現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

1、整理ppt1 生生 物物 制制 藥藥 技技 術(shù)術(shù)第二章第二章 基因工程制藥基因工程制藥第三章第三章 細(xì)胞工程制藥細(xì)胞工程制藥第四章第四章 酶工程制藥酶工程制藥第五章第五章 動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制藥動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制藥第六章第六章 生物藥物的提取純化技術(shù)生物藥物的提取純化技術(shù)第一章第一章 緒論緒論整理ppt2 第一章第一章 緒論緒論第一節(jié)第一節(jié) 生物制藥的概念和內(nèi)容生物制藥的概念和內(nèi)容生物制藥生物制藥是指利用生物體或生物過程是指利用生物體或生物過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。生產(chǎn)藥物的技術(shù)。分類：分類： 發(fā)酵工程制藥發(fā)酵工程制藥 基因工程制藥基因工程制藥 細(xì)胞工程制藥細(xì)胞工程制藥 酶工程制藥酶工程制藥整理p

2、pt3第二節(jié)第二節(jié) 生物藥物的性質(zhì)與分類生物藥物的性質(zhì)與分類生物藥物的性質(zhì)生物藥物的性質(zhì) 優(yōu)點優(yōu)點：毒性低、副作用小、療效可靠。特：毒性低、副作用小、療效可靠。特異性異性 特別要提到的是利用重組特別要提到的是利用重組DNA 技術(shù)技術(shù)生產(chǎn)生產(chǎn) 的藥品，即新生物技術(shù)藥品，或簡的藥品，即新生物技術(shù)藥品，或簡稱生物新藥。稱生物新藥。劣點劣點： 1 成分復(fù)雜成分復(fù)雜 2 不穩(wěn)定、易變性、易失活不穩(wěn)定、易變性、易失活 3 易為微生物污染、破壞易為微生物污染、破壞 4 生產(chǎn)條件的變化對產(chǎn)品質(zhì)量影響較生產(chǎn)條件的變化對產(chǎn)品質(zhì)量影響較大大整理ppt4 二二 生物新藥的質(zhì)量保證生物新藥的質(zhì)量保證要點要點：產(chǎn)品的鑒別

3、、純度、活性、安全性、穩(wěn)：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和抑制性。定性和抑制性。鑒定方法鑒定方法電泳方法、免疫學(xué)分析方法、受體結(jié)合實驗、電泳方法、免疫學(xué)分析方法、受體結(jié)合實驗、各種高效液相色譜分析法、肽圖分析法、各種高效液相色譜分析法、肽圖分析法、Edman N-末端序列分析法、圓二色譜法、核磁末端序列分析法、圓二色譜法、核磁共振法共振法安全性評價安全性評價無病毒、無菌、無熱源、無致敏源無病毒、無菌、無熱源、無致敏源致突變、致癌和致畸致突變、致癌和致畸整理ppt5 三三 生物藥物的分類生物藥物的分類1 氨基酸類氨基酸類2 有機酸、醇酮類有機酸、醇酮類3 維生素維生素4 酶及輔酶類酶及輔

4、酶類（1）酶類藥物）酶類藥物 ：助消化酶類；消炎酶類；：助消化酶類；消炎酶類； 心血管疾病治療酶；心血管疾病治療酶； 抗腫瘤酶；抗腫瘤酶； 其他酶類：超氧化物歧化酶其他酶類：超氧化物歧化酶 （SOD） PEG-腺苷脫氨酶腺苷脫氨酶 RNA酶酶（2）輔酶類藥物：）輔酶類藥物：ATP NAD CoA FAD5 脂類脂類 （1）磷脂類）磷脂類整理ppt6（2）多價不飽和脂肪酸（）多價不飽和脂肪酸（PUFA）和前列腺素）和前列腺素（3）膽酸類）膽酸類 （4）固醇類）固醇類 （5）卟啉類）卟啉類6 多肽和蛋白質(zhì)類多肽和蛋白質(zhì)類 人體內(nèi)的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和細(xì)人體內(nèi)的生物活性因子，如激素、免

5、疫球蛋白和細(xì) 胞生長因子。胞生長因子。 紅細(xì)胞生成素（紅細(xì)胞生成素（EPO） 白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素-2（IL-2） 粒細(xì)胞集落刺激因子（粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF） 粒粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF） 腫瘤壞死因子（腫瘤壞死因子（TNF） 表皮生長因子（表皮生長因子（EGF）（用于傷口愈合）（用于傷口愈合）整理ppt77 核酸類及其衍生物核酸類及其衍生物（1）核酸類）核酸類 （2）多聚核苷酸）多聚核苷酸 （3）核苷、核苷酸及其衍生物）核苷、核苷酸及其衍生物 8 多糖多糖升白：增加白細(xì)胞升白：增加白細(xì)胞（1）抗生素）抗生素 （2）酶抑制劑）酶抑制劑 （3）免疫調(diào)

6、節(jié)物質(zhì)）免疫調(diào)節(jié)物質(zhì) （4）其他生物活性物質(zhì)）其他生物活性物質(zhì)整理ppt8第三節(jié)第三節(jié) 新型生物藥物研制的理論和方法新型生物藥物研制的理論和方法新的化學(xué)實體（新的化學(xué)實體（New chemical entity，簡稱，簡稱NCE）根據(jù)根據(jù)NCE來源將生物藥物大致分為兩類：來源將生物藥物大致分為兩類：一類是利用重組一類是利用重組DNA技術(shù)技術(shù)二類是利用微生物、動植物或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過二類是利用微生物、動植物或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過篩遠(yuǎn)可獲得這類新藥的篩遠(yuǎn)可獲得這類新藥的NCE的先導(dǎo)物。的先導(dǎo)物。新藥研究和開發(fā)的主要過程：新藥研究和開發(fā)的主要過程：1 確定研究計劃確定研究計劃 2 準(zhǔn)備化

7、合物準(zhǔn)備化合物 3 藥理篩選藥理篩選4 化學(xué)試驗化學(xué)試驗 5 臨床前臨床前I期期 6 臨床前臨床前II期期7 I期臨床期臨床 8 II期臨床期臨床 9 III期臨床期臨床10注冊申請上市注冊申請上市 11售后監(jiān)測售后監(jiān)測整理ppt9提供提供6000-8000個化合物個化合物 9-13年年 耗資約耗資約2.3億美元億美元先導(dǎo)化合物的尋找先導(dǎo)化合物的尋找整理ppt101 篩選模型的確定篩選模型的確定篩選模型的核心是藥物作用靶篩選模型的核心是藥物作用靶大規(guī)模篩選（大規(guī)模篩選（High-throughput screening，簡稱，簡稱HTS）（1）用動物細(xì)胞和組織建立的篩選模型）用動物細(xì)胞和組織建

8、立的篩選模型 LC50（2）酶抑制劑的篩選）酶抑制劑的篩選（3）受體拮抗劑的篩選）受體拮抗劑的篩選基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子為對象的治療基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子為對象的治療（1）轉(zhuǎn)錄因子的多樣性）轉(zhuǎn)錄因子的多樣性 （2）轉(zhuǎn)錄因子具有特異性）轉(zhuǎn)錄因子具有特異性（3）基因特異性轉(zhuǎn)錄因子與人類疾病有關(guān)）基因特異性轉(zhuǎn)錄因子與人類疾病有關(guān)整理ppt11開始考慮以凋亡為靶治療開始考慮以凋亡為靶治療2 先導(dǎo)化合物來源先導(dǎo)化合物來源一是從化學(xué)庫或天然產(chǎn)物中篩選一是從化學(xué)庫或天然產(chǎn)物中篩選二是與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)設(shè)計（合理新藥設(shè)計）二是與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)設(shè)計（合理新藥設(shè)計）合理藥物設(shè)計（合理藥物設(shè)計（Rational drug d

9、esign）則是基于）則是基于受體三維立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，通過計算機輔助分受體三維立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，通過計算機輔助分子設(shè)計全程合成新分子。子設(shè)計全程合成新分子?，F(xiàn)今從生物中篩選新藥重點放在微生物現(xiàn)今從生物中篩選新藥重點放在微生物人們也開始關(guān)注植物、動物人們也開始關(guān)注植物、動物人類和動物方面，則關(guān)注自身免疫系統(tǒng)人類和動物方面，則關(guān)注自身免疫系統(tǒng)新藥的研究與開發(fā)是一個將化學(xué)結(jié)構(gòu)研究與生物活新藥的研究與開發(fā)是一個將化學(xué)結(jié)構(gòu)研究與生物活性研究連接起來的創(chuàng)造性過程。性研究連接起來的創(chuàng)造性過程。整理ppt12第四節(jié)第四節(jié) 生物藥物的發(fā)展歷史和概況生物藥物的發(fā)展歷史和概況生物制藥的發(fā)展歷史生物制藥的發(fā)展歷史李時珍

10、李時珍本草綱目本草綱目醫(yī)生琴納（醫(yī)生琴納（Jenner ）發(fā)明了用牛痘疫苗治療天花）發(fā)明了用牛痘疫苗治療天花1860年，巴斯德發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，開創(chuàng)了第一次藥學(xué)革命年，巴斯德發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，開創(chuàng)了第一次藥學(xué)革命1928年英國弗萊明發(fā)明青霉素至年英國弗萊明發(fā)明青霉素至1941年在美國開發(fā)成年在美國開發(fā)成功。功。從生物體內(nèi)分離純化酶制劑的技術(shù)日趨成熟，酶類藥從生物體內(nèi)分離純化酶制劑的技術(shù)日趨成熟，酶類藥物得物得到廣泛應(yīng)用。到廣泛應(yīng)用。70年代年代Zenk 應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物藥物應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物藥物50年代提出的年代提出的DNA 雙螺旋理論及雙螺旋理論及70年代發(fā)展的重組年代發(fā)展的重組DNA整理pp

11、t13技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)使生物制藥進(jìn)入一嶄新的時代技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)使生物制藥進(jìn)入一嶄新的時代1982年，第一個基因工程藥物人胰島素上市年，第一個基因工程藥物人胰島素上市另一重大認(rèn)識就是認(rèn)識到生物多樣性對生物制藥的決定性另一重大認(rèn)識就是認(rèn)識到生物多樣性對生物制藥的決定性在基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)方面的研究水平與國外水在基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)方面的研究水平與國外水平相比差距已不大，國內(nèi)已建立了平相比差距已不大，國內(nèi)已建立了40多個臨床藥理試多個臨床藥理試驗基地。驗基地。 二二 生物制藥的發(fā)展概況生物制藥的發(fā)展概況1 基因工程基因工程 所依托的基礎(chǔ)理論為所依托的基礎(chǔ)理論為Watson-Crick

12、的的DNA 模板學(xué)說模板學(xué)說、Monod和和Jacob的操縱子學(xué)說。的操縱子學(xué)說。整理ppt14（1）基因工程藥物品種的開發(fā)）基因工程藥物品種的開發(fā)（2）應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型）應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型（3）應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種）應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種（4）基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用）基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用（5）利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物）利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物（6）基因工程抗體在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用）基因工程抗體在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用 抗體工程抗體工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程 奠定了細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合技術(shù)的理論基礎(chǔ)奠定了細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)

13、胞融合技術(shù)的理論基礎(chǔ)2（1）單克隆抗體技術(shù)）單克隆抗體技術(shù) 生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈整理ppt15（2）通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物）通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（3）動物細(xì)胞培養(yǎng)）動物細(xì)胞培養(yǎng) 三三 微生物工程微生物工程微生物工程也稱發(fā)酵工程微生物工程也稱發(fā)酵工程所采用的新技術(shù)主要應(yīng)用于所采用的新技術(shù)主要應(yīng)用于3個方面：個方面： 工藝改進(jìn)、新藥研制和菌種改造。工藝改進(jìn)、新藥研制和菌種改造。微生物藥物：微生物藥物： 即在微生物生命活動過程中產(chǎn)生的具有生理活性（或即在微生物生命活動過程中產(chǎn)生的具有生理活性（或稱藥理活性）的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物。稱藥理活性）的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物。 有酶抑制劑

14、、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、抗氧化劑。有酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、抗氧化劑。整理ppt16 四四 酶工程酶工程 酶工程是酶學(xué)與化工技術(shù)二者結(jié)合的產(chǎn)物酶工程是酶學(xué)與化工技術(shù)二者結(jié)合的產(chǎn)物 第五節(jié)第五節(jié) 生物制藥的發(fā)展趨勢生物制藥的發(fā)展趨勢 一一 生物制藥中的新技術(shù)生物制藥中的新技術(shù)1 大規(guī)模篩選的采用與創(chuàng)新大規(guī)模篩選的采用與創(chuàng)新 大規(guī)模篩選是大規(guī)模測試化合物的方法，采用機大規(guī)模篩選是大規(guī)模測試化合物的方法，采用機器人自動尋找特殊生物靶，如某個細(xì)胞表面受體或器人自動尋找特殊生物靶，如某個細(xì)胞表面受體或一個代謝有關(guān)酶的抑制劑（拮抗劑）或激動劑（興一個代謝有關(guān)酶的抑制劑（拮抗劑）或激動劑（興奮劑

15、）的技術(shù)。奮劑）的技術(shù)。2 高效分離純化系統(tǒng)的采用高效分離純化系統(tǒng)的采用（1）固相化金屬親和層析）固相化金屬親和層析 （2）超擴散層析）超擴散層析整理ppt17（3）灌注層析）灌注層析 BioCADworkstation（4）其他快速分離純化系統(tǒng)）其他快速分離純化系統(tǒng)AKTA explorer快速化工工藝開拓系統(tǒng)快速化工工藝開拓系統(tǒng)Streamline擴張柱床吸附技術(shù)擴張柱床吸附技術(shù)快速蛋白液相色譜（快速蛋白液相色譜（FPLC ）The biological system 高分辨生物分子純化而設(shè)計的層高分辨生物分子純化而設(shè)計的層析系統(tǒng)析系統(tǒng) 二二 Human genome project，簡稱

16、，簡稱 HGP約約10萬個萬個gene30億對堿基億對堿基整理ppt18 三三 基因治療基因治療基因治療基因治療從基因角度可以理解為將外來的基因?qū)幕蚪嵌瓤梢岳斫鉃閷⑼鈦淼幕驅(qū)爰?xì)胞，用正常的基因置換病源基因或補充缺失入細(xì)胞，用正常的基因置換病源基因或補充缺失的基因，從而達(dá)到治療的效果。的基因，從而達(dá)到治療的效果。基因治療的疾病有三類：基因治療的疾病有三類： 致死性遺傳性疾病致死性遺傳性疾病 用過去的治療法很難根治的癌癥用過去的治療法很難根治的癌癥 愛滋病等后天性疾病愛滋病等后天性疾病RNA 病毒可望用病毒可望用RNA 酶消滅酶消滅圖圖1-4為用核酸酶（為用核酸酶（RNA 酶）酶）整理pp

17、t19整理ppt20整理ppt21解決的問題：提供更多可供利用的基因解決的問題：提供更多可供利用的基因設(shè)計定向整合的載體：反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒設(shè)計定向整合的載體：反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒人類將逐漸具備在原子水平解決問題和在基因水人類將逐漸具備在原子水平解決問題和在基因水平上治療疾病的能力。平上治療疾病的能力。 四四 糖鏈工程糖鏈工程糖科學(xué)（糖科學(xué)（Glycoscience）和糖鏈工程）和糖鏈工程 即糖生物學(xué)即糖生物學(xué)蛋白或糖脂類蛋白或糖脂類 對生態(tài)信息的傳遞起著重要的作用對生態(tài)信息的傳遞起著重要的作用糖類藥物糖類藥物 整理ppt22 五五 細(xì)胞因子類藥物細(xì)胞因子類藥物 細(xì)胞因子細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞來源的

18、淋巴因子或巨噬細(xì)胞、單是淋巴細(xì)胞來源的淋巴因子或巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞來源的單核因子、免疫系統(tǒng)中具有各種生物活核細(xì)胞來源的單核因子、免疫系統(tǒng)中具有各種生物活性的一類因子的總稱。性的一類因子的總稱。對細(xì)胞因子的受體結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞因子糖鏈部分的結(jié)構(gòu)對細(xì)胞因子的受體結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞因子糖鏈部分的結(jié)構(gòu)和功能也做了大量研究。和功能也做了大量研究。整理ppt23第二章第二章 基因工程制藥基因工程制藥 第一節(jié)第一節(jié) 基因工程制藥概述基因工程制藥概述 基因工程（基因工程（Gene engineering），又稱，又稱重組重組DNA 技術(shù)。技術(shù)。它能使帶有支配各種各樣遺傳信息基因的它能使帶有支配各種各樣遺傳信息基因的DN

19、A 片段越過不片段越過不同生物間特異的細(xì)胞壁而組入到完全不同的生物體內(nèi)，定同生物間特異的細(xì)胞壁而組入到完全不同的生物體內(nèi)，定向的控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異。向的控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異。人胰島素（人胰島素（Insulin）具有多種生物功能，維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某具有多種生物功能，維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。生產(chǎn)方式：一是分別在大腸桿菌中合成生產(chǎn)方式：一是分別在大腸桿菌中合成A 鏈和鏈和B 鏈，再在體鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。 另一種是用分泌型載體表達(dá)胰島素原。

20、另一種是用分泌型載體表達(dá)胰島素原。整理ppt242 人生長激素人生長激素人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化多肽激素?；嚯募に?。刺激身體生長刺激身體生長hGH 對一些細(xì)胞的增殖和分化以及對一些細(xì)胞的增殖和分化以及DNA 合成有直接效應(yīng)。合成有直接效應(yīng)。干擾素（干擾素（Interferon，IFN ）同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA 和蛋白質(zhì)的和蛋白質(zhì)的合成。合成。 本身不能直接滅活病毒，而是

21、細(xì)胞在干擾素作用后產(chǎn)生本身不能直接滅活病毒，而是細(xì)胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白，從而阻斷病毒的繁殖。出多種抗病毒蛋白，從而阻斷病毒的繁殖。整理ppt25分為分為a b tb t三型三型基本特性包括種屬特異性、作用廣譜性和選擇基本特性包括種屬特異性、作用廣譜性和選擇性、相對無害性和特殊穩(wěn)定性。性、相對無害性和特殊穩(wěn)定性?？辜?xì)胞內(nèi)侵害微生物活性；抗細(xì)胞分裂活性；抗細(xì)胞內(nèi)侵害微生物活性；抗細(xì)胞分裂活性；調(diào)節(jié)免疫功能活性。調(diào)節(jié)免疫功能活性。用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病4 白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的又白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生

22、的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。激活并刺激激活并刺激T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化淋巴細(xì)胞的增殖和分化 刺激巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的活性刺激巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的活性整理ppt26 各種細(xì)胞的絲裂原各種細(xì)胞的絲裂原 治療惡性腫瘤和病毒性疾病治療惡性腫瘤和病毒性疾病5 集落刺激因子集落刺激因子是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，又稱造血刺激因子或造血生長因子。又稱造血刺激因子或造血生長因子。分類：分類：粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞集落刺激因子 巨噬細(xì)胞集落刺激因子巨噬細(xì)胞集落刺激

23、因子 粒細(xì)胞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子 多能集落刺激因子多能集落刺激因子功能：功能：刺激造血細(xì)胞增殖、維系細(xì)胞存活、分化刺激造血細(xì)胞增殖、維系細(xì)胞存活、分化 定型、刺激終末細(xì)胞的功能活性定型、刺激終末細(xì)胞的功能活性臨床多用作癌化療的輔助藥物臨床多用作癌化療的輔助藥物整理ppt276 促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素腎臟分泌的重要激素腎臟分泌的重要激素與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)能促進(jìn)紅細(xì)胞系列的增殖、分化及成熟能促進(jìn)紅細(xì)胞系列的增殖、分化及成熟治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和治療腫瘤化療后貧血治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和

24、治療腫瘤化療后貧血7 腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子除具有抗腫瘤外，還有抗炎活性，促凝血活性，促進(jìn)細(xì)胞因除具有抗腫瘤外，還有抗炎活性，促凝血活性，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細(xì)菌和真菌作用，熱原質(zhì)子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細(xì)菌和真菌作用，熱原質(zhì)以及參與骨質(zhì)重吸收以及參與骨質(zhì)重吸收淋巴細(xì)胞毒素淋巴細(xì)胞毒素8 組織型纖溶酶原激活劑組織型纖溶酶原激活劑tPA是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖熔酶，纖溶是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖熔酶，纖溶整理ppt28 酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，導(dǎo)致血栓溶解。酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，導(dǎo)致血栓溶解。主要用于治療血栓性疾病主要用于治療血

25、栓性疾病9 心鈉素心鈉素較強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓較強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫、氣喘治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫、氣喘10 重組乙肝疫苗重組乙肝疫苗美、法和德國都已研制出人工合成的前美、法和德國都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很多肽疫苗，具有很強的免疫原性強的免疫原性由化學(xué)合成的由化學(xué)合成的H BsAg多肽與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)形成復(fù)合蛋多肽與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)形成復(fù)合蛋白分子制成的疫苗白分子制成的疫苗整理ppt29第二節(jié)第二節(jié) 基因工程制藥中常用的基因工程制藥中常用的 工具酶和克隆載體工具酶和克隆載體 一一 常用工

26、具酶常用工具酶1 限制酶限制酶它們對堿基作用的專一性上及對磷酸二酯鍵的斷裂方式它們對堿基作用的專一性上及對磷酸二酯鍵的斷裂方式上具有一些獨特的性質(zhì)上具有一些獨特的性質(zhì)種類：種類：I型酶型酶 II型酶：簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或型酶：簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或只需只需Mg2+ ，能識別雙鏈，能識別雙鏈DNA 上特異的核苷酸序列，底上特異的核苷酸序列，底物作用的專一性強，而且其識別序列與切斷序列相一致。物作用的專一性強，而且其識別序列與切斷序列相一致。限制酶的命名限制酶的命名以寄主微生物屬名的第一個字母（大寫）和種名的前兩以寄主微生物屬名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（

27、小寫）寫成斜體字的個字母（小寫）寫成斜體字的3 個字母個字母整理ppt30 縮寫，菌株名以非斜體符號加在這三個字母的后面。若同縮寫，菌株名以非斜體符號加在這三個字母的后面。若同 一菌株中有幾種不同的限制酶時，則以羅馬數(shù)字加以區(qū)分。一菌株中有幾種不同的限制酶時，則以羅馬數(shù)字加以區(qū)分。例如例如 HindIII限制酶的特性限制酶的特性（1）不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列）不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列（2）各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu)）各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu) 雙重旋轉(zhuǎn)對稱排列雙重旋轉(zhuǎn)對稱排列 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 即正讀與反讀都相同即正讀與反讀都相同（3）各種限

28、制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種各種限制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種 粘性末端或平整末端粘性末端或平整末端整理ppt31 錯位切斷錯位切斷DNA -Cohesive ends Flush ends識別序列不同的限制酶，切割后有可能產(chǎn)生相同的粘性末端。識別序列不同的限制酶，切割后有可能產(chǎn)生相同的粘性末端。 同切口限制酶或同裂酶同切口限制酶或同裂酶 在連接酶的作用下，可以得到嵌合在連接酶的作用下，可以得到嵌合DNA ，稱為異源二聚體。，稱為異源二聚體。來源不同的限制酶，其識別序列可以相同，但其切點位置可不來源不同的限制酶，其識別序列可以相同，但其切點位置可不 同或相同。同或相同。

29、（4）某些限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，可能導(dǎo)致酶的識某些限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，可能導(dǎo)致酶的識別序列特異性發(fā)生改變別序列特異性發(fā)生改變在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有上述嚴(yán)格的識別序列在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有上述嚴(yán)格的識別序列導(dǎo)致限制酶的識別序列特異性發(fā)生改變，在導(dǎo)致限制酶的識別序列特異性發(fā)生改變，在DNA 內(nèi)產(chǎn)生附加切內(nèi)產(chǎn)生附加切割。稱為限制酶的第割。稱為限制酶的第2活性，又稱為星活性?；钚裕址Q為星活性。整理ppt32 2 DNA 聚合酶聚合酶大腸桿菌大腸桿菌DNA 聚合酶聚合酶I（1）5-3DNA 聚合酶活力聚合酶活力（2）5-3外切核酸酶活力外切核酸酶活力 降解降解RNA ：DNA

30、 雜交體的雜交體的RNA 部分部分（3）3-5外切核酸酶活力外切核酸酶活力主要功能是校對所合成的鏈?zhǔn)欠衲芘c模板精確無誤地配對在一起。主要功能是校對所合成的鏈?zhǔn)欠衲芘c模板精確無誤地配對在一起。 切口平移反應(yīng)：當(dāng)雙鏈切口平移反應(yīng)：當(dāng)雙鏈DNA 的一條鏈產(chǎn)生缺口時，的一條鏈產(chǎn)生缺口時，DNA 聚合聚合酶酶I將脫氧核苷酸添加到將脫氧核苷酸添加到3羥基末端上，與此同時，其羥基末端上，與此同時，其5-3外切酶外切酶從切口的從切口的5磷酸末端切除原有核苷酸磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿著使切口沿著DNA 平移平移,稱為切稱為切口平移反應(yīng)口平移反應(yīng),又稱為又稱為缺口翻譯缺口翻譯。 以放射性脫氧核苷酸置換原來

31、的脫氧核苷酸標(biāo)記以放射性脫氧核苷酸置換原來的脫氧核苷酸標(biāo)記DNA ，從而制，從而制作作DNA 探針。探針。整理ppt33整理ppt34大片段即大片段即Klenow 片段片段是用枯草芽孢桿菌蛋白酶裂解完整的是用枯草芽孢桿菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚聚合酶合酶I而產(chǎn)生或者通過克隆技術(shù)而得到的單一多肽鏈。而產(chǎn)生或者通過克隆技術(shù)而得到的單一多肽鏈。全酶中去除了全酶中去除了5-3外切核酸酶活力，而聚合酶活力及外切核酸酶活力，而聚合酶活力及3-5外切核酸外切核酸酶活力均不受影響。酶活力均不受影響。補平限制酶切割補平限制酶切割DNA 后產(chǎn)生的后產(chǎn)生的3凹端凹端 用用32PdNTP 補平補平3凹端，對凹端，對

32、DNA 片段進(jìn)行末端標(biāo)記片段進(jìn)行末端標(biāo)記 在在cDNA 克隆中，用于合成克隆中，用于合成cDNA 第二鏈第二鏈 應(yīng)用應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA 測序測序 T4 噬菌體噬菌體DNA 聚合酶聚合酶 與與Klenow 片段相似的是都具有片段相似的是都具有5-3聚合酶活力及聚合酶活力及3-5外切核酸酶外切核酸酶活力，而且活力，而且3-5外切酶活力對單鏈外切酶活力對單鏈DNA 的作用比對雙鏈的作用比對雙鏈DNA 更強。更強。整理ppt35 經(jīng)修飾的經(jīng)修飾的T7 噬菌體噬菌體DNA 聚合酶聚合酶 更強的更強的3-5外切核酸酶活力外切核酸酶活力 DNA 平均長度比其他

33、聚合酶大得多平均長度比其他聚合酶大得多 拷貝長段模板拷貝長段模板 測序酶，測序酶（測序酶，測序酶（2.0版）完全喪失了核酸外切酶活力版）完全喪失了核酸外切酶活力 Taq DNA 聚合酶及聚合酶及AmpliTaqTM DNA 聚合酶聚合酶 水生棲熱菌水生棲熱菌 具有具有5-3聚合酶活力和依賴于聚合作用的聚合酶活力和依賴于聚合作用的5-3外切核酸酶活力。外切核酸酶活力。 最佳作用溫度為最佳作用溫度為75-80。C，為避免引物自模板上解離往往需在，為避免引物自模板上解離往往需在低于最適溫度條件下起始聚合反應(yīng)。低于最適溫度條件下起始聚合反應(yīng)。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 整理ppt36反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄

34、酶鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒 H活力活力主要用于將主要用于將 mRNA 轉(zhuǎn)錄成雙鏈轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA ，也可用于制備，也可用于制備雜交用探針和標(biāo)記帶雜交用探針和標(biāo)記帶5突出端的突出端的DNA 片段。片段。DNA 連接酶連接酶 能將兩段能將兩段DNA 拼接起來的酶叫拼接起來的酶叫DNA 連接酶。連接酶。T4噬菌體噬菌體DNA 聚合酶聚合酶連接帶有匹配粘性末端的雙鏈連接帶有匹配粘性末端的雙鏈DNA連接平整末端的雙鏈連接平整末端的雙鏈DNA整理ppt37 大腸桿菌大腸桿菌DNA 連接酶連接酶 需需NAD 輔助因子輔助因子基因工程中常用的其他酶基因工程中常用的其他酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端

35、轉(zhuǎn)移酶或末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶或TDT酶）酶）作用底物是帶作用底物是帶3羥基端的單鏈羥基端的單鏈DNA 或帶或帶3羥基突出端的雙鏈羥基突出端的雙鏈DNA 。主要用于給載體或主要用于給載體或cDNA 加上互補的同聚尾以及用加上互補的同聚尾以及用32P 標(biāo)記的一種標(biāo)記的一種d NTP 來標(biāo)記來標(biāo)記DNA 片段的片段的3端。端。T4噬菌體多核苷酸激酶噬菌體多核苷酸激酶它能催化它能催化ATP 的的-磷酸基轉(zhuǎn)移至去磷酸化的磷酸基轉(zhuǎn)移至去磷酸化的DNA 或或RNA 的的5末端末端該酶可用于標(biāo)記該酶可用于標(biāo)記DNA 5末端末端整理ppt38 核酸酶核酸酶 BLA31核酸酶核酸酶 主要活力是主要

36、活力是3外切核酸酶活力，外切核酸酶活力，DNA 內(nèi)切酶活力內(nèi)切酶活力 反應(yīng)絕對依賴于鈣離子反應(yīng)絕對依賴于鈣離子（1）通過可控方式去除雙鏈）通過可控方式去除雙鏈DNA 的末端核苷酸從而縮短的末端核苷酸從而縮短DNA 分子分子（2）用于確定）用于確定DNA 小片段的限制酶切圖小片段的限制酶切圖 S1核酸酶核酸酶 單鏈特異性的內(nèi)切酶單鏈特異性的內(nèi)切酶 可降解單鏈可降解單鏈DNA 或或RNA（1）去除）去除DNA 片段中突出的單鏈尾部片段中突出的單鏈尾部（2）打開從）打開從 mRNA 合成雙鏈合成雙鏈cDNA 時產(chǎn)生的時產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)發(fā)夾環(huán)整理ppt39 堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 細(xì)菌堿性磷酸酯酶（細(xì)菌

37、堿性磷酸酯酶（BAP ）和牛小腸堿性磷酸酯酶（）和牛小腸堿性磷酸酯酶（CIP ）兩種）兩種 催化去除單鏈或雙鏈催化去除單鏈或雙鏈DNA 和和RNA 分子中的分子中的5-磷酸基（脫磷酸作用）磷酸基（脫磷酸作用） 去除切割載體去除切割載體DNA 兩端的兩端的5-磷酸基，防止自身環(huán)化磷酸基，防止自身環(huán)化 二二 常用的克隆載體常用的克隆載體 具有在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的具有在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的DNA 子就是外源子就是外源DNA 片段（基因）的片段（基因）的運載體，又可稱為分子載體或無性繁殖載體。運載體，又可稱為分子載體或無性繁殖載體。 有了復(fù)制子作為外源有了復(fù)制子作為外源DNA 的載體的載體質(zhì)粒質(zhì)粒

38、質(zhì)粒質(zhì)粒（Plasmid ）是一些存在于微生物細(xì)胞內(nèi)染色體外的閉合環(huán)狀）是一些存在于微生物細(xì)胞內(nèi)染色體外的閉合環(huán)狀雙鏈的小型雙鏈的小型DNA 分子。分子。整理ppt40 質(zhì)粒載體的改造和構(gòu)建質(zhì)粒載體的改造和構(gòu)建 特性特性 （1）要有復(fù)制子）要有復(fù)制子 （2）要有能促進(jìn)外源）要有能促進(jìn)外源DNA 高水平表達(dá)的調(diào)控區(qū)，如含有強啟動子高水平表達(dá)的調(diào)控區(qū)，如含有強啟動子 （3）要有多種限制酶的單一切點）要有多種限制酶的單一切點 （4）具有兩種以上易被檢測的選擇性遺傳標(biāo)記，作為對重組與非重組轉(zhuǎn)化）具有兩種以上易被檢測的選擇性遺傳標(biāo)記，作為對重組與非重組轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記（最好有一個具有插入性失活功能）。體

39、的選擇標(biāo)記（最好有一個具有插入性失活功能）。 （5）質(zhì)粒載體）質(zhì)粒載體DNA 的分子量要盡可能小，以利于載體容納較長區(qū)段外源的分子量要盡可能小，以利于載體容納較長區(qū)段外源DNA 片段。片段。 （6）應(yīng)屬于松弛型復(fù)制）應(yīng)屬于松弛型復(fù)制 （7）質(zhì)粒載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。）質(zhì)粒載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。整理ppt41 階段階段 （1）將選擇標(biāo)記引入含有）將選擇標(biāo)記引入含有pMB I或或ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中復(fù)制子的質(zhì)粒中 pBR322 僅僅4.36kb （2）調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，提高質(zhì)粒載體的效率）調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，提高質(zhì)粒載體

40、的效率 新型載體都引入一個人工合成的由多種常用限制酶單一識別序列組新型載體都引入一個人工合成的由多種常用限制酶單一識別序列組成的多克隆位點或多聚接頭。成的多克隆位點或多聚接頭。 （3）引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有某些特化功能的質(zhì)粒載體）引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有某些特化功能的質(zhì)粒載體 構(gòu)建可用組織化學(xué)方法鑒定重組克隆的質(zhì)粒載體構(gòu)建可用組織化學(xué)方法鑒定重組克隆的質(zhì)粒載體 如如pUC 載體帶有一個載體帶有一個Lac操縱子的操縱子的DNA 片段，該區(qū)段編碼片段，該區(qū)段編碼bb- -半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端的一個片段，該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型酶氨基端的一個片段，該片段能與宿主細(xì)胞所編

41、碼的缺陷型bb- -半乳糖苷半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補。外源酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補。外源DNADNA插入載體的多克隆位點后，可使酶的氨基端插入載體的多克隆位點后，可使酶的氨基端片段失活而破壞這種互補作用，導(dǎo)致帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含有誘導(dǎo)物片段失活而破壞這種互補作用，導(dǎo)致帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含有誘導(dǎo)物IPTGIPTG和生色底物和生色底物X-galX-gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色菌落，從而可用肉眼鑒定重組克培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色菌落，從而可用肉眼鑒定重組克隆。隆。整理ppt42 構(gòu)建帶有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點的質(zhì)粒載體構(gòu)建帶有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點的質(zhì)粒載體 可大量獲得載體可大量獲得載體DNA 雙鏈中的一條鏈雙鏈中的一條鏈

42、構(gòu)建帶有噬菌體啟動子的質(zhì)粒載體構(gòu)建帶有噬菌體啟動子的質(zhì)粒載體 體外得以轉(zhuǎn)錄體外得以轉(zhuǎn)錄RNA 而翻譯而翻譯 構(gòu)建可對重組克隆進(jìn)行正選擇的質(zhì)粒載體構(gòu)建可對重組克隆進(jìn)行正選擇的質(zhì)粒載體 某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物 構(gòu)建含有強啟動子的質(zhì)粒載體構(gòu)建含有強啟動子的質(zhì)粒載體 常用的幾種質(zhì)粒載體常用的幾種質(zhì)粒載體（1）pBR322 及其衍生載體及其衍生載體 非必需區(qū)域，分子量相對較大，能被非必需區(qū)域，分子量相對較大，能被Colk 帶動轉(zhuǎn)移帶動轉(zhuǎn)移 有關(guān)轉(zhuǎn)移的有關(guān)轉(zhuǎn)移的mob 區(qū)段剛好在非必需區(qū)域內(nèi)區(qū)段剛好在非必需區(qū)域內(nèi) 整理ppt43整理ppt44 pAT153載體載體 之間缺失之間缺

43、失2個片段個片段 包含結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)序列包含結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)序列 pBR327載體載體 （2）pUC系列載體系列載體 pUC18、 pUC19質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 pUC質(zhì)粒缺乏與控制拷貝數(shù)有關(guān)的質(zhì)粒缺乏與控制拷貝數(shù)有關(guān)的rop 基因，故這些質(zhì)粒復(fù)制的拷貝基因，故這些質(zhì)粒復(fù)制的拷貝數(shù)要比帶有數(shù)要比帶有pMB1或或ColE1復(fù)制起點的質(zhì)粒高得多。復(fù)制起點的質(zhì)粒高得多。 PUC118 、pUC119質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 帶有帶有M13 絲狀噬菌體絲狀噬菌體DNA 合成的起始、終止及合成的起始、終止及DNA 包裝進(jìn)入噬菌體包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的序列。顆粒所必需的序列。整理ppt45整理ppt46 這些質(zhì)粒

44、的宿主細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒這些質(zhì)粒的宿主細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA 中一條鏈，并能將此單鏈中一條鏈，并能將此單鏈DNA 包裝進(jìn)入子代噬菌體。包裝進(jìn)入子代噬菌體。 pUC 的衍生質(zhì)粒載體的衍生質(zhì)粒載體 噬菌體編碼的依賴于噬菌體編碼的依賴于DNA 的的RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄單位的啟動子聚合酶轉(zhuǎn)錄單位的啟動子噬菌體噬菌體噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建 噬菌體基因組為雙鏈線狀噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA 感染時，感染時，DNA 的兩末端配對并由連接酶的作用閉合成環(huán)狀的兩末端配對并由連接酶的作用閉合成環(huán)狀（1）A至至J區(qū)段：分布在基因組左臂，約占區(qū)段：分布在基因組左

45、臂，約占1/3基因組?；蚪M。 噬菌體頭部（噬菌體頭部（A-F ）、尾部（）、尾部（Z-J ）（2）J至至N之間非必需區(qū)段：約占之間非必需區(qū)段：約占1/3基因組基因組 控制重組及溶源性的基因，可被消除和取代控制重組及溶源性的基因，可被消除和取代整理ppt47整理ppt48（3）N 至至R 區(qū)段：分布在基因組右臂，與噬菌斑的形成有關(guān)。區(qū)段：分布在基因組右臂，與噬菌斑的形成有關(guān)。 包括調(diào)控及免疫性基因、包括調(diào)控及免疫性基因、DNA 復(fù)制基因、轉(zhuǎn)錄和裂解基因等。復(fù)制基因、轉(zhuǎn)錄和裂解基因等。 消除多余限制性內(nèi)切酶位點消除多余限制性內(nèi)切酶位點 消除基因組必需區(qū)內(nèi)的酶切位點，保留非必需區(qū)內(nèi)消除基因組必需區(qū)

46、內(nèi)的酶切位點，保留非必需區(qū)內(nèi)1-2個位點個位點 方法：點突變、基因組的置換和缺失方法：點突變、基因組的置換和缺失 去除去除DNA 中一些非必需區(qū)段中一些非必需區(qū)段 有有75 %-105 % 38-52 kb DNA 才能被包裝成噬菌體顆粒才能被包裝成噬菌體顆粒 插入型載體插入型載體 DNA 基因組中缺失部分非必需基因，只含有一個可供外源基因組中缺失部分非必需基因，只含有一個可供外源DNA 插入插入的限制性內(nèi)切酶位點的的限制性內(nèi)切酶位點的DNA 載體。載體。整理ppt49 替換型載體替換型載體 在在DNA 的可替換片段兩端具有兩個限制性內(nèi)切酶位點，酶切后替換的可替換片段兩端具有兩個限制性內(nèi)切酶位

47、點，酶切后替換片段與帶有所有必需基因的左右雙臂分開，有外源片段與帶有所有必需基因的左右雙臂分開，有外源DNA 代之。代之。 攜帶外源攜帶外源DNA 的重組體的正選擇標(biāo)記。的重組體的正選擇標(biāo)記。 提高載體在生物學(xué)防護(hù)上的安全性，引入了提高載體在生物學(xué)防護(hù)上的安全性，引入了WES三個基因的琥珀突三個基因的琥珀突變，這些特性使從實驗室環(huán)境中逃逸出重組噬菌體的可能性大大降低。變，這些特性使從實驗室環(huán)境中逃逸出重組噬菌體的可能性大大降低。 Charon16A 載體的基因載體的基因A 和和B 上誘變產(chǎn)生了琥珀突變。上誘變產(chǎn)生了琥珀突變。 結(jié)果在含有色原底物結(jié)果在含有色原底物Xgal和和Lac-指示菌的平板

48、培養(yǎng)基上形成無色的指示菌的平板培養(yǎng)基上形成無色的噬菌斑。噬菌斑。 常用載體常用載體（1）Charon系列載體系列載體 Charon40 載體是專門設(shè)計用來容納大片段載體是專門設(shè)計用來容納大片段整理ppt50（2）EMBL系列載體系列載體 EMBL3 、EMBL4 對稱的兩個多酶位點聚合接頭序列對稱的兩個多酶位點聚合接頭序列 EMBL3A 帶有兩個琥珀突變，可篩選出帶有兩個琥珀突變，可篩選出SUPF（琥珀抑制基因）相聯(lián)（琥珀抑制基因）相聯(lián)的的DNA 序列。序列。 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫（3）gt系列載體系列載體 為插入型系列載體，包括為插入型系列載體，包括gt10、pgt11、gt18-23等

49、等 gt10：專門為在其免疫區(qū)（：專門為在其免疫區(qū)（imm434 ？）內(nèi)單一的）內(nèi)單一的EcoR I位點上克隆位點上克隆小的小的cDNA 片段（約片段（約6kb）而設(shè)計的。）而設(shè)計的。 阻遏子基因阻遏子基因CI，CI基因失活形成了重組的基因失活形成了重組的CI-噬菌體，噬菌斑為噬菌體，噬菌斑為清亮斑，可與非重組的清亮斑，可與非重組的CI-噬菌體所產(chǎn)生的陰暗噬菌斑相區(qū)別。噬菌體所產(chǎn)生的陰暗噬菌斑相區(qū)別。整理ppt51整理ppt52整理ppt53 gt11：是一個常用的，可用于免疫學(xué)篩選的載體。：是一個常用的，可用于免疫學(xué)篩選的載體。 如果插入的如果插入的DNA 片段方向正確且轉(zhuǎn)譯讀框與片段方向正

50、確且轉(zhuǎn)譯讀框與LacZ基因一致，則基因一致，則重組噬菌體能在宿主菌內(nèi)指導(dǎo)重組噬菌體能在宿主菌內(nèi)指導(dǎo)bb- -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 含有對溫度敏感的阻遏子（含有對溫度敏感的阻遏子（4343。失活），可作為抗溶源性生長的選失活），可作為抗溶源性生長的選擇性。擇性。M13 噬菌體噬菌體M13 噬菌體的基本特性噬菌體的基本特性 基因組為環(huán)狀單鏈基因組為環(huán)狀單鏈DNA 分子分子 雄性專一性，即只吸附于帶有雄性專一性，即只吸附于帶有F質(zhì)粒的雄性大腸桿菌（質(zhì)粒的雄性大腸桿菌（F+）的性纖毛）的性纖毛 上而引起感染。上而引起感染。 轉(zhuǎn)換成雙鏈復(fù)制型（轉(zhuǎn)換成雙鏈復(fù)制型（RF ） 在基因在基因3產(chǎn)物的作用下，

51、以單鏈產(chǎn)物的作用下，以單鏈DNA 為模板，先從一個為模板，先從一個RNA 引物開始，引物開始， 通過宿主通過宿主DNA 聚合酶聚合酶III延伸，合成雙鏈延伸，合成雙鏈DNA（RFDNA ）。）。 然后在基因然后在基因2 整理ppt54產(chǎn)物作用下產(chǎn)物作用下RFDNA 進(jìn)行復(fù)制，每個細(xì)胞可產(chǎn)生進(jìn)行復(fù)制，每個細(xì)胞可產(chǎn)生50-100 RFDNA 拷貝。拷貝。由基因由基因5產(chǎn)生的產(chǎn)生的M13 單鏈結(jié)合蛋白與通過滾環(huán)復(fù)制合成的單鏈結(jié)合蛋白與通過滾環(huán)復(fù)制合成的DNA 單鏈結(jié)合單鏈結(jié)合并進(jìn)行包裝形成子代噬菌體。并進(jìn)行包裝形成子代噬菌體。 通過細(xì)胞壁擠出，并不殺死細(xì)胞通過細(xì)胞壁擠出，并不殺死細(xì)胞 細(xì)胞生長速率降

52、低，并不斷釋放子代噬菌體繼續(xù)感染周圍細(xì)胞細(xì)胞生長速率降低，并不斷釋放子代噬菌體繼續(xù)感染周圍細(xì)胞 在平板上不形成空斑，形成緩慢生長的慢性感染細(xì)胞圈在平板上不形成空斑，形成緩慢生長的慢性感染細(xì)胞圈 M13絲狀噬菌體載體的構(gòu)建絲狀噬菌體載體的構(gòu)建 將含有大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)區(qū)段和編碼將含有大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)區(qū)段和編碼bb- -半乳糖苷酶基因的頭半乳糖苷酶基因的頭145145個密碼插入這個區(qū)的酶切位點，得個密碼插入這個區(qū)的酶切位點，得M13 mp1M13 mp1，可被轉(zhuǎn)譯為多肽。，可被轉(zhuǎn)譯為多肽。 多肽雖然沒有酶活力，但當(dāng)多肽雖然沒有酶活力，但當(dāng)M13 mp1M13 mp1感染特殊的宿主菌感染特

53、殊的宿主菌JM103JM103時，會時，會導(dǎo)致導(dǎo)致多多互補而產(chǎn)生有活性的互補而產(chǎn)生有活性的b-b-半乳糖苷酶，在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上半乳糖苷酶，在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色噬菌斑。形成藍(lán)色噬菌斑。 這兩個載體對于具有兩個不同酶切位點末端的外源這兩個載體對于具有兩個不同酶切位點末端的外源DNADNA片段，可通片段，可通過強制克隆而定向連接。過強制克隆而定向連接。整理ppt55 常用的常用的M13 噬菌體載體噬菌體載體 M13 mp18、M13 mp19 LacZ區(qū)內(nèi)的多克隆位點中都含有區(qū)內(nèi)的多克隆位點中都含有13個不同的酶切位點個不同的酶切位點 兩個載體不會輕易自身再環(huán)化兩個載體不會輕易自身再

54、環(huán)化 外源外源DNA 在在M13 mp18、M13 mp19中以兩個互為相反的方向插入中以兩個互為相反的方向插入 pBR322質(zhì)粒載體的復(fù)制起點（質(zhì)粒載體的復(fù)制起點（Ori）和氨芐青霉素抗性基因（）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr）粘粒粘粒 粘粒是一種有噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由粘粒是一種有噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由DNAcos區(qū)與質(zhì)粒區(qū)與質(zhì)粒DNA 重重組構(gòu)建而成。組構(gòu)建而成。 是為克隆和增殖基因組是為克隆和增殖基因組DNA 的大片段而設(shè)計的和組建真核生物基因的大片段而設(shè)計的和組建真核生物基因文庫文庫 最大最大DNA 可達(dá)可達(dá)52kb，粘粒大小為，粘粒大小為4-7kb，適宜，適宜35-45

55、kb cosDNA 序列（將序列（將DNA 包裝到噬菌體顆粒中所必需的序列），攜有一包裝到噬菌體顆粒中所必需的序列），攜有一個復(fù)個復(fù)整理ppt56制起點（通常是制起點（通常是ColE1復(fù)制起點）和一個抗藥性標(biāo)記（通常是復(fù)制起點）和一個抗藥性標(biāo)記（通常是Ampr ）。）。 將兩個將兩個cos位點組合到同一個粘粒載體中，從而大大簡化在粘粒載體位點組合到同一個粘粒載體中，從而大大簡化在粘粒載體中的定向克隆。中的定向克隆。哺乳動物細(xì)胞載體系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞載體系統(tǒng) 一類是不帶真核復(fù)制子的質(zhì)粒型載體，是在原核質(zhì)粒中插入一個一類是不帶真核復(fù)制子的質(zhì)粒型載體，是在原核質(zhì)粒中插入一個完整完整的哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單

56、位和一個選擇標(biāo)記基因而組成的簡單載體的哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位和一個選擇標(biāo)記基因而組成的簡單載體系統(tǒng)。系統(tǒng)。如如 pTK2、pHyg、pRSVneo 另一類是帶有真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達(dá)載體。另一類是帶有真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達(dá)載體。5 整理ppt57第三節(jié)第三節(jié) 基因工程藥物無性繁殖系的組建基因工程藥物無性繁殖系的組建目的基因的制取目的基因的制取構(gòu)建基因文庫法分離目的基因構(gòu)建基因文庫法分離目的基因1 用一種或兩種限制酶消化噬菌體替換型載體，選用適當(dāng)方法將載體左、用一種或兩種限制酶消化噬菌體替換型載體，選用適當(dāng)方法將載體左、 右臂與中間部位的填充片段分離開。右臂與中間部位的填充片段分離

57、開。2 用一種或幾種限制酶部分消化高分子量的真核基因組用一種或幾種限制酶部分消化高分子量的真核基因組DNA ，再用凝膠電，再用凝膠電 泳或密度梯度離心法分離出適宜長度的泳或密度梯度離心法分離出適宜長度的DNA 。3 噬菌體載體臂與真核噬菌體載體臂與真核DNA 片段連接成較長的多聯(lián)體，再利用體外包裝系片段連接成較長的多聯(lián)體，再利用體外包裝系 統(tǒng)裝入噬菌體頭部，成為有感染力的噬菌體。統(tǒng)裝入噬菌體頭部，成為有感染力的噬菌體。4 重組噬菌體通過在大腸桿菌中生長而得以繁殖，所獲得的基因組重組噬菌體通過在大腸桿菌中生長而得以繁殖，所獲得的基因組DNA 文文 庫可被長時間利用和貯存庫可被長時間利用和貯存酶促

58、合成法制取目的基因酶促合成法制取目的基因平均每個細(xì)胞約含平均每個細(xì)胞約含10-5 g總總RNA整理ppt58整理ppt59 Mrna 總總RNA 的的1 %-5 % 從某些特定型別的分化細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目從某些特定型別的分化細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目 mRNA 占總占總 mRNA 的的50 %-90 %，稱為高豐度，稱為高豐度 mRNA 。 低豐度低豐度 mRNA 或稀有或稀有 mRNA 真核細(xì)胞的真核細(xì)胞的 mRNA 分子在其分子在其3端均有一多聚腺苷酸端均有一多聚腺苷酸poly（A），），20-250個個殘基組成的尾，可吸附于寡脫氧胸苷酸殘基組成的尾，可吸附于寡脫氧

59、胸苷酸-Oligo（dT ）纖維素。纖維素。 構(gòu)建構(gòu)建cDNA 文庫文庫 P T-PCR 法法從構(gòu)建的從構(gòu)建的cDNA 文庫中篩選目的文庫中篩選目的cDNA（1）真核細(xì)胞總）真核細(xì)胞總RNA 的分離的分離 釋放的內(nèi)源性釋放的內(nèi)源性RNA 酶（酶（Rnase）的活力）的活力 外源性外源性Rnase對對RNA 制品的污染制品的污染整理ppt60整理ppt61硫氰酸胍提取和氯化銫離心法硫氰酸胍提取和氯化銫離心法鹽酸胍和有機溶劑提取法鹽酸胍和有機溶劑提取法（2）帶）帶poly（A ）的）的RNA- mRNA 的分離純化與分析的分離純化與分析常用常用Northern雜交（雜交（RNA 印跡法）測定總印跡

60、法）測定總RNA 或或poly（A ）RNA 樣樣品中特品中特定定 mRNA 分子的大小和豐度。分子的大小和豐度。（3）cDNA 文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建cDNA 第一鏈的酶促合成第一鏈的酶促合成 禽源和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶禽源和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶cDNA 第二鏈的合成第二鏈的合成自身引導(dǎo)法：雜交體變性而分開后，單鏈自身引導(dǎo)法：雜交體變性而分開后，單鏈cDNA 端能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)端能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而引導(dǎo)而引導(dǎo)E.coliDNA 聚合酶聚合酶I Klenow 片段酶促合成片段酶促合成cDNA 第一鏈。第一鏈。置換合成法：利用置換合成法：利用cDNA：mRNA 雜交體為切口平移的模板，由雜交體為切口平移的模板，由R