pH為為6.58.5，當，當pH10或或5時，膠時，膠漿粘度顯著降低，在漿粘度顯著降低，在pH=7時性能最佳時性能最佳。 對熱穩(wěn)定，在20以下粘度迅速上升，45時變化較慢，80以上以上長時間長時間加熱可使其膠體變性而粘度和性能明加熱可使其膠體變

4、性而粘度和性能明顯下降。顯下降。 在堿性溶液中很穩(wěn)定在堿性溶液中很穩(wěn)定，遇酸則易水解，pH值為2-3時會出現(xiàn)沉淀，遇多價金屬鹽也會反應(yīng)出現(xiàn)沉淀。 作用是做粘合劑。其他粘合劑：煅石膏、淀粉煅石膏、淀粉等。 0.5%CMC-Na溶液制備過程： 例如，取蒸餾水1000ml，加熱煮沸煮沸，將羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉5g分次撒入沸水中，玻璃棒攪拌，直到完全溶解。煮沸前加少量煮沸前加少量水補水補蒸發(fā)量蒸發(fā)量。 為何分次加入CMC-Na？2.硅膠粘合 取一定量硅膠放入研缽中，加入3倍量倍量的0.5%CMC-Na溶液，向同一方向同一方向研磨至無氣泡，粘液成線狀粘液成線狀即可。 為什么要同一方向？ 3.鋪板

5、 適宜的薄層吸附劑的厚度為0.5-2mm，板的尺寸一般為20cm20cm大約需要硅膠的量為30克（經(jīng)驗值），所以PTLC常用來分離毫克級的樣品。二、二、點樣點樣操作操作 上樣是PTLC分離的一個最關(guān)鍵的步驟。薄層板最好先用甲醇甲醇展開一次，以減少雜質(zhì)的混入。 上樣前將樣品用揮發(fā)性的溶劑溶解，濃度應(yīng)在5%-10%左右，點樣帶應(yīng)盡量窄，以獲得較好的分離效果。 一般來講，一塊1mm厚的20cm20cm的硅膠薄層板可分離10-100mg的樣品，如果厚度加倍，可多上樣如果厚度加倍，可多上樣50%。三、回收分離組分三、回收分離組分 PTLC展開結(jié)束后，有紫外吸收的化合物，可以在紫外燈下確認色帶位置； 無紫

6、外吸收的化合物，可采用在板上面覆蓋一塊玻璃板，然后在板的邊緣噴灑顯色劑來確認色帶的位置。 確定各組分色帶的位置后，用刮刀將該色帶從板上刮下，然后用極性盡量低極性盡量低（極性越高，往往被提出的雜質(zhì)的極性越高，往往被提出的雜質(zhì)的量就越大量就越大）、對該化合物溶解度好的溶劑洗脫對該化合物溶解度好的溶劑洗脫，過濾除去吸附劑，收集洗脫液，回收溶劑，即可。 甲醇可溶解硅膠及其中含有的一些雜質(zhì)，因此，并不適合用來洗脫，較合適的溶劑是丙酮、乙醇或氯仿。丙酮、乙醇或氯仿。四四、常見常見問題及注意事項問題及注意事項1.板子裂口可能的原因：板子裂口可能的原因：（1）硅膠的比例太大（2）板子未自然干透，就在烘箱中活化

7、 （可用低溫大約40度左右烘30分鐘左右再用進行活化） （3）CMC-Na中有絮狀沉淀所致。 2.活化問題：活化問題： 活化的目的是除去水分，自然晾干后，再在105110活化，活化時間為0.51小時，冷卻后即可使用。厚板在活化時容易裂，可以降低活化溫度，自然晾干后，40至60攝氏度的烘箱中23小時即可，干燥器中保存。3.玻璃板清潔問題：玻璃板清潔問題： 可以先用洗手液或洗衣粉清洗，再用 自來水沖洗干凈，接著用蘸有乙醇的棉花擦拭干凈，最后把板吹干或烘干，放置于清潔處，備用。玻璃板應(yīng)該很干凈，沒有劃痕，沒有缺口，4個角要“健全”。4.平衡與飽和問題：平衡與飽和問題： 展開前薄層板置于盛有展開劑的展

8、開缸中飽和1530分鐘，此時薄板不與展開劑接觸。 飽和可以增加展開劑的散發(fā)面積，減少邊緣效應(yīng)。5.顯色的問題：顯色的問題：（1）物理顯色：紫外燈下觀察，常用波長254nm或365nm。（2）化學顯色： 通用型顯色劑： 碘蒸氣碘蒸氣對許多有機化合物都可以顯色，如生物堿、AA衍生物、肽類、脂類、皂苷類等，該顯色反應(yīng)是可逆反應(yīng)，在空氣中隨著碘的升華揮發(fā)，組分斑點可恢復(fù)到原來狀態(tài) 。 10%硫酸乙醇溶液硫酸乙醇溶液使大多數(shù)有機化合物產(chǎn)生有色斑點，例如棕色，甚至于出現(xiàn)熒光。 0.05%熒光黃甲醇溶液熒光黃甲醇溶液是芳香族與雜環(huán)化合物的通用顯色劑。 專屬性顯色劑第二部分第二部分（硅膠）柱色譜的操作問題（硅

9、膠）柱色譜的操作問題一、 裝柱 柱色譜用的硅膠一般是200-300目， 稱量硅膠時一般稱 3070 倍于上樣量， 如果極難分， 也可以用 100 倍量倍量以上以上的硅膠。 初做柱色譜很容易把柱子裝得長了或短了，有時還會有大量的硅膠剩余， 浪費硅膠， 這主要是對硅膠等固定相的使用的量沒有掌握。 解決方法很簡單：將稱取的干硅膠， 直接 倒入所選柱子中， 敲實， 觀察硅膠在柱子中的高度，這樣就可以做到心中有數(shù)了。一般在裝柱的時候可以根據(jù)實驗所需柱子的高度來調(diào)整硅膠的使用量，這樣就可以大大地節(jié)省硅膠的使用，避免造成沒有必要的浪費。 柱色譜的裝柱非常重要，裝柱的效果會直接影響層析分離效果。有濕法裝柱和干

10、法裝柱等兩種方法。 濕法裝柱很簡單，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脫劑多一倍的洗脫劑，將固定相拌成勻漿狀。柱子底部先用脫脂棉塞緊，并向柱子中加入適量初始流動相， 用漏斗將勻漿狀的固定相倒入柱子中， 將柱子中高出固定相的溶劑放出。期間可用橡皮棒敲打， 將固定相敲實， 做到密實均勻無密實均勻無氣泡氣泡即可。很多時候用加壓的方法可以很高效地很多時候用加壓的方法可以很高效地裝好柱子，而且在柱子中沒有氣泡產(chǎn)生。裝好柱子，而且在柱子中沒有氣泡產(chǎn)生。 干法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是，它是將干燥的吸附劑從柱子上端直接加入到一個空的柱子中，用洗脫劑將柱子沖實。干法裝柱的一個缺點就是在裝入洗脫劑后，干

11、法裝柱的一個缺點就是在裝入洗脫劑后， 由于溶劑和固定相之間的吸附放熱，由于溶劑和固定相之間的吸附放熱， 所以柱子容易變花所以柱子容易變花，影響分離效果。，影響分離效果。 解決的方法：（1 ） 固定相要裝結(jié)實；（2） 用較多的洗脫劑 沖柱子。 無論使用哪種方法裝柱，最后都要求所裝的無論使用哪種方法裝柱，最后都要求所裝的柱子結(jié)實、柱子結(jié)實、 勻稱、勻稱、 無氣泡。無氣泡。二、 上樣 上樣也有濕法和干法之分，我們實驗室常用干法上樣，就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，研磨均勻并在60下加熱揮盡溶劑。一般樣品和硅膠按 1:1 的量混合， 硅膠使用的量也可以少一些， 不能看到明顯的固體顆

12、粒，讓樣品都吸附在硅膠的表面上。然后小心地加入到裝好的柱子中， 加入洗脫劑洗脫，然后將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。 濕法一般用洗脫劑劑溶解樣品， 也可以用二氯甲 烷、 乙酸乙酯等， 但溶劑越少越好。再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁緩慢地均勻加入。 在不用海沙的情況下， 盡量不要破壞硅膠面。 加樣后， 打開柱底活塞， 讓固定相充分地吸附所加樣品。然后再加入一些洗脫劑，再充分地吸附后將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑， 而不會沖壞硅膠表面。 三、 洗脫劑的使用 洗脫劑的極性可用薄層色譜來確定， 一般以待分離樣品 Rf 值為值為 0.2-0.3 為宜。選擇的洗脫劑

13、應(yīng)該使兩相鄰物質(zhì) Rf 值之差最大化。 有時雖然在薄層板上看到分離的效果很好，但在柱色譜上還是很難分開。這主要的原因就是這主要的原因就是薄層薄層色譜色譜用用硅膠比柱硅膠比柱色譜色譜用硅膠要細得多用硅膠要細得多，所以分離效果好。解，所以分離效果好。解決的辦法就是決的辦法就是降低洗脫劑的極性降低洗脫劑的極性，一般柱，一般柱色譜色譜用用的的洗洗脫劑比薄層脫劑比薄層色譜色譜用的展開劑極性要再用的展開劑極性要再降低降低2-3倍倍可以達可以達到比較好的分離效果。到比較好的分離效果。 當所分離物質(zhì)極性跨度較大時， 可用采梯度洗脫的方法， 即逐漸增加溶劑的極性，使吸附在硅膠上的不同化合物逐個洗脫下來。 常用的

14、展開劑： 極性小的用乙酸乙酯： 石油醚系統(tǒng)； 極性較大的用甲醇： 氯仿（二氯甲烷）系統(tǒng)； 極性大的用甲醇： 水： 正丁醇： 醋酸系統(tǒng)； 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸氨水或冰醋酸。 對于很難分離的化合物，一是增加柱子的長一是增加柱子的長度和直徑，度和直徑， 二是減小洗脫劑的極性，二是減小洗脫劑的極性， 這樣可以很好地將混合物分開。在同樣能洗脫的情況下， 盡量使用毒性小的洗脫劑。 另外洗脫劑在洗脫柱子后最好也回收使用， 一方面環(huán)保， 另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費，缺點是要消耗一定的人工。 這里要注意的是： 一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸， 混合溶劑的比例由于揮發(fā)度的不混合溶劑的比例由于揮發(fā)度的不同會導(dǎo)

15、致極性的變化，同會導(dǎo)致極性的變化， 一般會使得極性變大，一般會使得極性變大， 在梯度淋洗時比較合適。在梯度淋洗時比較合適。還有一般回收的溶劑還有一般回收的溶劑中會有少量水分，使用前先要用干燥劑干燥好中會有少量水分，使用前先要用干燥劑干燥好才能使用。才能使用。四、洗脫技巧 柱色譜按過柱時的壓力可以分為： 加壓， 常壓， 減壓。壓力可壓力可以增加以增加洗脫洗脫劑的流動速度，劑的流動速度， 減少產(chǎn)品收集的時間，減少產(chǎn)品收集的時間， 但是會減低柱子但是會減低柱子的塔板數(shù)。的塔板數(shù)。 其他條件相同的時候 常壓柱是效率最高的， 但是時間也最長。 減壓柱能夠減少硅膠的使用量，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶

16、劑揮發(fā)， 有時會在柱子外面有水汽凝結(jié)， 另外有些比較易分解的東西可能得不到， 而且還必須同時使用水泵抽氣， 噪音大， 時間長， 所以減壓過柱用得比較少。 加壓過柱是一種比較好的方法， 與常壓柱類似， 但用外加壓力可以使淋洗劑走的快些。 壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球雙連球或者小氣泵 。特別是在容易分解的樣品的分離中很適用。一般壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。因為加壓過柱效率高， 分離效果較好， 所以加壓過柱在普通的有機化合物的分離中是非常適用的。 一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產(chǎn)生氣泡，一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產(chǎn)生氣泡， 使柱子變花，使柱子變花， 可以利用加壓過柱法在裝柱時就可以有效可以利用加壓過柱法在裝柱時就可以有