水楊酸需要補充的實驗數(shù)據(jù)

1、煙用添加劑中對乙氧基苯脲的測定 高效液相色譜法實驗報告云南煙草科學研究院二一二年二月九日目 錄1 前言41.1 對乙氧基苯脲簡介41.2 理化性質(zhì)41.3 檢測方法綜述41.3.1 薄層色譜法41.3.2 分光光度法51.3.3 氣相色譜法51.3.4 毛細管電泳法51.3.5 液相色譜法61.4 小結(jié)72 標準適用范圍83 原理84 試驗方法84.1 儀器84.2 試劑與材料84.3 試樣前處理94.4 高效液相色譜條件104.5 標準曲線制作104.6 試樣測定結(jié)果115 結(jié)果與討論115.1 色譜條件的選擇115.1.1 檢測器及波長的選擇125.1.2 色譜柱的選擇165.1.3 流動

2、相的選擇195.1.4 其它色譜條件的選擇225.2 前處理步驟的選擇及優(yōu)化225.2.1 空白試驗225.2.2 樣品提取溶劑選擇225.2.3 凈化步驟的選擇235.2.4 固相萃取條件選擇及優(yōu)化245.2.5 凈化過程的回收率考察255.2.6 其它前處理條件的選擇255.3 方法評價275.3.1 檢出限和定量限275.3.2 精密度285.3.3重復(fù)性285.3.4 儲備液穩(wěn)定性305.3.5 試樣穩(wěn)定性305.3.6 試樣加標回收率315.3.7 比對試驗結(jié)果325.3.8 試樣測定33參考文獻34附件一 方法的檢出限及定量限36附件二 試樣中對乙氧基苯脲定性確認方法391前言1.

3、1對乙氧基苯脲簡介對乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenyl-urea），俗名甘素（dulcin），亦稱甘精，是一種人工合成甜味劑，甜度大約是蔗糖的250倍，1884年被Joseph Berlinerbau發(fā)現(xiàn)。由于其與糖精鈉相比沒有后苦味，7年以后作為人工合成甜味劑進行大批量生產(chǎn)，在20世紀初占有很大的市場，作為糖尿病患者的代糖。1951年美國FDA對對乙氧基苯脲的安全性提出了質(zhì)疑，1954年經(jīng)過多次的動物實驗證明了其能夠水解成氨基苯酚而引發(fā)腫瘤，從而退出市場。對乙氧基苯脲在人體中的吸入、分布、代謝及排泄目前并無資料。經(jīng)動物實驗(兔與大鼠)結(jié)果顯示：三小時內(nèi)快速吸收進入血液，但排泄糞便中沒有

4、發(fā)現(xiàn)代謝物，除了脂肪之外的大部分組織中對乙氧基苯脲代謝消失都很慢。聯(lián)合國糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）建議每日容許攝取量：禁止使用。世界上大部分國家（美國、日本、中國臺灣、中國香港）均禁止食品中使用對乙氧基苯脲。有研究表明，成人攝入20-40 g會頭暈、惡心，并可能導致低血壓與發(fā)紺和高鐵血紅蛋白血癥。在我國，對乙氧基苯脲不在衛(wèi)生標準GB2760允許使用的甜味劑名單范圍內(nèi)。據(jù)文獻報道1，常在蜜餞食品中檢驗出對乙氧基苯脲的存在。1.2 理化性質(zhì)對乙氧基苯脲是酰胺類物質(zhì)，也是脲中的一類?；瘜W式為C9H12N2O2，CAS號為：150-69-6。對乙氧基苯脲是具有金屬光澤的白色針狀晶體，分子

5、量為180.212，熔點：173-174 ，在水中的溶解度為3.8 g/L3?？捎蓪σ已趸桨符}酸鹽和尿素加熱反應(yīng)制得，或者將對氨基苯乙醚與二氯化碳作用后，再加入氨氣而制成4。對乙氧基苯脲的分子結(jié)構(gòu)式如下圖：對乙氧基苯脲分子結(jié)構(gòu)式1.3 檢測方法綜述目前能夠檢索到的檢測方法主要包括：薄層色譜法、分光光度法、氣相色譜法、毛細管電泳法、液相色譜法，下面就對乙氧基苯脲檢測技術(shù)發(fā)展情況分類介紹如下。1.3.1 薄層色譜法Kamp.W.等9在1966年用薄層色譜技術(shù)分離并鑒定了對乙氧基苯脲、甜蜜素和糖精鈉。1972年Ryuzo Takeshita10利用薄層色譜法檢測食品中的甜味劑(糖精鈉、甜蜜素和對乙

6、氧基苯脲)，先用乙酸乙酯提取，硅膠和中性氧化鋁柱凈化，再經(jīng)過聚酰胺色譜板分離，方法靈敏度范圍0.012g。1.3.2分光光度法1.3.2.1熒光分光光度法文獻報道關(guān)于對乙氧基苯脲熒光分光光度檢測方法，該類方法是基于增強對乙氧基苯脲熒光強度展開的一系列工作。Uchiyama S11于1969年首次提出了用亞硝酸鈉與對乙氧基苯脲作用，再用熒光分光光度法檢測食物中的對乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama12在1972年報道了用熒光分光光度法測定對乙氧基苯脲與亞硝酸鈉反應(yīng)得到的產(chǎn)物，該方法是在室溫條件下，經(jīng)過對乙氧基苯脲與亞硝酸鈉和鹽酸發(fā)生化學反應(yīng)，混合的反應(yīng)產(chǎn)物與氫氧化鈉反應(yīng)這兩個步驟后，用氯仿

7、提取、硅膠柱分離純化，采用熒光分光光度計檢測樣品中的對乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama131977年具體介紹對乙氧基苯脲與亞硝酸鈉的反應(yīng)條件，如反應(yīng)的溫度，時間。還提出反應(yīng)得到的產(chǎn)物的熒光性是對乙氧基苯脲的5倍，明顯增強了對乙氧基苯脲的熒光性，檢出限也比之前降低了20倍，用此方法測定苯胺類物質(zhì)的衍生物，尤其是對位的苯胺類物質(zhì)、氨基苯乙醚時，可以提高方法靈敏度。1.3.2.2紫外可見分光光度法1983年，M.Veerabhadra Rao等14將對乙氧基苯脲在6.0 mol NaOH條件下進行水解，水解以后的對乙氧基苯脲在pH=3.0條件下被次氯酸鉀氧化，然后在pH=10.0的條件下，與

8、酚的作用下得到靛酚，該衍生物吸收波長為630 nm，方法測定的濃度范圍為0.5-8.0 g/mL，回收率達到99.5-100%。2000年，美國AOAC 17th 出臺了官方方法957.11規(guī)定了食品中對乙氧基苯脲的測定方法，方法分為快速顯色定性方法和紫外分光光度比色定量方法6，7兩個部分。其中分光光度法定量檢測的對象是非酒精飲料，通過溶劑萃取純化樣品，分光光度計定量測定，檢測波長為294nm。1.3.3 氣相色譜法1971年H.Konig15采用氣相色譜同時檢測糖精、甜蜜素、對乙氧基苯脲。其中糖精和甜蜜素用重氮甲烷來進行衍生，其中對乙氧基苯脲則不需要衍生化處理，三種物質(zhì)檢出限達到分別為0.2

9、,0.02和0.02g/mL。另據(jù)報道測定食品中的對乙氧基苯脲的前處理步驟包括：先用水萃取樣品，1N硫酸使之酸化，正己烷除去樣品中的脂肪，之后將水萃取液的pH調(diào)至11-13，再用乙醚萃取濃縮至干，并用98%乙腈溶解后進行氣相色譜測定。就氣相色譜測定對乙氧基苯脲的方法而言，前處理步驟繁瑣，操作復(fù)雜、耗時。 1.3.4 毛細管電泳法根據(jù)對乙氧基苯脲易離子化的特點16，該物質(zhì)也適用于毛細管電泳檢測技術(shù)。針對樣品疏水性質(zhì)的差異，采用膠束電動毛細管色譜(MECC)直接將其分離和檢測。1995年，Catherine O.Thompson17用膠束電動毛細管電泳法測定低熱量飲料中的幾種甜味劑（阿斯巴甜，糖精

10、鈉，安賽蜜，阿力甜和對乙氧基苯脲），用開管毛細管柱，0.05 M脫氧膽酸鈉、0.01 M磷酸氫二鉀、0.01 M硼酸鈉作為緩沖鹽（pH=8.60），方法回收率為104-112%，精密度達到0.63-2.6%。2000年，Lin YH18用毛細管柱,在 0.05 M脫氧膽酸鈉、0.02 M硼酸(pH 8.6)、5%乙腈組成的緩沖溶液中，選取20 kv分離電壓和214 nm檢測波長條件下，采用膠束電動毛細管電泳來同時分離和檢測蜜餞中對乙氧基苯脲、阿斯巴甜、糖精、安賽蜜和9種防腐劑（山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸鈉、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和異丁基對羥基苯甲酸），方法平均回收率達到90%，檢出限范圍

11、為10-25g/g。1.3.5 液相色譜法近年來隨著液相色譜的普及和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，使得液相色譜在食品檢測領(lǐng)域內(nèi)得到了迅速的發(fā)展，在檢索到的文獻中，關(guān)于對乙氧基苯脲的液相色譜方法均采用反相高效液相色譜來檢測對乙氧基苯脲，前處理方法由液-液萃取或固相萃取技術(shù)組成。1.3.5.1 液相色譜紫外檢測法1999年，Kobayashi chigusa8等建立了五種甜味劑的液相色譜檢測方法，該方法將制備后樣品與0.01 mol/L的鹽酸含10氯化鈉溶液反應(yīng)，經(jīng)過鹽酸透析、C18固相萃取柱分離后，采用甲醇：水=45：55的流動相，完成樣品中五種甜味劑（阿力甜、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜和對乙氧基苯脲）的檢測。

12、楊雪嬌1等用高效液相色譜法測定蜜餞中的對乙氧基苯脲，用SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 m)作固定相，以磷酸二氫鉀溶液-乙腈(60+40)為流動相，在240 nm波長條件下用二極管陣列檢測器或紫外檢測器進行檢測。結(jié)果顯示：線性范圍1.0-200.0 g/mL，方法的測定下限(S/N=3)為0.2 g/mL，加標回收率88.3%-94.0%，相對標準偏差0.0772-2.65。該方法的前處理步驟為：蜜餞樣品去核、粉碎均勻后，稱取5-10 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解后，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL除蛋白質(zhì)，用水定容至刻度，取上清液磁力攪拌30

13、min后，用干燥濾紙過濾，濾液用0.45 m微孔濾膜過濾。B. H. Chen19在1995年對多種甜味劑（對乙氧基苯脲、糖精鈉、安賽蜜），防腐劑（脫氫乙酸鈉、山梨酸、水楊酸、苯甲酸、琥珀酸等）和抗氧化劑（3 -叔丁基-4羥基和第三丁基對苯二酚），a-羥基異丁酸和乙腈（2.2:3.4 或2.4:3.6）和溴化十六烷基三甲基銨與被測物質(zhì)形成離子對作為流動相，選用C18柱，紫外吸收在233 nm,檢測限范圍：0.15-3.00 g。M.Veerabhadrarao20等人以BondspakC18為分離柱，甲醇，乙酸，水混合體系（20+5+75）為流動相，檢測波長在254 nm可測定咖啡因、對乙氧基

14、苯脲、苯甲酸和香蘭素。如將流動相換為甲醇、乙酸和水的混合體系（35+5+60），可檢測阿斯巴甜。誤差百分率及相對誤差百分率為：0.3-2.8%，1.64-3.60%?；厥章蔬_到91.6-101.8%。P.W.Wu21探討以高效液相色譜分析飲料中的糖精,安賽蜜,阿斯巴甜和對乙氧基苯脲飲料經(jīng)過ODS-4凈化器凈化以后,使用BondapakC18（3.9 mm×300 mm,10 m）為分析柱，以磷酸調(diào)節(jié)pH=6.0，濃度34 mM的TEA-OH，紫外吸收波長在210 nm,經(jīng)過30分鐘可以同時檢出4種甜味劑，回收率92.2%以上。1.3.5.2 液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法蒸發(fā)光散射檢測器是

15、一種通用型檢測器，其最突出的特點是可以對沒有紫外、熒光吸收的物質(zhì)進行檢測，使用該檢測器可以不依賴于物質(zhì)的特征。2007年Andrzej Wasik22用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器法測定飲料中的9種甜味劑（安賽蜜，甜蜜素，阿力甜，紐糖，對乙氧基苯脲等）,方法檢出限<15 g/g,定量限<30 g/g,加標回收率達到93-109%，精密度<4.0%，線性范圍在25-150 g/g之間。該方法的前處理步驟包括：取5克均質(zhì)樣品至50 mL容量瓶，用pH4.5的緩沖溶液（甲酸-三乙胺）溶解稀釋至刻度，振蕩超聲15分鐘，然后以10分鐘4000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心。SPE柱先用3 mL甲醇與3&#

16、215;2 mL緩沖液先活化，SPE柱的柱流速為1-2 mL/min,取離心后的上清液10 mL上至SPE柱床，用3 mL緩沖液沖洗雜質(zhì)，2×2 mL甲醇進行洗脫柱上的樣品。2009年英國頒布了測定食品中9種甜味劑的檢測標準23(標準號：09/30197132 DC)，該標準采用的儀器為液相色譜蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD），標準中樣品前處理與Andrzej Wasik所建立的方法基本一致。1.3.5.3 液相色譜質(zhì)譜檢測法Masamichi Koyama等24將食品中的9種甜味劑：安賽蜜、三氯蔗糖、糖精、甜蜜素、阿斯巴甜、對乙氧基苯脲、甘草酸、甜菊糖、萊鮑迪甙A用HPLC-

17、MS同時進行分離和測定，分離體系是：ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm×150 mm)柱子，流動相5 mM DBAA和乙腈-水（8 ：2），質(zhì)譜模式是負離子（SIM）。安賽蜜、糖精、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖的定量限都是0.001 g/kg, 三氯蔗糖、甘草酸、對乙氧基苯脲、萊鮑迪甙A是0.005 g/kg,精密度在0.5-10.9%之間。1.4 小結(jié)綜上所述，檢測對乙氧基苯脲的方法種類多樣，方法各具特色。其中，氣相色譜法測定對乙氧基苯脲時因為前處理過程需多次有機溶劑提取與萃取，因而影響回收率，特別是固體類的樣品。對于毛細管電泳技術(shù)，測定對乙氧基苯脲作為一種具

18、有特色的方法，近年來得到了較好的發(fā)展，但由于該儀器設(shè)備的普及性問題，因此此類方法并不是對乙氧基苯脲測定的主流方法，目前測定對乙氧基苯脲報道較多的方法是液相色譜法。項目組經(jīng)過長期的研究和探索，在參考英國標準（食品中9種甜味劑的檢測09/30197132 DC）的基礎(chǔ)上，通過驗證和比較，最終選用高效液相色譜熒光檢測器方法建立了煙用添加劑（香精和料液）中對乙氧基苯脲的檢測標準。2 標準適用范圍本標準規(guī)定了煙用添加劑（香精和料液）中對乙氧基苯脲的測定方法高效液相色譜法；本標準適用于煙用添加劑（香精和料液）中對乙氧基苯脲的測定。3 原理煙用添加劑試樣采用溶劑振蕩萃取，固相萃取柱凈化后，經(jīng)高效液相色譜儀分

19、離，以熒光檢測器測定，外標法定量。4 試驗方法4.1 儀器 常用試驗儀器及下述各項。4.1.1 高效液相色譜儀，配置柱溫箱,具備梯度洗脫功能,熒光檢測器。4.1.2 分析天平,感量0.1 mg。4.1.3 振蕩器，最大轉(zhuǎn)速應(yīng)大于150 r/min。4.1.4 C18 固相萃取柱，規(guī)格：1000 mg/6mL。4.1.5 NH2 固相萃取柱，規(guī)格：1000 mg/6mL。4.1.6有機濾膜，0.45 µm。4.2 試劑和材料除特殊要求外，均使用分析純試劑。4.2.1 水，應(yīng)符合GB/T 6682中一級水的要求。4.2.2 甲醇，CH3OH，色譜純。4.2.3 乙腈，CH3CN，色譜純。

20、4.2.4 二氯甲烷，CH2Cl2。4.2.5 乙酸，CH3COOH。4.2.6 乙酸銨，CH3COONH4。4.2.7 對乙氧基苯脲，C9H12N2O2（CAS號：150-69-6），純度97%。 4.2.8 緩沖溶液，分別稱量2.27 g乙酸銨（4.2.6）和0.2 mL乙酸（4.2.5）至1000 mL容量瓶中，用水（4.2.1）定容至刻度。4.2.9 洗脫溶劑，甲醇/緩沖溶液（4.2.8）混合溶劑，體積比8:2。4.2.10 標準溶液4.2.10.1 一級標準儲備液:稱取100 mg（精確至0.1 mg）對乙氧基苯脲(4.2.7)，用甲醇（4.2.2）溶解轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用

21、甲醇（4.2.2）定容至刻度。在2 8 下密閉保存，有效期1個月。4.2.10.2 二級標準儲備液:準確移取5.0 mL一級儲備液（4.2.10.1）至100 mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）稀釋定容至刻度。在2 8 下密閉保存，有效期1個月。4.2.10.3 標準工作溶液:分別準確移取100 L、500 L、1000 L、2000 L、4000 L、6000 L二級標準儲備液（4.2.10.2）至50 mL容量瓶中，用洗脫溶劑（4.2.9）定容至刻度，即配即用。4.3 試樣前處理稱取1 g（精確至0.1 mg）試樣于50 mL具塞的錐形瓶中，加入15 mL水（4.2.1），在150 r/m

22、in條件下振蕩萃取10 min，將振蕩萃取液移入25 mL具塞容量瓶中，用5 mL水（4.2.1）清洗錐形瓶，將清洗溶液注入容量瓶中，并用水（4.2.1）定容至刻度，取10 mL定容后的提取液至10 mL離心試管中在5000 r/min條件下離心10min，靜置備用。取C18固相萃取柱，分別用5 mL甲醇（4.2.2）和5 mL水（4.2.1）進行活化，準確移取離心上清液5 mL上柱，用5 mL水（4.2.1）清洗，用6 mL洗脫溶劑（4.2.9）洗脫，洗脫液用洗脫溶劑（4.2.9）定容至10 mL。C18固相萃取柱流速為1 mL/min 2 mL/min。取適量溶液過0.45 m濾膜（4.1

23、.6），濾液用高效液相色譜儀分析。對于水不能分散的試樣，按照以下方法處理。稱取1 g（精確至0.1 mg）試樣于50 mL具塞的錐形瓶中，加入15 mL二氯甲烷（4.2.4），在150 r/min條件下振蕩萃取10 min，將振蕩萃取液移入25 mL具塞容量瓶中，用5 mL二氯甲烷（4.2.4）清洗錐形瓶，將清洗溶液注入容量瓶中，并用二氯甲烷（4.2.4）定容至刻度，搖勻，靜置備用。取NH2固相萃取柱，分別用5 mL甲醇（4.2.2）和5 mL二氯甲烷（4.2.4）進行活化，準確移取試樣提取液5 mL上柱，用5 mL二氯甲烷（4.2.4）清洗，用6 mL洗脫溶劑（4.2.9）洗脫，洗脫液用洗脫

24、溶劑（4.2.9）定容至10 mL。NH2固相萃取柱流速為1 mL/min 2 mL/min。取適量溶液過0.45 m濾膜（4.1.6），濾液用高效液相色譜儀分析。若待測試樣溶液的濃度超出標準工作曲線濃度范圍，則對試樣前處理適當調(diào)整后重新測定。4.4 高效液相色譜條件以下分析條件可供參考，采用其它條件應(yīng)驗證其適用性。 CAPCELL PAK CR色譜柱：強陽離子交換與反相C18混合填料，混合比例（1:4）；規(guī)格：填料粒徑5.0µm， 250 mm(長度)×4.6 mm（內(nèi)徑）；流動相A：乙腈(4.2.3)；流動相B：緩沖溶液（4.2.8）；柱溫：35 ；流速：1.0 mL/

25、min；進樣體積：10 L；梯度洗脫程序見表1；熒光檢測器檢測波長:ex（激發(fā)波長）為290 nm，em（發(fā)射波長）為325 nm。表1梯度洗脫程序時間min流動相A%流動相B%015852025752140603140603215855215854.5 標準曲線制作用高效液相色譜測定一系列對乙氧基苯脲標準工作溶液（4.2.10.3），得到6個濃度水平的對乙氧基苯脲標準物質(zhì)的液相色譜峰面積。用峰面積作為縱坐標，微克每毫升（g/mL）計的對乙氧基苯脲標準物質(zhì)濃度作為橫坐標建立對乙氧基苯脲的標準工作曲線。工作曲線相關(guān)數(shù)據(jù)見表2，工作曲線見圖1。表2標準工作溶液檢測數(shù)據(jù)濃度µg/mL峰面積

26、LU*s0.10040.140900.50200.761951.00401.496512.00802.980744.01606.003736.02408.91819圖1標準工作曲線4.6 結(jié)果計算煙用添加劑試樣中對乙氧基苯脲含量按式（1）進行計算，X = （1）式中X試樣中對乙氧基苯脲含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；ci標準曲線計算所得對乙氧基苯脲的濃度，單位為微克每毫升（µg/mL）；V萃取溶液體積，單位為毫升(mL)；稀釋系數(shù)（2）；m試樣質(zhì)量，單位為克(g)。取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值作為試樣測定結(jié)果，精確至0.01毫克每千克（mg/kg）。兩次平行測定結(jié)果的相對平均

27、偏差應(yīng)不大于10。5 結(jié)果與討論5.1 色譜條件的選擇5.1.1檢測器及波長的選擇5.1.1.1檢測器在液相色譜檢測對乙氧基苯脲的相關(guān)文獻中，所采用的檢測器包括：蒸發(fā)光散射、熒光和紫外檢測器等三種，其中蒸發(fā)光散射檢測器是英國標準（食品中9種甜味劑的檢測09/30197132 DC）選取的檢測器，該檢測器是一種通用型檢測器，對于同時檢測多種成分具有一定的優(yōu)勢。紫外和熒光檢測器則是基于目標物質(zhì)的紫外和熒光光譜特性而廣泛應(yīng)用的檢測器。項目組采用標準品進行了熒光和紫外光譜掃描，熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖見圖2、紫外吸收光譜圖見圖3。 圖2 對乙氧基苯脲熒光激發(fā)和發(fā)射波長光譜圖圖3 對乙氧基苯脲紫外吸收光譜圖

28、從圖2、圖3光譜掃描結(jié)果表明：對乙氧基苯脲具有紫外吸收，同時也具備熒光特性，因此項目組分別對蒸發(fā)光散射檢測器、熒光檢測器和紫外檢測器三種檢測器進行考察，檢測器考察結(jié)果如下： 檢測器的檢出限紫外檢測器：0.02 µg/mL熒光檢測器：0.04 µg/mL蒸發(fā)光散射檢測器：4 µg/mL 檢測器的穩(wěn)定性和普適性分析項目組根據(jù)實際操作情況，經(jīng)過長期試驗形成以下判斷：從檢測器穩(wěn)定性分析，三種檢測器從高到低排序為：紫外熒光蒸發(fā)光散射。對于蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）來說，由于使用了高純氮氣作為載氣，做日間重復(fù)性試驗時樣品的檢測信號強度偏差較大，這就使得每批次測定樣品時都必須

29、重做標準曲線，而且測定結(jié)果的相對標準偏差較大。與紫外、熒光這兩種檢測器相比，蒸發(fā)光散射檢測器使用起來工作量相對較大。從檢測器操作的簡便性分析，三種檢測器從高到低排序為：紫外=熒光蒸發(fā)光散射。從檢測器普及程度分析，三種檢測器從高到低排序為：紫外=熒光蒸發(fā)光散射。 檢測器綜合分析對于蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）而言，項目組通過大量試樣加標的方式進行對乙氧基苯脲測定，結(jié)果表明：該檢測器靈敏度低，重復(fù)性較差。根據(jù)檢測器的選擇性和檢出限具體數(shù)值分析，檢出限約為4 µg/mL（理論計算數(shù)值），按本標準制訂的前處理稀釋比例折算為方法檢出限為200 mg/kg。煙草行業(yè)內(nèi)部對16種禁用成分之一香豆素

30、在香精和料液中限量值規(guī)定是150 mg/kg，低于蒸發(fā)光檢測器的檢出限。對于添加劑中對乙氧基苯脲限量，項目組也參照香豆素在香精和料液中限量值（150 mg/kg），那么在現(xiàn)有前處理條件下，該方法則無法滿足限量判斷的要求。如果進一步優(yōu)化HPLC-ELSD方法，減小稀釋倍數(shù)，也可以降低方法檢出限，滿足限量判斷的要求。但是如果需要進一步降低限量數(shù)值，則該方法又會存在難以支撐限量判斷的問題。檢出限高的實際情況表現(xiàn)見圖4，圖4是濃度為10 µg/mL的加標試樣的高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器方法色譜圖。目標峰圖4 對乙氧基苯脲蒸發(fā)光檢測器色譜圖從圖4可以看出：即使在10 µg/mL的濃度水

31、平情況下，試樣采用蒸發(fā)光散射檢測器也很難達到準確檢測的目的。同時基于檢測器的穩(wěn)定性和普適性等方面的考慮，項目組否定了蒸發(fā)光散射檢測器作為液相色譜檢測器的選擇。通過試樣加標的方式，分別對紫外（最大吸收波長240nm）和熒光（檢測波長ex/em=290/325 nm）兩種檢測器進行了考察。結(jié)果見圖5、圖6。 圖5加標試樣（常規(guī)）UV和FLD典型色譜圖圖6 加標試樣（特殊）UV和FLD色譜圖從色譜圖5可以看出，對常規(guī)試樣而言，紫外檢測器和熒光檢測器都可以檢測到目標物質(zhì)（見圖5），但是增大實際試樣考察發(fā)現(xiàn)：紫外檢測器檢測特殊樣品時，干擾物質(zhì)影響檢測結(jié)果。圖6是代表性樣品檢測色譜圖，從該色譜圖中可以看出

32、：目標物質(zhì)與干擾物質(zhì)難以達到完全分離的效果。由于香精及料液成分較為復(fù)雜、種類繁多，具備紫外吸收的物質(zhì)眾多，采用對乙氧基苯脲的紫外特征吸收波長（240nm）易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此項目組否定了紫外檢測器作為液相色譜檢測器的選擇。而熒光檢測器，由于其具有較高的選擇性，因此對于項目組所收集到的試樣均能達到準確檢測的目的。所以，對于種類繁多的添加劑試樣而言，項目組選用了具有較高選擇性的熒光檢測器作為對乙氧基苯脲試樣檢測的技術(shù)手段。5.1.1.2檢測波長項目組根據(jù)熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，遵循最大值原則，選擇了ex/em=239/312 nm作為檢測波長，但是在進行試樣普查試驗過程中，出現(xiàn)了大量陽性檢測結(jié)果

33、。通過排查發(fā)現(xiàn)：在對乙氧基苯脲出峰位置有干擾峰存在，并且通過比較證明該干擾峰是由前處理溶劑甲醇引入。為了確證這一問題，項目組分別取可能在試樣前處理和試樣中含有的試劑：甲醇、乙醇、丙二醇進樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在目標峰位置均出現(xiàn)了干擾峰，結(jié)果見圖7。為了消除甲醇、乙醇、丙二醇對試樣檢測結(jié)果的影響，項目組根據(jù)掃描的熒光光譜圖，將檢測波長改變?yōu)椋篹x/em=290/325 nm，試樣檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾峰消失，結(jié)果見圖8。圖7 ex/em=239/312 nm熒光色譜圖圖8 ex/em=290/325 nm熒光色譜圖 由于煙用添加劑中常用到乙醇、丙二醇等醇類物質(zhì)，且試樣前處理過程中會用到甲醇，所以項目組根據(jù)

34、上述試驗結(jié)果，選擇采用ex/em=290/325 nm作為高效液相色譜方法的檢測波長。5.1.2 色譜柱的選擇項目組根據(jù)文獻報道，考察了三種不同特性的色譜柱對代表性加標試樣的分離效果，三種色譜柱包括：Zorbax Extend- C18 （5 m, 250×3.0 mm）(pH值適用范圍：2.011.5，該色譜柱為英國標準09/30197132 DC中可選用的色譜柱)；Zorbax SB C18（3.5 m, 250×4.6 mm）(pH值適用范圍：1.08.0）；CAPCELL PAK CR1:4 （5.0 µm, 250×4.6 mm）(pH值適用范

35、圍：1.510.0）。結(jié)果見圖9、圖10、圖11。圖9 Zorbax Extend- C18 （5 m, 250×3.0 mm）普通樣品色譜圖圖10 Zorbax SB C18（3.5 m, 250×4.6 mm）普通樣品色譜圖圖11 CAPCELL PAK CR1:4 （5.0 µm, 250×4.6 mm）普通樣品色譜圖通過對大量試樣篩查，對于多數(shù)試樣而言這三種色譜柱都可以達到檢測要求，但對于一些較為復(fù)雜的試樣，則CAPCELL PAK CR1:4 （5.0 µm, 250 ×4.6 mm）色譜柱具有最優(yōu)的分離效果。結(jié)果見圖12、

36、圖13、圖14。圖12 Zorbax Extend- C18 （5 m, 250×3.0 mm）復(fù)雜樣品色譜圖圖13 Zorbax SB C18（3.5 m, 250×4.6 mm）復(fù)雜樣品色譜圖圖14 CAPCELL PAK CR1:4 （5.0 µm, 250×4.6 mm）復(fù)雜樣品色譜圖從圖12、圖13、圖14可以看出，對于復(fù)雜樣品而言，三種色譜柱分離能力比較表明： CAPCELL PAK CR1:4 （5.0 µm,250×4.6 mm）色譜柱的分離能力最強。所以項目組選擇CAPCELL PAK CR1:4（5.0µ

37、m,250×4.6 mm）色譜柱進行試驗。5.1.3 流動相的選擇在確定分析柱（CAPCELL PAK CR1:4，5.0 µm,250 mm×4.6 mm）后，項目組根據(jù)所確定的分析柱使用特性，考察了流動相中緩沖液在不同pH值條件下對分離效果的影響，影響情況用分離度R來比較。對于普通樣品而言，由于組分簡單，pH值對分離效果的影響不明顯，為了提高方法的普適性，項目組特別針對復(fù)雜的香精及料液樣品開展流動相pH值考察。具體考察方法為：選擇了香料煙浸膏和秘魯浸膏兩個樣品，在完成加標步驟后，按照標準規(guī)定的前處理方法進行了樣品制備，在流動相pH值分別為：4.08、5.06、

38、6.04、6.40的條件下進行樣品檢測，結(jié)果見圖15、圖16、圖17、圖18。圖15 加標樣品pH=4.08 色譜圖圖16 pH=5.06 色譜圖圖17 pH=6.04 色譜圖圖18 pH=6.40 色譜圖試驗結(jié)果表明：對于較為復(fù)雜性試樣，pH=6.04的緩沖液的分離度最大，同時采用該條件對普通樣品進行驗證，實驗結(jié)果表明該條件同樣適用（見圖19），項目組最終選擇pH=6.04的緩沖液作為標準方法流動相pH條件。圖19 pH=6.04 普通樣品色譜圖 5.1.4 其它色譜條件的選擇5.1.4.1 色譜梯度及流速在確定色譜柱和流動相之后，項目組對液相色譜梯度和流速進行了優(yōu)化，獲得了標準中所列的推薦

39、色譜梯度，具體色譜梯度見表1，色譜流速見色譜條件（4.4）。5.1.4.2 色譜柱溫度在液相色譜分析中，色譜柱應(yīng)在穩(wěn)定的溫度下工作。項目組分別試驗了溫度為25 、30 、35 、40 ，發(fā)現(xiàn)對試樣測定結(jié)果影響不大。本標準選用35 為工作溫度，在此工作溫度下，色譜柱分離效果穩(wěn)定。5.1.4.3 色譜柱進樣體積 在液相色譜分析中，大的進樣體積有利于提高檢測靈敏度，但容易造成峰脫尾、分離度變差，小的進樣體積則存在分析結(jié)果不穩(wěn)定等現(xiàn)象，項目組比較了不同進樣體積對色譜峰的影響，結(jié)果表明進樣體積為515 µL時，均能得到分離狀況良好、重現(xiàn)性較好的色譜圖，本標準采用10 µL為進樣體積。

40、5.2 前處理步驟選擇及優(yōu)化5.2.1 空白試驗不加樣品，重復(fù)樣品前處理步驟，進行高效液相色譜分析。檢測結(jié)果未檢出對乙氧基苯脲。因此在標準方法中，不需要進行空白試驗以及不需要進行空白扣除。5.2.2 樣品提取溶劑選擇根據(jù)文獻報道，對乙氧基苯脲在水中理論溶解度是3.8g/L,從甜味劑功能性添加（替代蔗糖）的角度分析，煙用添加劑中含糖量最高的試樣是糖料，一般含25%的蔗糖。對于1 g試樣而言,最大蔗糖含量為0.25 g，如果全部用對乙氧基苯脲代替，根據(jù)對乙氧基苯脲和蔗糖的甜度比為1:250進行折算，對乙氧基苯脲最大添加量為0.001 g,0.001 g對乙氧基苯脲被25 mL（提取液定容體積）水分

41、散定容后濃度為40 µg/mL，即可能的功能性最大添加濃度是40mg/L。這就意味著：如果違規(guī)添加了對乙氧基苯脲，檢測試樣中對乙氧基苯脲濃度也大大低于對乙氧基苯脲在水中理論溶解度，因此可以選用水作為萃取溶劑提取水溶性香精及料液試樣中的對乙氧基苯脲。同時，項目在制訂本標準的同時，在綜合考慮對乙氧基苯脲物化特性、樣品分散性、樣品萃取和樣品凈化等諸多方面因素的情況下，參考“甜蜜素的測定”行業(yè)標準，選取樣品分類處理的辦法。也就是將樣品分為水溶性樣品（采用水作為分散溶劑）和非水溶性樣品（采用二氯甲烷作為分散溶劑）。樣品分類后，在制訂標準前處理方法時，可以根據(jù)不同類型的樣品采取更為科學合理的提取

42、和凈化手段，從而保證了樣品檢測的準確性和穩(wěn)定性。5.2.3 凈化步驟的選擇項目組考察了用固相萃取柱凈化與不凈化對試樣分離效果的影響，對大多數(shù)簡單試樣凈化與不凈化對結(jié)果影響區(qū)別不大，但對于復(fù)雜試樣凈化后的結(jié)果則十分明顯。結(jié)果見圖20、圖21。圖20香料煙浸膏不凈化與凈化色譜圖圖21秘魯浸膏不凈化與凈化色譜圖試驗結(jié)果表明：沒有用固相萃取柱凈化的復(fù)雜試樣目標峰與干擾成分之間無法做到完全分離，而用固相萃取柱凈化后試樣的分離效果有了明顯的改善。項目組選擇在前處理過程中增加固相萃取柱凈化這個步驟。5.2.4 固相萃取條件選擇及優(yōu)化5.2.4.1清洗溶劑的選擇 本標準采用樣品分類處理方法，為樣品分散、樣品凈

43、化手段的應(yīng)用提供了更多的選擇。項目組參考了英國HPLC-ELSD測定食品中9中甜味劑的檢測標準(標準號：09/30197132 DC)，選用了C18 固相萃取柱（規(guī)格：1000 mg/6mL）作為水溶性樣品的凈化手段。同時項目組通過大量文獻調(diào)研和實驗摸索，選取了NH2 固相萃取柱（規(guī)格：1000 mg/6mL）作為非水溶性樣品的凈化手段。根據(jù)C18 固相萃取柱和NH2 固相萃取柱使用特點，選擇了與提起溶劑相匹配的試劑作為固相萃取柱的清洗劑。具體而言：水溶性樣品在采用C18 固相萃取柱進行凈化的過程選用水作為清洗劑；非水溶性樣品在采用NH2 固相萃取柱進行凈化的過程選用二氯甲烷作為清洗劑。5.2

44、.4.2洗脫溶劑的選擇項目組參考英國HPLC-ELSD測定食品中9中甜味劑的檢測標準(標準號：09/30197132 DC)，考慮到液相色譜檢測時標準工作溶液的溶劑環(huán)境、樣品可比性等因素，項目組在比較試驗的基礎(chǔ)上，最終確定統(tǒng)一采用甲醇/緩沖溶液混合溶劑作為C18 固相萃取柱和NH2 固相萃取柱的洗脫溶劑。通過對試樣進行加標試驗，確定試樣洗脫溶劑比例。除洗脫溶劑比例因素外，其他前處理按照標準前處理步驟執(zhí)行，其中表香樣品和料液等水性樣品采用水溶性樣品處理步驟，橡苔浸膏等脂溶性試樣采用非水溶性樣品處理步驟，試驗結(jié)果見表3。表3 洗脫溶劑的選擇試樣加標濃度mg/kg洗脫溶劑混合比例（V甲醇：V緩沖液）

45、實測濃度mg/kg加標回收率%表香49.9010:048.3296.838:248.2596.696:445.7891.744:633.3466.812:80:10料液50.2210:048.3496.268:248.2996.166:446.5392.654:635.6070.892:80:10橡苔浸膏51.0310:049.4396.868:249.1796.366:446.2590.634:647.2692.612:833.1464.940:109.4418.50通過試驗，確定兩種固相萃取柱洗脫溶劑均采用：甲醇:緩沖液=8:2（v/v）。5.2.5 凈化過程的回收率考察項目組按照標準前處

46、理步驟中的凈化步驟處理三個不同濃度水平的標品，考察分別采用兩種固相萃取柱凈化后的回收率，結(jié)果見表4。表4凈化過程的回收率考察固相萃取柱加標濃度µg/mL實測濃度µg/mL回收率%C18柱0.20080.22108.65 1.00401.02101.354.01603.9598.40NH2柱0.20080.1994.621.00400.9998.964.01603.8796.32*表4中，采用標準溶液加入到水和二氯甲烷溶劑中后，上柱凈化，洗脫液采用標準方法進行檢測。試樣沒有樣品稱樣量數(shù)據(jù)，因此計算回收率的輸入數(shù)據(jù)為體積濃度。從表4可以看出：采用固相萃取柱凈化后，標品的回收率在

47、94.62108.65之間，說明本凈化過程是可行的，用6 mL洗脫液能夠充分將目標物質(zhì)從固相萃取柱上洗脫下來。5.2.6 其他前處理條件的選擇5.2.6.1稱樣量項目組考察了不同稱樣量的加標試樣，檢測結(jié)果見圖22圖22 稱樣量的選擇通過試驗發(fā)現(xiàn)：采用不同稱樣量時，樣品實測濃度的相對標準偏差分別為：表香1.03%、料液0.86%、橡苔浸膏1.06%，該數(shù)據(jù)表明不同稱樣量對結(jié)果影響差別不大，項目組選擇：1 g為稱樣量。5.2.6.2萃取體積通過試驗發(fā)現(xiàn)：對同一個試樣而言，采用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL萃取溶劑萃取加標試樣，能夠獲得具有一致性和穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。項目組

48、最終采用25 mL作為萃取體積。5.2.6.3萃取方式項目組考察了超聲和振蕩兩種萃取方式對加標試樣檢測結(jié)果的影響，檢測結(jié)果見圖23。圖23 萃取方式的選擇上述檢測結(jié)果表明：采用兩種萃取方式時，樣品實測濃度的相對平均偏差分別為：表香0.65%、料液1.16%、橡苔浸膏1.37%，該數(shù)據(jù)表明這兩種萃取方式對結(jié)果影響差別不大，項目組選擇：振蕩萃取的方式。5.2.6.4萃取時間項目組考察了不同萃取時間對檢測結(jié)果的影響，檢測結(jié)果趨勢見圖24。圖24 萃取時間的選擇采用不同萃取時間時，樣品實測濃度的相對標準偏差分別為：表香0.54%、料液0.93%、橡苔浸膏0.67%，該數(shù)據(jù)表明不同的萃取時間對結(jié)果影響差

49、別不大，項目組選擇：10 min為萃取時間。5.3 方法評價5.3.1 檢出限和定量限項目組用逐級稀釋的方法找出儀器能檢出的標準溶液的最低濃度。濃度值確定為0.0402 µg/mL,項目組還考察了更低濃度0.0301 µg/mL，結(jié)果見圖25。圖25 0.0301 µg/mL的標品色譜圖從圖25可以看出：目標峰峰高未達到三倍信噪比，所以項目組采用0.0402 µg/mL作為最低濃度。最小濃度標準溶液10次進樣, 計算最低濃度檢測結(jié)果的標準偏差（），=0.0028 µg/mL，3=0.0084 µg/mL；代入公式（1）計算出，檢出限：

50、0.42 mg/kg；（選取m=1.0000 g ，V=25 mL）；定量限：1.40 mg/kg（計算過程詳見附件一）。5.3.2 精密度分別對同一表香、料液和橡苔浸膏加標試樣連續(xù)進樣10次，計算其測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表5。表5 精密度試驗表香料液橡苔浸膏實測濃度mg/kg相對標準偏差%實測濃度mg/kg相對標準偏差%實測濃度mg/kg相對標準偏差%48.201.1647.731.4148.601.0848.6547.8248.7348.0047.9348.3048.5148.4748.4348.1846.9047.8549.4847.5447.1348.1548.4547.684

51、7.8148.5147.5247.8748.5548.4049.1846.6648.07試驗結(jié)果表明，表香、料液和橡苔浸膏加標試樣的相對標準偏差分別為1.16%、1.41%和1.08%。說明本方法測定對乙氧基苯脲的精密度良好。5.3.3 重復(fù)性為了考察整個方法的重復(fù)性，應(yīng)用所建立的對乙氧基苯脲測定方法對試樣進行日內(nèi)和日間加標平行測定，日內(nèi)表香、料液和橡苔浸膏試樣各平行處理5份，日間各連續(xù)處理5天，結(jié)果見表6和表7。表6 日內(nèi)重復(fù)性試驗試樣加標濃度mg/kg實測濃度mg/kg實測濃度相對標準偏差%表香49.7350.550.8250.4550.4450.4349.55料液49.4646.961.

52、4848.3848.3648.8148.44橡苔浸膏50.4149.191.4947.4047.7247.8347.57表7 日間重復(fù)性試驗試樣檢測天數(shù)天加標濃度mg/kg實測濃度mg/kg實測濃度相對標準偏差%表香149.8047.721.38246.85346.96448.17548.24料液149.6647.491.41248.05349.09448.83548.94橡苔浸膏147.4247.751.63248.05348.6447.27549.31同一試樣同一天內(nèi)平行處理5份和連續(xù)5天重復(fù)處理測定結(jié)果的相對標準偏差均在5以內(nèi)，說明本方法很穩(wěn)定，重復(fù)性好。5.3.4 儲備液穩(wěn)定性表8標準

53、儲備液在標準儲存條件下的穩(wěn)定性試驗名稱0天g/mL7天g/mL14天g/mL21天g/mL30天g/mL40天g/mLRSD%一級標準儲備液1.081.081.071.061.051.022.15二級標準儲備液1.081.081.061.051.030.993.27圖26 標準儲備液穩(wěn)定性趨勢圖從表8和圖26可以看出，標準儲備液在標準儲備條件下30天內(nèi)的穩(wěn)定性較好，所以項目組采用標準儲備液的儲存條件為：在2 8 下密閉保存，有效期1個月。5.3.5試樣穩(wěn)定性把不同濃度的同一表香、料液橡苔浸膏加標試樣常溫下保存，放置不同時間后進行測定，其結(jié)果見表9和表10、表11。表9 穩(wěn)定性試驗（表香加標試樣）放置時間h水平1實測濃度mg/kg水平2實測濃度mg/kg水平3實測濃度mg/kg023.1847.3495.811223.2346.9395.912423.8347.1899.793624.9650.38101.814822.4745.5195.227222.3346.8195.45相對標準偏差%4.153.412.85表10 穩(wěn)定性試驗（料液加標試樣）放置時間h水平1實測濃度mg/kg水平2實測濃度mg/kg水平3實測濃度mg/kg023.7952.92106.931224.4352.65108.412423.7849.33110.10