淺論As2O3 Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒的制備及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、淺論As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒的制備及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的： 通過制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒來研究熱化療對(duì)乳腺癌的治療效果。方法： 采用改良的化學(xué)沉淀浸漬法制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒,通過透射電鏡、掃描電鏡、能譜儀、原子熒光光譜儀來表征;檢測(cè)As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒的釋藥水平及在交變磁場(chǎng)中的升溫能力;通過MTT比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)化療組

2、、熱療組及熱化療組乳腺癌的治療效果。結(jié)果： 制備的復(fù)合納米粒粒徑為2040nm;復(fù)合納米粒體外升溫能達(dá)到腫瘤的有效治療溫度(4146 );釋藥緩慢,48 h釋藥為14.67%。結(jié)論： 采用改良的化學(xué)沉淀浸漬法可以成功制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒,體外實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合納米粒聯(lián)合交變磁場(chǎng)熱療對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。 【關(guān)鍵詞】  As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4; 納米; 熱化療; 乳腺癌惡性腫瘤的診斷和治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域試圖攻克的難題,隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展,人們對(duì)腫瘤治療新型方法的研究已經(jīng)向分子和原子水平邁進(jìn)。1996年,德國(guó)

3、學(xué)者Jordan等1 發(fā)現(xiàn)納米級(jí)磁微粒比微米級(jí)微粒能產(chǎn)生As2O3、二甲基亞砜(DMSO, Sigma公司);HEPES、胰酶、噻唑藍(lán)(Amresco);硫酸錳、硫酸鋅和硫酸亞鐵等均為分析純;DMEM(Gibco Brl, 美國(guó));胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);能譜儀(Noran, Vantage,美國(guó));H600透射電鏡(Hitachi,日本);掃描電鏡(JEOLJSM6360LV,日本);酶標(biāo)儀(美國(guó)BD公司);流式細(xì)胞儀(FACS Vantage SE, BectonDickson,美國(guó));原子熒光光譜儀(北京瑞利分析儀器公司); MDAMB231(購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。

4、     2 方 法采用改良的化學(xué)沉淀-浸漬法制備復(fù)合納米粒,按Mn2+、Zn2+、Fe2+摩爾比114準(zhǔn)確稱量適量MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O和FeSO4·7H2O33種硫酸鹽,研成粉末后將適量NaOH溶液加入其中,磁力攪拌器高速攪拌3 h后放入80 烤箱干燥,馬弗爐400 焙燒1 h,自然冷卻后用熱蒸餾水浸洗去除可溶性硫酸鈉無機(jī)鹽,烘干成錳鋅鐵氧體粉末,配制亞砷酸溶液使As2O3濃度為0.01 mg·ml-1、0.02 mg·ml-1、0.03 mg·ml-1、0.04 mg&#

5、183;ml-1,稱取適量錳鋅鐵氧體粉末浸漬于其中,離心烤干。2.2.1 形態(tài)觀察 取出少量制備的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒,加入無水乙醇超聲分散20min后滴銅網(wǎng),在透射電鏡下觀察形態(tài),取少量粉末在掃描電鏡下觀察。2.2.2 能譜儀測(cè)定復(fù)合納米粒的成分 掃描電鏡下對(duì)制備的復(fù)合納米粒成分進(jìn)行能譜分析,確定其元素組成成分。2.2.3 磁響應(yīng)性檢測(cè) 用適量生理鹽水將復(fù)合納米粒配成混懸液,在燒杯下放置一磁鐵觀察磁性材料聚集情況。2.2.4 含砷量測(cè)定 用原子熒光光譜儀測(cè)定其含砷量。2.3 升溫試驗(yàn)將復(fù)合納米粒用生理鹽水配成6、8、10、12 g·L-1的磁流體,

6、置于頻率為200 kHz、輸出電流300 A的交變磁場(chǎng)下進(jìn)行升溫試驗(yàn),每5 min記錄1次溫度。2.4 釋藥試驗(yàn)用生理鹽水配成10 g·L-1的混懸液,取10 ml裝于透析袋中,外面透析介質(zhì)亦為生理鹽水,磁力攪拌器常溫?cái)嚢? 0 h,每隔1 h取液測(cè)量釋放液中As含量,繪制累積釋藥曲線。2.5 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株MDAMB231常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37 、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2.6 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDAMB231細(xì)胞,消化吹打成2.5×104 ml-1,在兩塊96孔培養(yǎng)板中每孔接種200 l(每板兩組

7、,每組8個(gè)復(fù)孔)，置于37 、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h細(xì)胞貼壁后一塊培養(yǎng)板分別加入DMEM培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)、5 mol·L-1As2O3溶液培養(yǎng)(化療組),另一塊培養(yǎng)板分別加入10 g·L-1的Mn0.5Zn0.5Fe2O4培養(yǎng)液(熱療組)及As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒培養(yǎng)液(熱化療組)，置于200 kHz、4 kW、輸出電流300 A的交變磁場(chǎng)加熱1 h繼續(xù)培養(yǎng),48h后加入MTT20 l,4 h后棄去液體,每孔加入150 lDMSO,置于酶標(biāo)儀上振蕩混勻10 min測(cè)OD493 nm值,細(xì)胞增殖抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。2

8、.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡率按上述分組將治療48 h后細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,PBS洗滌細(xì)胞兩次,70%乙醇4 固定細(xì)胞24 h以上。檢測(cè)前用PBS洗滌細(xì)胞兩次,細(xì)胞重懸于0.5 mlPI染色液(20 g·ml-1,0.25 mg·ml-1RNase A)中,室溫避光染色30 min,用300目絲網(wǎng)過濾后即可上機(jī)分析。3 結(jié) 果3.1 表征采用化學(xué)沉淀-浸漬法制備的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米材料為棕褐色粉末,在外磁場(chǎng)作用下具有良好的磁響應(yīng)性,能夠形成明顯的磁力線。用透射電鏡和掃描電鏡觀察,As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒近似球形,密度較

9、高,粒徑在2040 nm(圖1),掃描電鏡下任選一視野進(jìn)行能譜分析,均能檢測(cè)到錳、鐵、鋅、砷等材料成分(圖2)。用原子熒光分光光度計(jì)測(cè)定的As標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為：I=3.737+13.097C,r=0.999 5,其中I為分析信號(hào)峰面積,C為As濃度,經(jīng)測(cè)定復(fù)合材料中含砷量為0.05%。3.2 升溫情況不同濃度的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒在體外交變磁場(chǎng)作用下具有升溫能力,在前30 min升溫迅速,3045 min升溫平緩,之后溫度基本保持恒定不變,且10 g·L-1濃度的復(fù)合納米粒升溫能達(dá)到腫瘤治療的有效溫度(4146)(圖3)。3.3 體外釋藥速率的動(dòng)態(tài)測(cè)定

10、結(jié)果以生理鹽水為介質(zhì)考察了As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米材料的體外動(dòng)態(tài)釋放,計(jì)算其累積釋放率,48 h釋藥為14.67%,曲線平緩(圖4)。3.4 MTT比色法檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒聯(lián)合交變磁場(chǎng)加熱組能顯著抑制細(xì)胞增殖,且比單純As2O3溶液組和Mn0.5Zn0.5Fe2O4聯(lián)合交變磁場(chǎng)加熱組的抑制作用明顯(表1)。表1 As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒聯(lián)合熱化療組可出現(xiàn)DNA含量明顯低于G1期的亞G1期細(xì)胞峰,即凋亡峰(凋亡率為31.18%),顯著高于化療組(凋亡率為7.44%)和熱療組(凋亡率為16.17

11、%),而陰性對(duì)照組則幾乎無凋亡峰(圖5)。         4 討 論砷及其化合物是人類最早用于治療腫瘤的藥物,目前As2O3注射液已作為國(guó)家二類新藥正式上市,國(guó)內(nèi)外研究其對(duì)實(shí)體瘤的作用,如乳腺癌 、肺癌、食管癌、胃癌,確認(rèn)了其廣譜抗癌性,其機(jī)制主要是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)其凋亡,多途徑抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移且毒副作用小,對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響。而腫瘤熱療是用加熱方式治療腫瘤的一種新方法,即利用物理能量在組織中沉淀而產(chǎn)生熱效應(yīng),使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度(4146 )以殺死癌細(xì)胞,又不損傷正常細(xì)胞的新型治療方法,熱療

12、不僅沒有化療及放療的副作用,而且可以克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性,大大增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來,許多研究者將砷與熱療通過不同的形式聯(lián)合起來治療惡性腫瘤,取得了顯著的成果,如邢寶玲等將As2O3和自行研制的納米錳鋅鐵氧體磁性材料一起用脂質(zhì)膜包裹起來制成As2O3磁性納米脂質(zhì)體,體外抗卵巢癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,將As2O3與熱療聯(lián)合起來對(duì)癌細(xì)胞的毒殺作用強(qiáng)于單純的As2O3組和熱療組。倪海燕等通過乳化冷凍凝聚法制備了As2O3磁性納米微球,并通過治療宮頸癌證明了As2O3聯(lián)合熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用明顯。本研究中通過制備As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米

13、粒并作用于乳腺癌細(xì)胞,我們探討了將As2O3的細(xì)胞毒作用同磁熱療相結(jié)合,以期尋求一個(gè)更有效地殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的方法。As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒是采用改良的化學(xué)沉淀-浸漬法10制備的,這種方法的優(yōu)點(diǎn)是合成工藝簡(jiǎn)單,成本低廉,且制備的粒徑為2040 nm,由于粒徑極小,在體內(nèi)不但可以逃脫MPS的捕獲,而且還具有很強(qiáng)的吸收電磁波能量而轉(zhuǎn)化為熱能的能力。將活性組分AS2O3溶液用浸漬法加到載體納米級(jí)錳鋅鐵氧體粉末上,由于作為載體的Mn0.5Zn0.5Fe2O4比表面極大,吸附性能優(yōu)良,能使被吸附的藥物與載體周圍的藥物之間始終保持著一種動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)游離的藥物被體液稀釋或被機(jī)體代

14、謝濃度下降時(shí),根據(jù)吸附等溫曲線的平衡曲線,制劑馬上釋放等量的藥物來補(bǔ)足被消耗的量,可以控制藥物的緩慢釋放,這不但提高了藥物療效,還可以使靶區(qū)以外的A. 陰性對(duì)照組 B. 化療組C. 熱療組 D. 熱化療組圖5 各實(shí)驗(yàn)組流式細(xì)胞分析結(jié)果Fig 5 The results of flow cytometry砷濃度大大降低,從而減輕了藥物對(duì)正常組織的毒副作用。另外復(fù)合納米粒的體外升溫實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合納米粒在交變磁場(chǎng)中具有良好的升溫控溫能力,不同濃度的復(fù)合納米粒在交變磁場(chǎng)中升溫控溫的能力有所差別,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濃度為10g·L-1的材料在交變磁場(chǎng)中能升溫至腫瘤治療的恰當(dāng)溫度45 且保持溫度不變,

15、可發(fā)揮既殺死腫瘤細(xì)胞而又不損失正常細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)中我們分為陰性對(duì)照組、化療組、熱療組及熱化療組,MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米材料聯(lián)合交變磁場(chǎng)熱療組對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性,此組的細(xì)胞生存率明顯低于化療組和熱療組。流式細(xì)胞分析亦顯示, As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米材料聯(lián)合交變磁場(chǎng)熱療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率較相應(yīng)同等濃度的單純As2O3液及單純磁性材料熱療組的細(xì)胞凋亡率要高,前者為 31.18%,而后兩者分別為 7.44%、16.17%。本實(shí)驗(yàn)成功制備了直徑為2040 nm、升溫能達(dá)到腫瘤治療有效溫度同時(shí)可控緩慢釋放藥物的A

16、s2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒,合成工藝簡(jiǎn)單、易行,成本低廉.通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),該納米粒聯(lián)合交變磁場(chǎng)熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,為治療乳腺癌提供了新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1JORDAN A,WUST P,SCHOLZ R,et al.Cellular uptake of magnetic fluid particles and their effects on human adeno carcinoma cells exposed to AC magnetic fields in vitro J.Int J Hyperthermia,19

17、96,12 (6): 705722.BAJ G,ARNULFO A,DEAGLIO S,et al.Arsenic trioxide and breast cancer: analysis of apoptosis,differentiative and immunomodutalory effects J.Breast Cancer Res Treat,2002,73(1): 6173.姚和瑞,謝德榮,向燕群,等.三氧化二砷抑制NCIH69肺癌細(xì)胞增殖的初步研究J.中國(guó)癌癥雜志,2000,10(5):428429.譚立軍,石栩慧,史桂英,等.三氧化二砷啟動(dòng)人食管癌細(xì)胞株凋亡機(jī)制研究J.上海第

18、二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,20(1):1217.ZHANG T C,CAO E H,LI J F,et al.Induction of human gastric cancer MGC803 cell growth by arsenic trioxide J.Eur J Cancer,1999,35(8):12581263.BABINCOVA M,LESZCZYNSKA D,SOURIVONG O,et al.Superaramagnetic gel as a novel material for electro magnetically induced hyperthermiaJ.Magn Mater,2001,225(1,2):109112.SUZUKI M,SAGA Y,TSUKAGOSHI S,et al.Recurrent ovarian clear cell carcinoma: complete remission after radiation in combination with hyperthermia; a c