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1、二代測(cè)序(NGS)實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案和 應(yīng)用1 / 102 / 10作者:日期:個(gè)人收集整理,勿做商業(yè)用途這里為您介紹二代測(cè)序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成,對(duì)于低花費(fèi)的測(cè)序技術(shù)的需求促進(jìn)了高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測(cè)序平臺(tái)允許進(jìn)行高通量測(cè)序,具有廣泛的應(yīng)用: 全基因組從頭測(cè)序或者重測(cè)序 目標(biāo)序列重測(cè)序 轉(zhuǎn)錄組分析 微生物組研究 基因調(diào)控研究NGS序列二代測(cè)序儀器有很多種組合,在通量、片段長(zhǎng)度、準(zhǔn)確度、每一輪測(cè)序成本、每百萬(wàn)堿基對(duì)測(cè)序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在 存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言,二代測(cè)序儀器可輕松地分類為更窄的范圍,也就是所謂的臺(tái)式測(cè)序儀”和高通量?jī)x器

2、。臺(tái)式測(cè)序儀使得任何實(shí)驗(yàn)室都可以像使用real-time PCR 一樣,自己進(jìn)行測(cè)序。這些儀器可以和一些靶標(biāo)序列富集技術(shù)相結(jié)合,用在一些臨床的應(yīng)用中,其中:選定的靶標(biāo)基因用于深度分析,以檢測(cè)稀有的突變,或者檢測(cè)多樣樣本中(比如癌癥樣本)中的突變。目前,這些儀器的通量在10 Mb到7.5 Gb之間,但是隨著硬件,軟件和試劑的持續(xù)改善,通量也在穩(wěn)步增加。高通量測(cè)序儀非常適合于大量的,基因組范圍的研究,每次測(cè)序能測(cè)定600 Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺(tái),能測(cè)定的片段長(zhǎng)度相對(duì)較短,這對(duì)于高重復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測(cè)序就可能成為問(wèn)題。與此相反,也有一些儀器能測(cè)序的片段較長(zhǎng)(達(dá)到250

3、0 bp ),但是其精度和測(cè)序能力(90 Mb)要低很多。還有一些測(cè)序能力位于兩者之間的儀器(800 bp , 700 Mb )。因此,應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作 納米孔測(cè)序這種技術(shù)中,根據(jù)一個(gè) DNA鏈通過(guò)一個(gè)合成的或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變,可以確定通過(guò)這個(gè)孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測(cè)序一個(gè)完整的染色體,而不需要生成新的DNA鏈。DNA測(cè)序二彳t DNA測(cè)序的工作流程如下: DNA樣本制備 文庫(kù)構(gòu)建和驗(yàn)證 文庫(kù)分子大規(guī)模平行克隆擴(kuò)增 測(cè)序二代測(cè)序DNA樣本的質(zhì)量控制首先,評(píng)價(jià)基因組 DNA的質(zhì)量是非常必要的(完整性和純度)凝膠電泳法3 / 10基因

4、組DNA的完整性和大小,可以用常規(guī)或者脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳 (PFGE)來(lái)檢測(cè)。常規(guī)的凝膠電泳的精確度不高, 這是因?yàn)榇蟮腄NA 分子在凝膠中移動(dòng)的時(shí)候,本質(zhì)上是用一種與尺寸無(wú)關(guān)的方式一起移動(dòng)的。但是,它仍然能夠提供完整性(大小范圍)和純度(RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶)方面的有效信息。因此,它仍然是評(píng)價(jià)基因組DNA質(zhì)量的有效方法之一。注:RNA污染會(huì)導(dǎo)致DNA濃度高估,并且抑制一些下游步驟。如果能肯定有RNA污染,則可使用去 DNase的RNase I處理樣本。分光光度測(cè)定法分光光度儀在260 nm和280 nm處讀數(shù)的比例(A260/A280 )可以用來(lái)估計(jì) DNA相對(duì)于一些吸收紫外

5、光的雜質(zhì)(比如蛋白)的純度。純 凈的DNA的A260/A280比例大約為1.7 T.9。注:想要獲得精確的 A260/A280值,需要在弱堿性的緩沖溶液中測(cè)定吸光度此如,10 mM Tris?Cl, pH 7.5)。第二個(gè)步驟是測(cè)定基因組 DNA的濃度。分光光度法DNA的濃度可以通過(guò)使用分光光度儀測(cè)定其在260 nm波長(zhǎng)的吸光度來(lái)確定。Nanodrop目前被廣泛使用,因?yàn)樗枰臉颖玖可伲?0.1至I1.0之間。并且使用方便(不需要比色皿)。為了確保結(jié)果的可靠性,讀數(shù)應(yīng)該在注:吸光度測(cè)定不能區(qū)別 DNA和RNA。RNA污染物會(huì)導(dǎo)致 DNA濃度高估。但是,純凈 RNA的A260/A280比值在2

6、.0左右,而純凈的DNA大約為1.8。因此,如果這個(gè)值為1.95,那么說(shuō)明樣本里面有 RNA雜質(zhì)。注:苯酚在270 275 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大的吸光度,非常接近于 DNA。因此苯酚能提高樣本在260 nm附近的吸光度,從而導(dǎo)致高 估DNA的產(chǎn)量和純度。熒光法熒光法使用熒光染料測(cè)定 DNA的濃度,具有特異性和靈敏性。Hoechst 33258結(jié)合到DNA上后,能增大458 nm波長(zhǎng)附近的發(fā)光強(qiáng)度,除此之外,也可以使用一些更加靈敏的熒光染料,比如PicoGreen染料?;赑icoGreen染料的實(shí)驗(yàn),比紫外吸光光度法靈敏10, 000倍,而比使用Hoechst 33258染料的方法至少靈敏

7、400倍。和紫外吸光光度法不同,PicoGreen實(shí)驗(yàn)對(duì)雙鏈DNA的選擇性要遠(yuǎn)高于 RNA 和單鏈DNA。DNA標(biāo)準(zhǔn)品和樣本與熒光染料混合,并且使用熒光計(jì)檢測(cè)。將樣本的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果相比較,以確定DNA的濃度。Real-time PCR可以使用real-time PCR 技術(shù)來(lái)測(cè)定DNA樣本的數(shù)量和質(zhì)量。多重 PCR技術(shù)使用引物集在多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增不同大小的片段,是檢測(cè)DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段。此類技術(shù)試驗(yàn)專門測(cè)定可經(jīng)PCR擴(kuò)增,適于二代測(cè)序的 DNA分子。上述提到的這些常規(guī)方法,通常不能測(cè)定的樣本中擴(kuò)增得到的DNA的量,或者會(huì)高估了 DNA的量。與它們相比,real-time

8、 PCR 更加適用于預(yù)測(cè) DNA樣本是否適合于二代測(cè)序。文庫(kù)制備4 / 10對(duì)于大多數(shù)商業(yè)化的二代測(cè)序平臺(tái),使用諸如橋式擴(kuò)增或者乳液PCR方法,對(duì)文庫(kù)中的 DNA片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增,以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測(cè)序模板非常必要。 通過(guò)將平臺(tái)特異性的適配子與感興趣的DNA源(比如基因組 DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴(kuò)增子等所產(chǎn)生的 DNA片段)退火,得到片段文庫(kù)。適配子序列的存在,使得我們可以對(duì)文庫(kù)分子進(jìn)行選擇性的克隆擴(kuò)增。因此,這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣,在微生物中間體中,對(duì)基因組片段進(jìn)行微生物克隆。另外,適配子序列中,還含有平臺(tái)特異性的測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)。通常情況下,一個(gè)常規(guī)的 DNA文庫(kù)構(gòu)建方

9、案包含四步: 片段化DNA 對(duì)DNA片段進(jìn)行末端修復(fù) 連接適配子序列(不適用于單分子測(cè)序) 對(duì)可選的文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組 DNA碎片:酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動(dòng)力剪切法。這四種方法都可以用于文庫(kù)構(gòu)建,但是每一 種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易,但是難以精確的控制片段長(zhǎng)度的分布。另外這種方法可能會(huì)對(duì)基因組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA的雙鏈打斷,這種斷裂是隨機(jī)的,因此能在文庫(kù)中對(duì)DNA進(jìn)行無(wú)偏的呈遞??梢允褂铆傊悄z電泳或者自動(dòng)化的DNA分析方法,對(duì)DNA片段的尺寸分布進(jìn)行控制。片段化DNA之后,需要將DNA修復(fù),產(chǎn)

10、生5磷酸化的平末端 DNA ,以便能夠和測(cè)序平臺(tái)特異性的適配子相連接。文庫(kù)構(gòu)建的效率直接 依賴于DNA末端修復(fù)的效率和準(zhǔn)確性。末端修復(fù)混合溶液將 5或者3的粘性末端轉(zhuǎn)變成 5磷酸化的平末端 DNA。在大多數(shù)情況下,末端修復(fù)通過(guò) T4 DNA聚合酶的5一舞合 酶活性和3一酌核酸外切酶活,性完成。而 T4多聚核甘酸激酶確保平末端的DNA片段5端的磷酸化,以便進(jìn)行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測(cè)序平臺(tái),平末端 DNA片段可以直接與適配子連接,或者需要在其片段的3端增加一個(gè)單獨(dú)的突出的腺甘酸A,以便與平臺(tái)特異性適配子上突出的胸背酸 T相互配對(duì)。通常情況下,使用Klenow片段(具有最低的3到5端的核酸

11、外切酶活性),或者使用其它具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4 DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫(kù)片段修復(fù)過(guò)的末端相連,然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DNA的尺寸,選擇性去除文庫(kù)中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離,使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過(guò)程中可能出 現(xiàn)適配子的二聚體,它們會(huì)和與適配子連接的文庫(kù)片段共同擴(kuò)增,從而降低測(cè)序平臺(tái)對(duì)真正文庫(kù)片段測(cè)序的能力并且降低測(cè)序的質(zhì)量, 因此在測(cè)序之前,必須將它們從文庫(kù)中除去。一些測(cè)序平臺(tái)要求文庫(kù)片段的長(zhǎng)度分布在比較窄的范圍內(nèi),以得到最佳的結(jié)果,很多時(shí)候, 這只能通過(guò)去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實(shí)現(xiàn)。這

12、種方法也可以用來(lái)去除適配子二聚體。完成這一步驟之后,應(yīng)該對(duì) DNA片段文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)濃度和測(cè)序文庫(kù)的適配子設(shè)計(jì),既可以直接稀釋溶液 并用于測(cè)序,也可以對(duì)文庫(kù)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。在文庫(kù)擴(kuò)增階段,使用高保真的DNA聚合酶,合成完整的適配子序列,通過(guò)與 PCR引物的重疊,用于后續(xù)的克隆擴(kuò)增和與測(cè)序引物結(jié)合,或者提高DNA文庫(kù)的產(chǎn)量。為了得到最佳白文庫(kù)擴(kuò)增結(jié)果,要求 DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估方法,參見(jiàn) NGS文庫(kù)質(zhì)控。為了充分利用測(cè)序能力,不同樣本得到的測(cè)序文庫(kù)可以放在一起,在同一輪實(shí)驗(yàn)中一同測(cè)序。通過(guò)將DNA片段與具有不同特征的適配子相連接,可以實(shí)

13、現(xiàn)這一過(guò)程,即對(duì)于每一個(gè)樣本使用不同的短核甘酸序列作為適配子。5 / 10有一些其它的方法可以用于簡(jiǎn)化文庫(kù)構(gòu)建。有一種新方法使用轉(zhuǎn)位酶/DNA的復(fù)合物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座,以便在同一個(gè)試管中同時(shí)將DNA片段化并標(biāo)記。通過(guò)對(duì)所標(biāo)記的 DNA片段進(jìn)行有限次數(shù)的 PCR擴(kuò)增,可以構(gòu)建完整的測(cè)序文庫(kù),這節(jié)省了操作步驟和時(shí)間。但是,使用 體外轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫(kù),與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的文庫(kù)相比,具有更高的序列偏倚。NGS文庫(kù)質(zhì)控高質(zhì)量的文庫(kù)是成功進(jìn)行第二代測(cè)序的關(guān)鍵。文庫(kù)構(gòu)建包含復(fù)雜的步驟,比如片段化樣本、修復(fù)末端、將末端腺甘?;?、連接適配子和 擴(kuò)增文庫(kù)。根據(jù)使用的平臺(tái)和文庫(kù)類型,這些步驟也會(huì)發(fā)生變化。監(jiān)控每一個(gè)步驟非常必

14、要,包括在片段化樣本之后檢查片段的尺寸, 以及連接適配子之后檢查片段的大小和濃度。文庫(kù)驗(yàn)證過(guò)程中,需要分析文庫(kù)中片段的大小和數(shù)量,這是質(zhì)控的最后步驟。評(píng)估文庫(kù)中片段的大小瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測(cè)片段大小的方法,它們比較耗時(shí)。最近,基于微流技術(shù)的電泳或者毛細(xì)管電泳越來(lái)越廣泛的用于檢測(cè)片段的大小和濃度。即買即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步驟, 使用方便。它們具有更高的通量,并且省去了很多的手動(dòng)操作時(shí)間。除此之外,它們的靈敏度更高(對(duì)于檢測(cè)的限制更少),并且能完 全自動(dòng)化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料。這些儀器能同時(shí)檢測(cè)片段的大小和濃度。 測(cè)定文庫(kù)中的片段數(shù)量 分光光度法和熒光法 參

15、見(jiàn)分光光度法和熒光法電泳設(shè)備如前所述,基于微流技術(shù)的電泳和毛細(xì)管電泳除了提供片段大小的信息之外,還提供了定量檢測(cè)數(shù)據(jù)。但是,電泳、分光光度法和熒光 法的一個(gè)共同的局限性是,都只檢測(cè)總的核甘酸的濃度,而非與適配子連接的分子的濃度。Real-time PCR將適配子連接到文庫(kù)分子的兩端,使得可以在平行的PCR擴(kuò)增步驟中擴(kuò)增上百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的DNA分子(乳液PCR或者橋式PCR)。在有些儀器中,乳液PCR可以將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)相同序列的拷貝,并全都結(jié)合在同一個(gè)珠子上。在另一種平臺(tái)上,橋式PCR能夠?qū)⒁粋€(gè)DNA分子轉(zhuǎn)變成一個(gè)包含相同序列的多個(gè)拷貝的DNA簇。因此,兩端連接了適配子的擴(kuò)增之后的分

16、子,決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式 PCR中產(chǎn)生的最佳DNA簇。對(duì)擴(kuò)增后的文庫(kù)中的分子進(jìn)行精確的定量檢測(cè),對(duì)于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常重要的。低估擴(kuò)增文庫(kù)中的分子數(shù)量,會(huì)導(dǎo)致混雜的信號(hào)以及難以解析的數(shù)據(jù);相反地,高估分子的數(shù)量會(huì)降低結(jié)合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量,并且沒(méi)有充分利用測(cè)序能力。Real-time PCR能夠特異性的定量檢測(cè)兩端結(jié)合有適配子的DNA分子,因此能夠?qū)U(kuò)增文庫(kù)中的分子進(jìn)行高度精確的定量檢測(cè)。Real-time PCR的靈敏性非常高,可以對(duì)濃度非常低的文庫(kù)分子進(jìn)行定量檢測(cè),即使其濃度低于傳統(tǒng)方法可以檢測(cè)的閾值。因此,這種 方法能盡量減少對(duì)文庫(kù)的擴(kuò)增

17、,降低可能的偏倚。用于決對(duì)定量檢測(cè)的數(shù)字 PCR6 / 10數(shù)字PCR能夠?qū)Χ鷾y(cè)序的文庫(kù)進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè), 而不需要標(biāo)準(zhǔn)品。這個(gè)技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行有限的稀釋, 并進(jìn)行大量獨(dú)立的 PCR反應(yīng); 因此,大多數(shù)反應(yīng)沒(méi)有模板,得到陰性的結(jié)果。一個(gè)單獨(dú)的陽(yáng)性PCR反應(yīng)統(tǒng)計(jì)為一個(gè)單獨(dú)的模板分子。通過(guò)統(tǒng)計(jì)所有陽(yáng)性PCR的數(shù)量,能夠確定文庫(kù)分子的絕對(duì)數(shù)目。數(shù)字 PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于: 單分子的敏感性 與PCR擴(kuò)增的效率無(wú)關(guān),因?yàn)槌晒Φ臄U(kuò)增被統(tǒng)計(jì)為一個(gè)分子,而與最終產(chǎn)物的數(shù)量無(wú)關(guān)但是,這種技術(shù)需要特殊的儀器,并且花費(fèi)較高,因此尚未廣泛用于文庫(kù)定量檢測(cè)。宏基因組學(xué)MetagenomicsDNA測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域之一是宏

18、基因組領(lǐng)域,即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養(yǎng)研究。宏基因組學(xué)是指一個(gè)環(huán)境樣本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析。這個(gè)詞匯起源于“meta”(在這里指對(duì)于基因多樣性的系統(tǒng)性理解)和“genomics”(對(duì)一個(gè)物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析)。宏基因組不是一個(gè)新的學(xué)科,但由于二代測(cè)序技術(shù)所帶了的諸多可能性,宏基因組的應(yīng)用經(jīng)歷了巨大的提升。據(jù)估計(jì),微生物中僅有 1%左右是可培養(yǎng)的,因此宏基因組學(xué)的研究能極大的拓展我們對(duì)于環(huán)境的認(rèn)識(shí)。很多年以來(lái), 宏基因組這個(gè)詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān),比如,分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的DNA,以便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑。但是,通量的極大提高,以

19、及所花費(fèi)的費(fèi)用和時(shí)間的降低,將這個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)展到了很多其他方面。宏基因組學(xué)可分成幾個(gè)領(lǐng)域,包括: 病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué) 微生物組分析 環(huán)境宏基因組學(xué)注:這并不是全面的分類,研究者可以選擇其他的分類標(biāo)準(zhǔn)。病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)和疾病的診斷相關(guān),用于確定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體。這通常是極具挑戰(zhàn)性的過(guò)程,因?yàn)槲⑸锏臄?shù)量可能非常少(每毫升血液中大概有1T0個(gè)細(xì)胞)。與之相反,微生物組分析則涉及到數(shù)量巨大的微生物,比如口腔或者直腸拭子中的微生物。此時(shí),我們的目標(biāo)是分析這些菌群的組成??紤]到人體僅包含1%的人類細(xì)胞而其它 99%都是微生物細(xì)胞,微生物組分析在未來(lái)的診斷技術(shù)中有潛在的

20、巨大應(yīng)用。更多細(xì)節(jié),請(qǐng)見(jiàn) 人類微生物組工程( )。環(huán)境宏基因組學(xué)的目標(biāo)除了包括傳統(tǒng)的尋找新的生物催化劑之外,還包括研究和鑒定棲息環(huán)境。 從理論上來(lái)講,環(huán)境宏基因組學(xué)有兩種不同的研究方法: 全基因組分析:又t所有存在的DNA進(jìn)行測(cè)序 16S分析:僅對(duì)16S rRNA DNA 進(jìn)行測(cè)序7 / 10第一種方法只是簡(jiǎn)單的對(duì)樣本中存在的所有DNA進(jìn)行測(cè)序。這可以完整地描繪所有出現(xiàn)過(guò)的微生物,并且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族,以及抗生素的抗性。另一方面,這種方法需要較高的測(cè)序能力,因而,相對(duì)于第二種方法,其通量較低并且花費(fèi)較高。與此相關(guān)的進(jìn)一 步的方法正在研發(fā)。在宏基因組的應(yīng)用中

21、,通常需要能提供較高的片段長(zhǎng)度的測(cè)序儀,這是因?yàn)橥ǔ](méi)有參考序列可供參照。對(duì)于16S rRNA分析而言,測(cè)序儀的讀長(zhǎng)需要覆蓋整個(gè)區(qū)域(另請(qǐng)參照二代測(cè)序儀)。RNA測(cè)序RNA測(cè)序(RNA-seq )是使用深度測(cè)序技術(shù)來(lái)研究生物體轉(zhuǎn)錄組的方法。此方法在構(gòu)建合適的文庫(kù)之后,對(duì)樣本中的RNA直接測(cè)序,得到豐富的數(shù)據(jù)集以進(jìn)行分析。這項(xiàng)技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄情形的有價(jià)值的工具。數(shù)據(jù)的定量性以及測(cè)序 技術(shù)的高動(dòng)態(tài)范圍使得其對(duì)基因表達(dá)的分析具有高度的靈敏性。數(shù)據(jù)的單個(gè)堿基的分辨率提供了關(guān)于單核甘酸多態(tài)性(SNP)、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子邊界、非翻譯區(qū)及其它元件的詳細(xì)信息。除此之外,

22、RNA-seq不需要預(yù)先知道參考序列,這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測(cè)成為可能。RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大、革命性方法,但是使用這種技術(shù)需要非常仔細(xì)以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。RNA-seq中需要考慮的因素第一個(gè)需要考慮的因素是樣本富集??俁NA通常只包含比例很少的編碼 RNA或者功能RNA ;樣本中大部分 RNA是核糖體RNA (rRNA:大約占到了總 RNA的80 $0% )和較少的轉(zhuǎn)運(yùn) RNA (tRNA)。為了避免將 80 40%的測(cè)序資源用在重復(fù)的 rRNA序列上,通常在測(cè)序之 前,需要從樣本中去除 rRNA。這通??梢酝ㄟ^(guò)特定的消耗 rRNA實(shí)現(xiàn),也可以通過(guò)使用寡聚

23、胸腺嗑咤富集技術(shù)選擇性富集Poly A實(shí)現(xiàn)。消耗rRNA的方法可以同時(shí)保留編碼RNA和非編碼RNA (一項(xiàng)非常重要的研究?jī)?nèi)容)的信息,而 Poly A富集則僅保留了編碼 mRNA。Poly A富集可能會(huì)丟掉特定的 RNA和具有高轉(zhuǎn)換率的 RNA。有一些其他的方法可以避免rRNA的影響,比如選擇性降解大量轉(zhuǎn)錄物,或者不擴(kuò)增 rRNA的擴(kuò)增技術(shù)。但是這些方法不像rRNA消耗或者poly A富集那么常見(jiàn),并且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物表征的正常水平。另外一個(gè)需要考慮的因素是要研究的RNA的大小。RNA轉(zhuǎn)錄物跨越比較大的大小范圍;與常規(guī)的 RNA分析相比,關(guān)注小 RNA的實(shí)驗(yàn)(比如microRNA或者長(zhǎng)度范圍在1

24、5 -35bp的RNA ),需要特別的純化和文庫(kù)構(gòu)建方案。大多數(shù)其他大小的 RNA片段可以同時(shí)測(cè)序(RNA測(cè)序的常用步驟之一是將 RNA分割成普通長(zhǎng)度,比如 200 T00 nt長(zhǎng)度的片段)。RNA-seq測(cè)序操作步驟一旦確定了移除核糖體的方法和要研究的片段大小,就可以將RNA構(gòu)建成一個(gè)文庫(kù)。對(duì)于大多數(shù)測(cè)序儀器而言,這包括首先將RNA打碎成片段,其次通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄方法構(gòu)建雙鏈 cDNA。在后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中,這些雙鏈的 cDNA被當(dāng)作普通的基因組 DNA來(lái)對(duì)待。如果 想要保留RNA的直接信息(鏈型),必須使用修改過(guò)的文庫(kù)構(gòu)建方案,比如將mRNA與連接適配子直接相連,或者標(biāo)記 cDNA的一條鏈以便

25、在測(cè)序之前移除。在進(jìn)行測(cè)序計(jì)劃過(guò)程中,需要考慮三個(gè)主要的因: 測(cè)序深度、讀長(zhǎng)和是否使用雙端測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序深度可以提供 RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息,并且較大的測(cè)序深度使得對(duì)于稀有轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)更加靈敏。讀長(zhǎng)也很重要,因?yàn)檩^長(zhǎng)的讀段對(duì)于檢測(cè)剪接事件更加靈敏(內(nèi)含子的卜顯子邊界,外顯子的卜顯子邊界)。雙端測(cè)序數(shù)據(jù)能提供更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的信息,特別是相互分隔的較遠(yuǎn)的外顯子。一般而言,從頭分析以及尋找新的結(jié)構(gòu)變異要求較高的測(cè)序深度和讀長(zhǎng),并且會(huì)得益于雙端測(cè)序數(shù)據(jù)。典型的測(cè)序應(yīng)用包含100 -200 M片段,長(zhǎng)度為2 x50 100 bp。與之相反,表達(dá)分析得益于較高的測(cè)序深度,但是讀長(zhǎng)和雙端測(cè)序數(shù)據(jù)則對(duì)結(jié)果

26、的改善作用較小。這方面應(yīng)用的一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)包含10-30 M片段,讀長(zhǎng)為 1 x 35 100 bp。8 / 10基因調(diào)控研究二代測(cè)序技術(shù)也是研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)有力的工具。比如ChIP-seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序)可以用于分析蛋白-DNA的相互作用二代測(cè)序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式。ChIP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)是用于研究轉(zhuǎn)錄因子和修飾組蛋白基因調(diào)控機(jī)制的強(qiáng)大、多功能方法。這種技術(shù)用于確定活細(xì)胞中染色質(zhì) 上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子相互結(jié)合的區(qū)域。整個(gè)操作過(guò)程非常耗時(shí),包含了很多步驟和變量,每一個(gè)步驟都需要研究者根

27、據(jù)自己的模型體系進(jìn)行優(yōu)化。將細(xì)胞與甲醛交聯(lián)之后,將染色質(zhì)中共價(jià)相連的基因組 DNA和核因子復(fù)合物分離出來(lái),然后經(jīng)過(guò)超聲波處理,剪切成可以處理的大小。抗體與目標(biāo)核蛋白特異性免疫共沉淀時(shí),也將與這些核蛋白特異性結(jié)合的基因組DNA也沉淀下來(lái)了。去除化學(xué)交聯(lián)并經(jīng)過(guò)核酸純化處理的這些DNA可用于測(cè)序、基于微陣列的基因組雜交或者 PCR擴(kuò)增。ChIP與二代測(cè)序技術(shù)聯(lián)用(ChIP-Seq )可研究與感興趣蛋白相結(jié)合的位點(diǎn)在基因組的范圍內(nèi)的分布。與微陣列分析(ChIP-Chip)相比,ChIP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率,動(dòng)態(tài)范圍和基因組覆蓋度,因而它對(duì)于DNA結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)具有超級(jí)的靈敏度和準(zhǔn)確度。另

28、外,ChIP-Seq技術(shù)通常只要很少的起始樣本輸入量,并且不需要雜交探針,具有較高的靈活性,任何測(cè)序過(guò)基因組的物種都可以使用這種方法進(jìn)行研究。高效的ChIP-Seq過(guò)程需要優(yōu)化幾個(gè)關(guān)鍵的變量。首先,甲醛交聯(lián)的溫度和時(shí)間需要優(yōu)化。如果蛋白和DNA交聯(lián)的過(guò)于緊密,則在測(cè)序之前無(wú)法將染色質(zhì)有效地打碎成片段,并且去除交聯(lián)也會(huì)遇到困難。通常情況下,最好以在37C下與1%的甲醛共培育10分鐘起始,然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化。有幾種不同的方法可以將染色質(zhì)打成碎片,比如超聲波和酶消化(比如使用微球菌核酸酶)。如果使用二代測(cè)序技術(shù)來(lái)分析免疫共沉淀的DNA ,染色質(zhì)碎片的大小應(yīng)在大約100 300核甘酸長(zhǎng)度范圍內(nèi),

29、并且每一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中(細(xì)胞的類型、組織的類型),將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也需要嚴(yán)格優(yōu)化。ChIP實(shí)驗(yàn)的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性。最好選用能從多家抗體廠商處獲得的,經(jīng)過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。為了確定抗體能特異性地沉淀目標(biāo)蛋白,可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)核提取物。如果在結(jié)果中,僅能觀察到一條特定大小的條帶,則可認(rèn)為該抗 體是特異性的。使用選定的抗體進(jìn)行免疫共沉淀,然后通過(guò)蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標(biāo)蛋白。如果這樣的實(shí)驗(yàn) 失敗了,那么還可以將選定的抗體與培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。如果僅有細(xì)胞核顯色,則說(shuō)明抗體至少能特異性的識(shí)別一種位于細(xì) 胞核內(nèi)并可結(jié)合到 DNA上面

30、的蛋白。根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化,以便獲得足夠的DNA進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于識(shí)別組蛋白和組蛋白修飾的抗體而言,每一次免疫共沉淀反應(yīng)大概需要100, 000到1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中的染色質(zhì)。如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的動(dòng)態(tài)性較高或者與組蛋白相比,僅在有限的基因組位點(diǎn)上結(jié)合,那么實(shí)驗(yàn)就需要更多的染色質(zhì)。為避免多余的抗體與非目標(biāo)蛋白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合,同時(shí)保證能沉淀足夠多的目標(biāo)蛋白,每一次免疫共沉淀反應(yīng)使用的抗體的數(shù)量也非常重要。通常而言,1T0四的抗體即可得到合理的結(jié)果??梢杂脤?duì)照反應(yīng)來(lái)比對(duì) ChIP反應(yīng)的特異性。在平行的 ChIP反應(yīng)中,使用同樣數(shù)量的染

31、色質(zhì),可以使用同型的對(duì)照抗體或者沒(méi)有抗體的珠子用來(lái)比照抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合。通過(guò)比較陰性對(duì)照樣本和ChIP樣本中在特定位點(diǎn)沉淀的 DNA的量,能計(jì)算這個(gè)位點(diǎn)的富集因子。但是,在這種免疫共沉淀對(duì)照實(shí)驗(yàn)中得到的沉淀物的量通常很少,不足以提供足夠的片段進(jìn)行二代測(cè)序。因此,ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)通常使用輸入對(duì)照樣本作比對(duì)。在這種情況下,每個(gè) ChIP反應(yīng)中通常有1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來(lái)去除交聯(lián)并且與沉淀的樣本一同純化并進(jìn)行后續(xù)的深度測(cè)序。這使得我們可以比對(duì)由于打碎染色質(zhì)所引起的偏移,這些偏移表現(xiàn)在染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu),DNA擴(kuò)增,測(cè)序,拷貝數(shù)量的變化,以及測(cè)定基因組區(qū)域的能力。9 / 10在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后,建議使用 real-time PCR 技術(shù)確認(rèn)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的基因組位點(diǎn)的回收和富集效果。通過(guò)比較 輸入對(duì)照組與 ChIP

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