無菌、微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗(yàn)證

1、l省藥品檢驗(yàn)所l1、無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見問題l2、微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見問題l3、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見問題相關(guān)規(guī)定無菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見的問題 一、相關(guān)規(guī)定 藥品無菌和微生物限度檢查方法驗(yàn)證作為中國(guó)藥典2005年版增訂的一項(xiàng)重要內(nèi)容對(duì)促進(jìn)我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化是十分重要和必要的，執(zhí)行近一年以來的情況表明，方法驗(yàn)證是促使我國(guó)藥品無菌和微生物限度檢查方法更加合理、科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹匾緩?。?006年6月全國(guó)會(huì)議紀(jì)要） 中檢所和藥典會(huì)多次召開會(huì)議肯定工作的成績(jī)、研討存在的問題，希望各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)能給予高度重視，從各方面支持這項(xiàng)工作長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展。 實(shí)際工作中

2、，藥品生產(chǎn)、研發(fā)企業(yè)和各級(jí)藥檢所在工作中都存在很多困難和問題。l各藥品檢驗(yàn)所：l 根據(jù)國(guó)食監(jiān)注2005234號(hào)“關(guān)于頒布和執(zhí)行中國(guó)藥典2005年版有關(guān)事宜的通知”規(guī)定，中國(guó)藥典7月1日起開始執(zhí)行，各藥品檢驗(yàn)所在執(zhí)行“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”過程中遇到了一些問題，為保證中國(guó)藥典2005年版的順利實(shí)施，現(xiàn)就有關(guān)問題說明如下：l 1“微生物限度檢查”和“無菌檢查”是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目。雖然近幾版中國(guó)藥典均收載有“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”，但在如何保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性方面與國(guó)外藥典相比仍具有一定差距，其關(guān)鍵是中國(guó)藥典未強(qiáng)調(diào)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。為此，

3、藥典會(huì)設(shè)立專項(xiàng)科研課題，對(duì)2005年版中國(guó)藥典的“微生物限度檢查法”和“無菌檢查法”增加驗(yàn)證試驗(yàn)的必要性進(jìn)行研討。根據(jù)研究結(jié)果，2005年版中國(guó)藥典規(guī)定當(dāng)進(jìn)行藥品的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時(shí)應(yīng)進(jìn)行方法驗(yàn)證。l驗(yàn)證的目的是為了確認(rèn)試驗(yàn)中供試品應(yīng)選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、何種測(cè)定方法及確定的檢測(cè)系統(tǒng)是否適用于該供試品的檢驗(yàn)，即只有通過方法驗(yàn)證，才能確定供試品的檢驗(yàn)條件和方法，保證“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 l2不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，特別是中成藥，因原料來源、工藝、輔料的不同，藥品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性；同一個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，因原料來

4、源不同、工藝改變或不同實(shí)驗(yàn)室等原因，也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。因此，不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種進(jìn)行“微生物限度檢查”或“無菌檢查”時(shí)，其具體試驗(yàn)方法如沖洗量等不能簡(jiǎn)單照搬，需通過驗(yàn)證試驗(yàn)核實(shí)該試驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)是否適宜。 l3目前各藥檢所涉及的檢驗(yàn)工作可分為三類：注冊(cè)檢驗(yàn)（包括進(jìn)口注冊(cè)和新藥注冊(cè)）、監(jiān)督抽驗(yàn)和進(jìn)口檢驗(yàn)?？紤]到各檢驗(yàn)性質(zhì)的差異，各口岸所在進(jìn)行進(jìn)口復(fù)核及進(jìn)口檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證材料或詳細(xì)的SOP資料進(jìn)行審核；各口岸所完成復(fù)核時(shí)應(yīng)在修訂的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中明確“微生物限度檢查”或“無菌檢查”的關(guān)鍵操作點(diǎn)（如供試品的處理方法等）及試驗(yàn)方法（如平皿法、薄膜過濾法、直接接種法等），并在復(fù)核

5、說明中概述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以方便以后的進(jìn)口檢驗(yàn)。l對(duì)國(guó)內(nèi)新藥的注冊(cè)檢驗(yàn)，也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料，如果企業(yè)提供不出方法學(xué)驗(yàn)證資料，根據(jù)藥品注冊(cè)管理辦法，應(yīng)在審核意見中明確指出“方法學(xué)未經(jīng)驗(yàn)證，無法檢驗(yàn)”，并建議企業(yè)重新建立“微生物限度檢查”或“無菌檢查”方法。監(jiān)督抽驗(yàn)藥品，由于2005年版以前歷版中國(guó)藥典未強(qiáng)調(diào)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，故各藥檢所目前在進(jìn)行具體品種檢驗(yàn)時(shí)難度較大，故也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料并進(jìn)行審核，未經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證的“微生物限度檢查”或“無菌檢查”結(jié)果，決不能給出“符合2005年版中國(guó)藥典的規(guī)定”的結(jié)論。 l 國(guó)家藥典委員會(huì) l 中國(guó)藥品生物制品檢定所l 二00五年十月十一日 驗(yàn)證的

6、目的: 驗(yàn)證所采用的方法和條件是否適合于供試品的無菌檢查。 即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計(jì)。 驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。 二、無菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證的類型前驗(yàn)證: 建立藥品的微生物限度檢查法和無菌檢查法時(shí)（當(dāng)建立藥品的無菌或微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查）。 再驗(yàn)證: 修訂的檢驗(yàn)方法;供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí) ;定期的方法驗(yàn)證（若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證） 。l金黃色葡萄萄球菌 (Staphylococcus

7、 aureus) CMCC(B) 26 003l銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 *擬修訂為大腸埃希菌l枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501l生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941l白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98 001l黑曲霉 (Asperglllus niger) CMCC(F) 98 003菌種的要求： 傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，

8、以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。加菌量:100cfu。 驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法： 直接接種法 薄膜過濾法l將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌同法操作。l取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法

9、培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人規(guī)定量的供試品，另1管作為對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。 如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。增加沖洗量增加培養(yǎng)基的用量使用中和劑或滅活劑： -內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸 更換濾膜品種注意：重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。總的要求：詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、可操作性l供試品信息l檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量：按照無菌檢

10、查的量確定l供試品處理、供試品溶液的制備l檢驗(yàn)方法（選擇直接接種法說明理由）l實(shí)驗(yàn)用菌 代數(shù)、稀釋級(jí)、計(jì)數(shù)l檢驗(yàn)條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時(shí)說明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等條件）。l需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明l逐日記錄各菌的生長(zhǎng)情況l采用的方法：薄膜過濾法/直接接種法l關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)點(diǎn)：如沖洗條件、中和、酶處理等因素l按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，而驗(yàn)證試驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌的生長(zhǎng)的影響，可以與對(duì)照濾器比較而作出判斷，所以驗(yàn)證試驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可（中檢所講義）。l普通濾膜l有機(jī)膜l低吸附濾膜l1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇

11、濾膜材質(zhì)。l2.應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。l3.采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。l培養(yǎng)觀察時(shí)間 驗(yàn)證試驗(yàn)：按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天 無菌檢查：陽性對(duì)照培養(yǎng)4872h應(yīng)生長(zhǎng)良好 問題：生長(zhǎng)緩慢的判斷標(biāo)準(zhǔn)？l敏感菌株與陽性對(duì)照菌 陽性對(duì)照菌不是驗(yàn)證試驗(yàn)選定的敏感菌株 問題：降低了陽性對(duì)照菌的意義，實(shí)際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽性對(duì)照只能選擇金黃色葡萄球菌。l供試品無菌檢查中規(guī)定“抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌”，但在方法學(xué)驗(yàn)證中所用菌株沒有大腸埃希菌。l解決措施：抗革蘭陰性菌的抗菌藥物進(jìn)行方法學(xué)

12、驗(yàn)證時(shí)增加大腸埃希菌。l即將修訂，將銅綠假單胞菌修訂為大腸埃希菌。修訂后按新方法執(zhí)行。l薄膜過濾法和直接接種法l如：一般供試品（無特殊說明）采用直接接種法某廠家胸腺五肽注射液為普通注射劑，完全可以采用薄膜過濾法，生產(chǎn)單位進(jìn)行的無菌檢查驗(yàn)證法為直接接種法。l也有的廠家把兩種方法的驗(yàn)證都寫上，結(jié)論中也沒有說明采用那種方法。lCP2005：無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。l修訂：改為薄膜過濾法重新進(jìn)行驗(yàn)證。l進(jìn)行供試品無菌檢查時(shí)，所采用的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。l結(jié)合無菌檢查檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量確定驗(yàn)證時(shí)取樣量。l如同時(shí)進(jìn)行無菌檢查一定要按照規(guī)定

13、的檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量取樣。l生產(chǎn)單位進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)數(shù)量要按照表1 批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量。檢驗(yàn)量（每只樣品接入每種培養(yǎng)基的最少樣品量）同上市抽驗(yàn)品種。l無菌檢查法中規(guī)定：只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過濾。因此，驗(yàn)證試驗(yàn)中檢驗(yàn)量就多不就少，如10ml注射液，雖然每個(gè)濾膜每容器取2ml也符合藥典規(guī)定，10支分配至3個(gè)或更多濾筒也可，但建議取15支分3個(gè)濾筒（貴重藥品和抗生素品種可靈活掌握，但不能低于最少量）。l對(duì)檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量的把握應(yīng)考慮便于實(shí)際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器，檢驗(yàn)數(shù)量大于藥典規(guī)定的6個(gè)，但檢驗(yàn)量似乎不符合藥典規(guī)定的每袋

14、樣品取半量檢驗(yàn)的規(guī)定，僅為1/3，但根據(jù)藥典檢驗(yàn)量即為一次試驗(yàn)所用供試品總量（g或ml）的解釋，這與先將6袋分配兩個(gè)濾筒，再將剩下3袋抽入一個(gè)濾筒作為樣定對(duì)照的方法一樣，卻更節(jié)省時(shí)間。（中檢所講義）l有些廠家提供的驗(yàn)證資料中，對(duì)非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml/次*10次/膜，增加了出現(xiàn)誤差的機(jī)會(huì)。l1. 對(duì)膜的損傷l2. 檢驗(yàn)方法繁瑣，大大增加檢驗(yàn)人員的工作量（檢驗(yàn)要按照已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行）l3. 驗(yàn)證試驗(yàn)方法選擇總的原則是由易到難l沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。l對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過濾，以減少膜的吸附, 減

15、少?zèng)_洗量。如：抗生素品種取規(guī)定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無菌容器中，然后再過濾。l對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的注射用無菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻。l抗菌藥可以根據(jù)其抗菌譜選擇敏感菌先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找到合適的條件再進(jìn)行其他菌的實(shí)驗(yàn)。l采用開放式薄膜過濾器：濾膜分成幾份與取樣量、沖洗條件的選擇有關(guān)，建議盡量與無菌檢查法一致（最常見為3等分）。l如：某產(chǎn)品驗(yàn)證資料內(nèi)容“將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)集中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒中”。l驗(yàn)證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查

16、”，方法確立后，以后該產(chǎn)品就可以采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)。l修訂：應(yīng)記錄取樣量、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所36l規(guī)格：100ml:吡20g與氯0.9gl1. 方法選擇：薄膜過濾法l2. 確定檢品取樣量（講義中按上市抽驗(yàn)品種的檢驗(yàn)數(shù)量為例）l規(guī)定：每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少樣品量：半量，最少檢驗(yàn)數(shù)量：6l確定：每菌（6*1/2）瓶l 3聯(lián)過濾器9瓶、2聯(lián)過濾器6瓶l3. 實(shí)驗(yàn)條件選擇 沖洗：無 菌名 代數(shù) 稀釋級(jí) 計(jì)數(shù)結(jié)果銅綠假單胞菌 3 10-6 85枯草芽孢桿菌 3 10-7 65金黃色葡萄球菌 3 10-6 92生孢梭菌 3 10-6 75白色念

17、珠菌 3 10-6 67黑曲霉菌 3 10-4 55結(jié)果觀察12345金葡陽性對(duì)照+供試品+綠膿陽性對(duì)照+供試品+生孢陽性對(duì)照+供試品+枯草陽性對(duì)照+供試品+白念陽性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽性對(duì)照-+供試品-+l說明本品在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不計(jì)。l本品可以采用薄膜過濾法（不沖洗）進(jìn)行無菌檢查。陽性對(duì)照菌選用金黃色葡萄球菌。l規(guī)格：5ml:1gl確定樣品量：根據(jù)供試品的規(guī)格和檢驗(yàn)?zāi)康膌每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少樣品量：2mll最少檢驗(yàn)數(shù)量：10l每菌（10*2ml）（建議全部?jī)?nèi)容物濾過）l3聯(lián)過濾器15支、2聯(lián)過濾器10支l方法選擇：薄膜過濾法l沖洗：無（或稍加沖洗）結(jié)

18、果觀察12345金葡陽性對(duì)照+供試品+綠膿陽性對(duì)照+供試品+生孢陽性對(duì)照+供試品+枯草陽性對(duì)照+供試品-+白念陽性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽性對(duì)照-+供試品-+l說明本品在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不計(jì)。l本品可以采用薄膜過濾法（不沖洗）進(jìn)行無菌檢查。陽性對(duì)照菌選用金黃色葡萄球菌。l我們進(jìn)行的其他廠家的維生素C注射液（2ml:1g）存在抑菌作用。l規(guī)格：20mgl取樣量：每菌 10 瓶l 3聯(lián)過濾器30瓶l 2聯(lián)過濾器20瓶l沖洗：無12345d金葡陽性對(duì)照+供試品+銅綠陽性對(duì)照+供試品+生孢陽性對(duì)照+供試品-枯草陽性對(duì)照+供試品+白念陽性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽性對(duì)照-+供試品

19、-+l說明本品在該檢驗(yàn)條件下對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用。l需采用進(jìn)一步處理（加大沖洗量）以消除抑菌性其他菌可以不做：沖洗：200ml/膜（100ml*2)結(jié)果：12345d陽性對(duì)照+供試品+l說明本品在該檢驗(yàn)條件下抑菌作用可以消除。l本品可以采用薄膜過濾法（細(xì)菌沖洗200ml/膜）進(jìn)行無菌檢查。敏感菌株為枯草芽孢桿菌。l眼用液體制劑：制劑通則中規(guī)定，眼用液體制劑微生物限度檢查法為“除另有規(guī)定外，按薄膜過濾法或直接接種法檢查，至少從2支供試品抽取規(guī)定量（每種培養(yǎng)基各接種2支，每支1ml），直接或處理后接種于硫乙醇流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7天，不得有菌生長(zhǎng)。若有菌生長(zhǎng)，應(yīng)重新取2倍量供試品

20、，分別依法復(fù)試，各管均不得有菌生長(zhǎng)?！眑眼用液體制劑微生物限度檢查的方法驗(yàn)證同無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證。l一、附錄 90 頁，無菌檢查法中的 “ 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” 修訂為 “ 大腸埃希菌 ( Escherichia coli ) CMCC(B) 44 102 ” ； “ 銅綠假單胞菌 ” 修訂為 “ 大腸埃希菌 ” l二、附錄 90 頁，靈敏度檢查 菌液制備 第 10 行 “ （用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)管） ” 訂正為 “ （用管口塞有適度疏松的無菌棉花或管口外包扎無菌紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)管）

21、 ”n三、附錄 90 頁，方法驗(yàn)證試驗(yàn) n1 第 1 5 行 n“ 當(dāng)建立藥品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若該藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。n驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作，對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 ” l增修訂為l l供試品的無菌檢查應(yīng)采用驗(yàn)證的方法，無菌檢查 方法 的驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的無菌檢查方法和檢驗(yàn)條件下無抑菌作用 , 以保證所污染的微生物能充分檢出。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。 l驗(yàn)證時(shí)，按 “ 供試品無菌檢查 ” 的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。 l方法 驗(yàn)

22、證試驗(yàn)的試驗(yàn)菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、 生孢梭菌 、白色念珠菌和黑曲霉。上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)試驗(yàn)菌至少應(yīng)選用金黃色葡萄球菌（ 抗革蘭陰性菌為主的供試品 選用大腸埃希菌）、 生孢梭菌 和白色念珠菌。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。l2 薄膜過濾法 第 1 行 “ 將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾， ” l訂正為 “ 取每種培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量按薄膜過濾法過濾， ” l3 直接接種法 第 5 行 “ 。其中 1 管接入規(guī)定量的供試品， ” l訂正為 “ 。其中 1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品， ” l四、附錄 91 頁，供試品的無菌檢查 l陽性對(duì)照 第 6 行 刪除

23、 “ （ 大腸 埃希 菌 的 菌液制備 同 培養(yǎng)基的靈敏度檢查中的金黃色葡萄球菌 ） ” l五、附錄 91 頁，薄膜過濾法 l水溶液供試品 第 6 行 “ ，取出濾膜，將其剪成 3 等份， ” l訂正為 “ ，取出濾膜，將其分成 3 等份， ” l六、附錄 93 頁，表 2 l第 9 行 “100V 500 ” 訂正為 “100V 500 ” l第 10 行 “V 500 ” 訂正為 “ V 500 ” l附錄 68 頁，無菌檢查法中的“銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” l修訂為“大腸埃希菌 (Escherichia coli)

24、CMCC(B) 44 102 ”；“銅綠假單胞菌”修訂為“大腸埃希菌” l附錄 68 頁，靈敏度檢查 l菌液制備 第 10 行 “（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)管）”訂正為“（用管口塞有適度疏松的無菌棉花或管口外包扎無菌紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)管）” n附錄 68 頁，方法驗(yàn)證試驗(yàn) n1 、 第 1 5 行 n當(dāng)建立藥品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。n驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作，對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 ” l增修訂為 l“供試品的無菌檢查應(yīng)

25、采用驗(yàn)證的方法，無菌檢查方法的驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的無菌檢查方法和檢驗(yàn)條件下無抑菌作用 , 以保證所污染的微生物能充分檢出。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按“供試品無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。 l方法驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)的試驗(yàn)菌至少應(yīng)選用金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證?！?l2 、薄膜過濾法 第 1 行 “將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，” l訂正為“取每種培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量按薄膜過濾法過濾，” l3 、 直接接

26、種法 第 5 行 “。其中 1 管接入規(guī)定量的供試品，” l訂正為“。其中 1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品，” l附錄 69 頁，薄膜過濾法 l水溶液供試品 第 6 行“，取出濾膜，將其剪成 3 等份， ” l訂正為“，取出濾膜，將其分成 3 等份， ” 附錄 69 頁 直接接種法 l刪除“一次性使用含藥產(chǎn)品供試品 取規(guī)定量，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中?！?l l附錄 70 頁，表 2 l第 9 行 “ 100 V 500 ” 訂正為“ 100 V 500 ” l第 10 行 “ V 500 ” 訂正為“ V 500 ” l附錄 70 頁，表 3 l刪除 第 7 行“一次性使用含

27、藥產(chǎn)品 10 ” l為了進(jìn)一步理順方法驗(yàn)證和目前監(jiān)督抽驗(yàn)工作的關(guān)系，討論認(rèn)為應(yīng)對(duì)以建立科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法為目的的方法驗(yàn)證試驗(yàn)和對(duì)監(jiān)督抽驗(yàn)工作中所采用抽驗(yàn)方法的有效性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)加以區(qū)分，具體有如下三點(diǎn)：l1. 對(duì)于注冊(cè)檢驗(yàn)，如果沒有合理的檢驗(yàn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按照藥典要求，通過完整的驗(yàn)證試驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法及SOP，所建立的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)確定具體的實(shí)驗(yàn)方法，如無菌檢查中的薄膜過濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過濾法。標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，如無菌檢查薄膜過濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（0.5ml/皿、0.2ml/皿應(yīng)注明）。對(duì)有抗菌作用的樣品應(yīng)通過驗(yàn)

28、證試驗(yàn)確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗(yàn)方法時(shí)進(jìn)行方法的確認(rèn)使用。l2. 對(duì)注冊(cè)檢驗(yàn)中已有驗(yàn)證資料的方法進(jìn)行復(fù)核時(shí)，應(yīng)根據(jù)企業(yè)提供材料的情況，結(jié)合藥檢所掌握的情況，通過分析判斷、適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證等，保證驗(yàn)證資料中檢驗(yàn)方法的合理、可靠和科學(xué)。l3. 對(duì)于目前比較突出的已上市品種的監(jiān)督抽驗(yàn)問題，原則上應(yīng)向被抽驗(yàn)品種的生產(chǎn)單位索取方法驗(yàn)證資料，如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對(duì)照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法。如果沒有及時(shí)獲得驗(yàn)證資料，或者驗(yàn)證資料中沒有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)，其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法，一般細(xì)菌選擇枯草芽

29、孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所65概述微生物檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見的問題l1.概述l2.樣品前處理方法及驗(yàn)證l3.菌落計(jì)數(shù)方法及驗(yàn)證l4.控制菌檢查方法驗(yàn)證l5.總結(jié)并舉例l微生物限度檢查法驗(yàn)證的目的：確認(rèn)所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。l驗(yàn)證的內(nèi)容：包括準(zhǔn)確性(回收率)、專屬性。l驗(yàn)證的類型：前驗(yàn)證(建立微生物限度檢查法時(shí)的驗(yàn)證)和再驗(yàn)證(修訂檢驗(yàn)方法后、供試品組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)、定期的方法驗(yàn)證)。l根據(jù)檢查方法的不同分為： 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方

30、法的驗(yàn)證和控制菌檢查法的驗(yàn)證。l驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。l某些供試品含有抗微生物物質(zhì)，使供試品中的活微生物的生長(zhǎng)被抑制，不能按常規(guī)方法檢驗(yàn)，必須以適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛞种乒┰嚻分锌刮⑸镂镔|(zhì)的活性后，活微生物才能生長(zhǎng)，得以檢出。通過消除或抑制供試品中抗微生物物質(zhì)的活性來檢測(cè)微生物的方法，應(yīng)通過驗(yàn)證，以確定所用檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果的可信度。l驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。l前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證的范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)

31、疑問應(yīng)進(jìn)一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)重點(diǎn)l稀釋法降低供試品的相對(duì)濃度l薄膜法利用體積差異分離l中和法利用化學(xué)（生物）專屬性滅活l離心法利用沉降系數(shù)差異分離 各方法組合運(yùn)用，會(huì)達(dá)到更好效果！各方法組合運(yùn)用，會(huì)達(dá)到更好效果！l樣品：首先應(yīng)是合格的樣品。本底微生物太多可以先滅活，但不應(yīng)因此影響藥效。l注意 針對(duì)抽驗(yàn)品種本底微生物太高情況，如我們沒條件進(jìn)行滅活處理，可對(duì)檢品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行驗(yàn)證。（經(jīng)請(qǐng)示專業(yè)委員會(huì)認(rèn)可） 指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10g 或 10ml; 化學(xué)藥膜劑為100cm2。l貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。l檢查

32、沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g或10ml。l驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行。 l制劑形式多樣，決定前處理各異 液體供試品固體、半固體或粘稠液體供試品非水溶性供試品其他l取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。l油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。l可溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。l取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它有效方法混勻，作為供試液。(常規(guī)方法）l必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。 l方法

33、一 2000版已有方法 （乳化法）l方法二2005版新增方法 （萃取法）l軟膏、乳膏劑 先將已備妥滅菌的含司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的混合物融化，待冷至45時(shí)，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。l油劑 取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯80 58ml，搖勻，再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。 l栓劑 稱取供試品10g，加適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯80 5

34、8ml，振搖使之乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻。 l眼膏劑 取供試品10g，加至20ml無菌十四烷酸異丙酯，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510min，靜置，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。 l非水溶性膜劑 化學(xué)藥膜劑一般取樣量為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于45水浴保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（通常1 cm2加1ml或2ml），浸泡，振搖

35、，以供試品浸液作為供試液。 l取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。 l取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h，取出，速消毒供試品容器的開啟部位周圍，用無菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。 l取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖23m

36、in，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。l以上供試品如吸水膨脹，或黏度過高，可增加稀釋級(jí)的量，制成1：201：100供試液l制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無抗菌作用。l目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！ l在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。l細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌株： 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌l霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 白色念珠菌、黑曲霉l取

37、培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含 50100cfu/ml的菌液。 l驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率。l1)試驗(yàn)組l2)菌液組l3)稀釋劑對(duì)照組l4)供試品對(duì)照組l平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。l測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)l若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)

38、照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。l取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。l試驗(yàn)組的菌回收率 l稀釋劑對(duì)照組的菌回收率 l在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)均不低于70%。l若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，按此該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。l若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性

39、，并重新驗(yàn)證。l供試液的常規(guī)制備方法： 10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml, 制成1：10供試液l試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l供試品對(duì)照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按常規(guī)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。

40、若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 l取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。l1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿。l培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。l在采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸l實(shí)驗(yàn)組（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。l10g(ml)樣品加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml, 制成1：10供試液l供試液制備方法為常規(guī)法，無需進(jìn)行稀釋劑對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)l試驗(yàn)組：1m

41、l 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿，每皿各加1ml 菌液。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（A）l供試品組（本底組）：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（B）l菌液組：每皿加入1ml菌液，平行2皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（C）l回收率：（A-B）/C*100l計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定供試品的細(xì)菌數(shù)（或霉菌及酵母菌數(shù)）。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法，如薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。l1：10供試液的制備：10g樣品加pH

42、 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，低速離心（500rpm離5分鐘）去渣，取上清10ml高速離心（3000rpm離20分鐘），離心后不要震搖離心管（一般用10 ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8 ml棄去，再加 8 ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。l試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l供試品對(duì)照組：取1：10供試液1m

43、l注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。 取含菌稀釋液（含菌濃度為50100cfu /ml）代替供試品，經(jīng)過低速離心后轉(zhuǎn)移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層8ml液體，再加 8 ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。取此液體1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。 要保證稀釋劑對(duì)照組的操作過程與實(shí)驗(yàn)組完全相同！l操作過程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。l某些沉降系數(shù)低的細(xì)菌可能被漏檢，而驗(yàn)證試驗(yàn)無法對(duì)其驗(yàn)證。l對(duì)某些抑菌性不強(qiáng)的樣品建議采用培養(yǎng)基稀釋法。l供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試

44、品，相當(dāng)于供試品1g或1ml，如1：10供試液取10ml, 過濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。l試驗(yàn)組：過濾量，沖洗量同供試品對(duì)照組，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。l菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。l稀釋劑對(duì)照組：稀釋液+1ml菌液混勻，過濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗(yàn)組） ，取出濾膜，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。 l如回收率仍達(dá)不到70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說的每次沖洗100ml。l可將待過濾的樣品稀

45、釋至大量稀釋液中（如: 500ml, 多少量需在驗(yàn)證資料中注明）再進(jìn)行過濾，這樣可以減少膜對(duì)樣品抑菌成分的吸附。l沖洗速度不易過快，沖洗量不易過大。l可與離心沉淀集菌法，中和法等方法聯(lián)用。 l-內(nèi)酰胺類抗生素 -內(nèi)酰胺酶l奎諾酮類抗生素 0.1mol/L MnSO4 l當(dāng)最低稀釋級(jí)的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗(yàn)菌的回收率還無法達(dá)到計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求時(shí)，根據(jù)供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，可采用高一稀釋級(jí)的供試液重新進(jìn)行回收率的測(cè)定。若試驗(yàn)菌的回收率符合計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求，那么，進(jìn)行供試品細(xì)菌計(jì)數(shù)或霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試

46、液作為最低稀釋級(jí)的供試液 （中國(guó)藥典2006 增補(bǔ)本擬增訂內(nèi)容）l樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證 l按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌梭菌檢查用生孢梭菌。l菌種的要求：不得超過5代。l菌液制備為10100cfu/ml。l取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。l當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。l 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了

47、驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組。l陰性對(duì)照菌不得檢出。 控制菌陰性對(duì)照菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸菌群沙門菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌梭菌l 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。l驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行l(wèi)試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml及10100cfu大腸埃希菌加入乳糖膽鹽發(fā)酵管，361培養(yǎng)1824h。l陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液1ml及10100cfu

48、金黃色葡萄球菌加入乳糖膽鹽發(fā)酵管，361培養(yǎng)1824h。l大腸菌群在乳糖膽鹽發(fā)酵管中生長(zhǎng)，表現(xiàn)為產(chǎn)酸產(chǎn)氣。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，一般由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)氣可在倒管中出現(xiàn)氣泡。l如果陰性菌對(duì)照組發(fā)酵管未見產(chǎn)酸產(chǎn)氣，試驗(yàn)組發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，按此法進(jìn)行供試品的大腸菌群檢查。l進(jìn)行大腸菌群檢查時(shí)，應(yīng)取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1：10供試液1ml，1:100供試液1ml，1：1000供試液1ml。而在進(jìn)行大腸菌群檢查法的驗(yàn)證時(shí)，無需對(duì)此3管的檢查一一驗(yàn)證，只驗(yàn)證加最低稀釋級(jí)供試液的發(fā)酵管的檢查即可。檢查實(shí)驗(yàn)過程中的陽性對(duì)照也只需加在加1：10供試液的發(fā)酵管中。l大腸菌群檢查為半定量試驗(yàn)，一般不建議使

49、用離心沉淀集菌法。1.常規(guī)法l實(shí)驗(yàn)組：取1：10供試液10ml及10100cfu生孢梭菌加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取0.2ml培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。l陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液10ml及10100cfu大腸埃希菌加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取0.2ml培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。l 實(shí)驗(yàn)組：取1：10供試液10ml薄膜過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入10100cfu生孢梭菌，取出濾膜加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基中，厭氧

50、條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取0.2ml培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。l陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液10ml薄膜過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入10100cfu大腸埃希菌，取出濾膜加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取0.2ml培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。l如陰性菌對(duì)照組培養(yǎng)管未出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象同時(shí)試驗(yàn)組培養(yǎng)管產(chǎn)生渾濁，可不進(jìn)行選擇性瓊脂培養(yǎng)直接判斷可用此供試液制備及梭菌檢查方法進(jìn)行本供試品的梭菌檢查 l當(dāng)陰性對(duì)照組選擇性平板上無菌落生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組選擇性平板上有菌落生長(zhǎng)時(shí)，可

51、判斷可用此供試液制備及梭菌檢查方法進(jìn)行本供試品的梭菌檢查。l在進(jìn)行梭菌檢查實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取供試液10ml 2份，其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)組，只做一份即可。如果2份供試液培養(yǎng)管在培養(yǎng)92h內(nèi)均無渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌。第一步：常規(guī)法第二步：培養(yǎng)基稀釋法第三步：薄膜過濾法在計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)先用常規(guī)法對(duì)5種實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果某個(gè)或某些菌的回收率達(dá)不到70%，繼續(xù)用它驗(yàn)證下一步的實(shí)驗(yàn)方法。直到它的回收率達(dá)到70%以上。這時(shí)再用5種菌進(jìn)行平行試驗(yàn)。l各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌

52、種的優(yōu)良性狀長(zhǎng)期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。 l 斜面低溫保藏法l 石蠟油封藏法l 砂土管保藏法l 麩皮保藏法l 甘油懸液保藏法l 冷凍真空干燥保藏法l 液氮超低溫保藏法l將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。l此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕， 加硅膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。l此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一

53、般可保存12年左右。l又稱冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即熔封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保藏。l此法適用于各大類微生物。l此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑， 保藏期一般長(zhǎng)達(dá)515年，存活率高，變異率低，是目前 被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。l該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè) 備。l簡(jiǎn)稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（1

54、96）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。l此法適用于各種微生物菌種的保藏。l此法的主要保藏措施是超低溫、有保護(hù)劑，保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長(zhǎng)期保藏技術(shù)之一。l此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。其缺點(diǎn)是需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。菌種培養(yǎng)基保存條件及時(shí)間大腸埃希菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月枯草芽孢桿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存3 6個(gè)月銅綠假單胞

55、菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基室溫沙門菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月生孢梭菌硫乙醇酸鹽培基46 保存6個(gè)月以上白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基4 6 保存4 6個(gè)月黑曲霉改良馬丁培養(yǎng)基4 6 保存4 個(gè)月2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所139 2006.11 2006.11l概述l方法的建立與驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)l驗(yàn)證中常見的問題l附：中外藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法收載 及修訂情況 自20世紀(jì)60年代鱟血凝集機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和鱟實(shí)驗(yàn)方法的建立以來，引起了各國(guó)藥政管理部門的極大興趣，并使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。尤其是與家兔熱原法相比，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有勞動(dòng)強(qiáng)度低，實(shí)驗(yàn)成本小等特點(diǎn)，還可以通過

56、對(duì)原料、活性成分、滅菌水、容器、賦形劑和終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，對(duì)生產(chǎn)過程進(jìn)行質(zhì)控，更明顯的特點(diǎn)是可以定量檢測(cè)藥品生產(chǎn)過程中可能污染的痕量?jī)?nèi)毒素，并且為區(qū)分干擾作用與內(nèi)毒素污染提供了極為重要的技術(shù)手段。 1 細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 注射給藥過程中，偶爾會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、惡心、注射給藥過程中，偶爾會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的甚至昏迷、死亡，將這種藥物的不嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的甚至昏迷、死亡，將這種藥物的不良反應(yīng)稱之為熱原反應(yīng)，能引起上述熱原反應(yīng)的物質(zhì)被良反應(yīng)稱之為熱原反應(yīng)，能引起上述熱原反應(yīng)的物質(zhì)被稱之為熱原（稱之為熱原（Pyrogen）。）。 熱原與

57、內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但目前認(rèn)為，熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但目前認(rèn)為，在在GMP的條件下，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無的條件下，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制細(xì)菌內(nèi)毒素就控制熱原物質(zhì)。內(nèi)毒素就無熱原，控制細(xì)菌內(nèi)毒素就控制熱原物質(zhì)。 這也正是鱟試劑用于藥物生產(chǎn)過程或藥物成品熱原檢測(cè)這也正是鱟試劑用于藥物生產(chǎn)過程或藥物成品熱原檢測(cè)的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。 l過去一直認(rèn)為細(xì)菌內(nèi)毒素來源于革蘭陰性細(xì)菌，但最近發(fā)現(xiàn)存在革蘭陰性菌來源的不具有內(nèi)毒素毒性的革蘭陰性細(xì)菌脂多糖（LPS）結(jié)構(gòu)。因此，目前認(rèn)為所有內(nèi)毒素均為脂多糖，但非所有的脂多糖均為內(nèi)毒素。l參與鱟血細(xì)胞凝集

58、的成分是細(xì)菌內(nèi)毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。lG因子激活的鱟試劑激活旁路，鱟試劑中的G因子可以被真菌、酵母和藻類細(xì)胞壁中另一類細(xì)菌多糖-（1，3）-D-葡聚糖激活，因此鱟試劑同內(nèi)毒素的反應(yīng)不是特異的。LPS不能激活G因子旁路。l但是，鱟試劑同葡聚糖的反應(yīng)與鱟試劑同內(nèi)毒素的反應(yīng)敏感性是不一致的。有實(shí)驗(yàn)表明不同的鱟試劑在檢測(cè)葡聚糖和內(nèi)毒素上存在很大的差異，鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)更靈敏。 l盡管與鱟試劑反應(yīng)的物質(zhì)不完全是內(nèi)毒素， 但目前作為鱟實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的兩個(gè)原則仍是：1、內(nèi)毒素活性與熱原性相關(guān)，家兔和鱟實(shí)驗(yàn)作為人類發(fā)熱和炎癥反應(yīng)的預(yù)測(cè)方法是相關(guān)的。2、在注射劑GMP生產(chǎn)環(huán)境下，不存

59、在內(nèi)毒素也就意味著不存在主要的熱原物質(zhì)。盡管 存在少數(shù)例外，但依然可以使用。C因子因子活化的活化的C因子因子內(nèi)毒素內(nèi)毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原凝固蛋白原(1,3)(1,3)-D-葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子（旁路反應(yīng)）（旁路反應(yīng)）G因子因子抗LPS因子 復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程l1.0IU=1.0EUl我國(guó)內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品無論是在賦形劑的選擇，還是標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)和方法的使用上均與國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)品取得了一致。 l隨著鱟試劑反應(yīng)的進(jìn)行，凝固蛋白不斷增加，伴隨凝聚的形成，光密度也會(huì)增加。l內(nèi)毒素

60、的濃度決定了光密度增加的速率。l凝膠形成反應(yīng)呈S型曲線（分為初期的平臺(tái)期、快速增長(zhǎng)期和后期的平臺(tái)期）。l這些特性構(gòu)成了各種檢測(cè)方法的理論基礎(chǔ)。l2000年版藥典內(nèi)毒素檢查品種增加至69種，檢測(cè)方法也由單一的凝膠法增加了定量檢測(cè)法。l2005年版藥典不但增加了112種檢查品種，并且對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了全面的修訂，使之與美國(guó)、歐盟和日本三方協(xié)調(diào)統(tǒng)一的方法趨于一致。l國(guó)家SFDA正組織相關(guān)專業(yè)組對(duì)2005年版藥典部分進(jìn)行熱原檢查的品種開展細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究。 l在方法學(xué)上，試管凝膠法已成為內(nèi)毒素檢查法的經(jīng)典方法，并被普遍使用。但是凝膠法仍然存在著不能定量等缺點(diǎn)，于是隨著光電子和計(jì)算機(jī)領(lǐng)域的