第六章親和分離技術(shù)

1、第六章 親和分離技術(shù) 生物大分子之間的特異性結(jié)合作用稱為生物親和作用（bioaffinity），簡(jiǎn)稱親和作用，如抗原與抗體、酶與酶原（或抑制劑、底物）、核酸與互補(bǔ)堿基鏈等。 利用親和作用純化生物大分子的生化分離技術(shù)稱為親和分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來(lái)進(jìn)行相互分離的。 第一節(jié) 親和技術(shù)發(fā)展 1910年有人發(fā)現(xiàn)不溶性淀粉可以選擇性吸附生物組織抽提液中的-淀粉酶，這是親和分離法的最初應(yīng)用及報(bào)道。 1951年Campbell等利用半抗原（對(duì)氨苯甲基）修飾纖維素制備的載體為親和吸附介質(zhì)從血清中純化了抗體，這是人們開始有意識(shí)利用生物親和作用純化蛋白質(zhì)的研究。 由于親

2、和吸附介質(zhì)制備技術(shù)的障礙，親和分離技術(shù)的實(shí)用化進(jìn)程進(jìn)展緩慢。 1967年Axen和Cuatrecasas等開發(fā)了利用溴化腈活化瓊脂糖凝膠制備親和吸附介質(zhì)的方法，才使親和分離技術(shù)從研究走向?qū)嵱谩?20世紀(jì)80年代以后，親和技術(shù)與其他分離技術(shù)如膜分離、萃取技術(shù)、電泳技術(shù)、色譜技術(shù)等相結(jié)合，相繼出現(xiàn)了親和色譜、膜親和過濾、親和萃取、親和電泳等新型的親和分離技術(shù)。其中最典型的是親和色譜技術(shù)。第二節(jié) 親和分離原理一、生物親和作用 affinity（親和）一詞源于拉丁語(yǔ)的affinitus，原意為結(jié)婚或親緣關(guān)系，因此在化學(xué)或生物化學(xué)中，affinity可以理解為分子之間的結(jié)合作用。 實(shí)際上，親和作用不止限

3、于生物物質(zhì)之間，對(duì)于簡(jiǎn)單的化合物，如Na+和Cl-通過靜電作用相互吸引的現(xiàn)象也是一種親和作用。因此，親和作用是自然界普遍存在的現(xiàn)象，只是生物分子間的親和作用具有更高的選擇性。 生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識(shí)別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力。這種識(shí)別并結(jié)合的能力具有排他性，即生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合。 生物親和作用是生命誕生、維持與延續(xù)的重要基礎(chǔ)，而親和分離技術(shù)則是人類利用生物親合作用的方式。親和作用的本質(zhì)：鎖鑰理論 參與親和作用的兩個(gè)分子（或物質(zhì)）中，其中之一為蛋白質(zhì)的情況占絕大多數(shù)，或者兩者均為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是高分子化合物，

4、種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其參與親和作用的機(jī)理尚不完全清楚，一般認(rèn)為是蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中含有某些參與親和結(jié)合的部位，這些結(jié)合部位呈凹陷或凸起狀，能與該蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用的分子恰好可以進(jìn)入到此凹陷結(jié)構(gòu)中，或者該蛋白質(zhì)的凸起部位恰好能夠進(jìn)入與其發(fā)生親和作用的分子的凹陷部位，就像鑰匙和鎖孔的關(guān)系一樣。 具有親和作用的分子對(duì)之間具有鑰匙和鎖孔的關(guān)系是產(chǎn)生親和作用的必要條件，但并不充分，除此之外，要想發(fā)生親和作用還需要分子或原子水平的各種相互作用。（1）靜電作用（2）氫鍵（3）疏水性相互作用（4）配位鍵（5）弱共價(jià)鍵 靜電作用：近距離產(chǎn)生較大的作用力，但應(yīng)與其它因素結(jié)合才能具有親和識(shí)別作用。 氫鍵：分子中的氧

5、原子和氮原子，可形成氫鍵作用。與原子間距離有關(guān)，應(yīng)較近。 疏水性相互作用：需兩分子都具有疏水性基團(tuán)。 配位鍵：咪唑基（組氨酸）和Zn2、Cu2、Ni2等產(chǎn)生配位鍵，形成金屬螯合結(jié)構(gòu)。 弱共價(jià)鍵：可逆共價(jià)鍵，結(jié)合力較弱。二、影響親和作用的因素1、離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度影響靜電引力、氫鍵作用、疏水相互作用等。離子強(qiáng)度越大，靜電力和氫鍵力都降低，而疏水作用增強(qiáng)。2、pH值 在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完全破壞。 如：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的結(jié)合部位存在羧基時(shí)，在pH值等于該羧基的pKa時(shí)，該羧基的50%帶負(fù)電荷，當(dāng)pH值高于pKa一個(gè)pH單位時(shí)，該羧基的90%帶負(fù)電荷，當(dāng)pH值低于p

6、Ka一個(gè)pH單位時(shí)，該羧基的10%帶負(fù)電荷。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì) 脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵的形成，但容易使蛋白質(zhì)變性。4、溫度 溫度升高，靜電力、氫鍵、金屬配位鍵減弱，疏水力增強(qiáng)。5、離液離子 SCN-，I-，ClO4-等離子半徑較大的離液陰離子（破壞水化作用）存在時(shí)，疏水性親和作用降低。6、螯合劑 加入螯合劑（如EDTA），去除金屬離子，破壞配位鍵，會(huì)使親和作用消失。三、親和作用體系 將親和體系中的一種分子與固體粒子共價(jià)偶聯(lián)，可特異性結(jié)合另一種分子（目標(biāo)產(chǎn)物） ，使其從混合物中高選擇性地分離純化。 一般將被固定的分子稱為其親和結(jié)合對(duì)象的配基（ligand），用L表示。Kd：解離常數(shù) Ke

7、q：結(jié)合常數(shù)Keq越大，親和結(jié)合作用越強(qiáng)。Keq一般為104108 L/mol，最高（生物素抗生物蛋白）可達(dá)到1015 L/mol 。 親和配基必須具備的條件(選擇原則) ：（1）專一性識(shí)別或特異性作用必須是可逆的 配基與被分離生物大分子之間的專一性識(shí)別或特異性作用，必須是可逆的。（2）結(jié)合常數(shù)要適當(dāng) 配基與被分離分子之間結(jié)合力要有足夠高，以能形成穩(wěn)定的復(fù)合物；同時(shí)結(jié)合又不能太強(qiáng)，否則洗脫困難。（3）穩(wěn)定性好，可進(jìn)行化學(xué)改性（4）固定到載體上后配基的專一性識(shí)別或特異性作用不發(fā)生明顯的變化。 專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度，相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度。配基的類型： 單專一性

8、的小分子配基 基團(tuán)專一性的小分子親和配基 專一性的大分子親和配基 免疫親和配基 基團(tuán)專一性的大分子親和配基（1）酶的抑制劑 小分子抑制劑有芐脒（benzamidine）、精氨酸和賴氨酸等。（2）抗體 利用抗原與抗體間特異性結(jié)合的親和技術(shù)稱為免疫親和技術(shù)。 抗體與抗原之間的Keq一般為1071012 L/mol。 因此，利用免疫親和法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。（3）A蛋白 Protein A為分子量約42 kD的蛋白質(zhì)，與IgG具有很強(qiáng)的親和作用，結(jié)合部位為IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5個(gè)Fc片段可結(jié)合部位。 不同IgG的Fc片段的結(jié)構(gòu)非常相似，因此A蛋白可作為各種抗體的

9、親和配基，但不同抗體的結(jié)合常數(shù)有所不同。 A蛋白與抗體結(jié)合并不影響抗體與抗原的結(jié)合能力，因此A蛋白也可用于分離抗原-抗體的免疫復(fù)合體。（4）凝集素 凝集素（lectin）是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外）的總稱。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、純化。pH5.6時(shí)con A為二聚體，分子量為52 kD；pH5.6時(shí)為四聚體，分子量為102 kD，兩個(gè)亞基（subunit）之間通過二硫鍵結(jié)合。因此，在利用con A為配基的親和分離技術(shù)中，操作條件應(yīng)當(dāng)適宜。（5）輔酶和磷酸腺苷 脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結(jié)合作用

10、。 輔酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。 這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。 AMP（adenosine 5-monophosphate）、 ADP（adenosine 2，5-diphosphate）的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，可用做這些酶的親和配基。（6）三嗪類色素 Triazine dyes是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成染料，與NAD的結(jié)合部位相同，又稱為生體模擬色素（biomimetic dye）。 除脫氫酶和激酶外，三嗪類色素還

11、與血清白蛋白、 干擾素、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和力。Cibacron Blue F3GA ：（7）過渡金屬離子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡金屬離子可通過與亞胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金屬鹽固定在固定相粒子表面，用做親和吸附蛋白質(zhì)的配基。（8）組氨酸 組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用：靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合。 在鹽濃度較低和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)pI的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強(qiáng)，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。（9）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳動(dòng)物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質(zhì)，分子量一般為5至30

12、 kD，具有抗凝血作用。 肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。 肝素的親和結(jié)合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強(qiáng)，隨著鹽濃度的增大結(jié)合作用降低。親和配基的選擇（1）組合化學(xué)肽庫(kù)選擇親和配基 目標(biāo)肽反義肽組合合成親和篩選優(yōu)選序列（2）噬菌體展示技術(shù) 目標(biāo)蛋白可結(jié)合噬菌體擴(kuò)增多輪篩選單克隆群體氨基酸序列（3）SELEX技術(shù) 隨機(jī)序列PCR擴(kuò)增特異性結(jié)合重復(fù)篩選間隔臂 當(dāng)配基的分子量較小的時(shí)候，如果將其直接固定到載體上，會(huì)由于空間位阻的影響，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的結(jié)合。 這時(shí)需要在配基和載體之間引入一個(gè)間臂分子，使配

13、基和生物大分子發(fā)生有效作用。引入間臂分子最常用的方法: 先將間臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、 NH2(CH2)n NH2連接到載體上。 然后將親和配基連接在間臂分子上。 羧基和氨基在碳二亞胺的作用下可以縮合形成酰胺鍵。 間臂的長(zhǎng)度是很重要的因素，太短，效果不明顯；太長(zhǎng)，間隔臂容易彎曲，結(jié)合效果會(huì)下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一般引入46個(gè)亞甲基時(shí)，間臂分子效果較好，常用的間臂分子為-氨基己酸、1，6-二氨基己烷。 載體要求：（1）具有親水、多孔結(jié)構(gòu)；（2）含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)；（3）理化性質(zhì)穩(wěn)定，不因共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)的條件及吸附條件的變化而發(fā)生變化；（4）非特異吸附小。 多糖類的凝膠過濾介質(zhì)

14、表面含有大量可活化的羥基可作為親和配基的載體。 表面具有氨基的聚丙烯酰胺類的載體也常作為親和配基的載體。 還可采用一些無(wú)機(jī)載體如硅膠和多孔玻璃。 常用載體纖維素 (cellulose)瓊脂糖凝膠 葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它載體殼聚糖 (Chitosan)（1）纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強(qiáng)，空間位阻。主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。（2）瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。穩(wěn)定

15、性好，能在pH314中應(yīng)用。（3）葡聚糖凝膠： 葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。 （4）聚丙烯酰胺凝膠： Bio-gel P 有供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。 pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。（5）多孔玻璃珠： 化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高。 缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，化學(xué)活性基團(tuán)少。（6）其它載體殼聚糖第三節(jié) 親和分離技術(shù)的應(yīng)用一、親和分離過程 1、配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。 2、吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì)。 3、樣品解吸：選擇適宜的

16、條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。（1）特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。例如：Lys和Arg均為t-PA（組織纖溶酶原激活劑，一種糖蛋白）的抑制劑，利用固定化Lys為配基親和分離t-PA時(shí)，可用Arg溶液進(jìn)行洗脫。 利用con A為配基的目標(biāo)產(chǎn)物可用葡萄糖溶液洗脫。 特異性洗脫法的洗脫條件溫和，有利于保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，另外，由于僅特異性洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，對(duì)于特異性較低的親和體系（例如，用三嗪類色素為配基時(shí)）或非特異性吸附較嚴(yán)重的物系，特異性洗脫法有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物

17、的純度。 （2）非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。二、親和分離技術(shù)1、親和色譜 利用偶聯(lián)有親和配基的層析介質(zhì)為固定相，根據(jù)生物分子之間的親和作用進(jìn)行物質(zhì)分離的色譜方法。與固定床吸附操作類似，其過程包括： 進(jìn)料（feedstock loading） 雜質(zhì)清洗（contaminant washing） 目標(biāo)產(chǎn)物洗脫（target product elution） 色譜柱再生（column regeneration） 對(duì)大多數(shù)親和層析，一步可以達(dá)到很高的純化倍數(shù)。 特異性高的親和層析洗脫只出一個(gè)峰，對(duì)親和作用選擇性較低的分離，可用梯度和階梯洗脫分

18、離目標(biāo)產(chǎn)物 親和層析的基本特點(diǎn)：（1）純化過程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高（2）特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子（3）純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高（4）必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件（5）價(jià)格相對(duì)較昂貴；（6）在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。親和色譜的配體 理想的配體應(yīng)符合下面的要求：（1）極低的非特異性吸附。（2）高度的親水性。（3）較好的理化穩(wěn)定性。（4）大量的化學(xué)基團(tuán)能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合。（5）適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。一般親和吸附劑采用的配體有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊

19、脂糖、多孔玻璃珠等。 根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specific ligand）和通用性配體（general ligand）。 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對(duì)于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實(shí)驗(yàn)。 通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各

20、種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對(duì)生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。配基的濃度：（1）對(duì)親和勢(shì)比較低的時(shí)候（Kd10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。（2）增加親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率。（3）配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難。（4）理想的配基濃度為1-10mol/L。配基偶聯(lián)的位置：（1）配基固定化時(shí)，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。（2）腺嘌呤N6-氨基接

21、到載體上，對(duì)脫氫酶和甘油激酶有吸附力。（3）磷酸基接到載體上，對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。配基分子的大?。海?）選用大分子配基。（2）小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個(gè)“手臂”以消除空間障礙。介質(zhì)活化與耦聯(lián)： 基質(zhì)的活化是指通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。常用方法：（1）溴化氰活化法（2）環(huán)氧基活化法 上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法。（1）溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨(NH2)反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。反應(yīng)如下： 這種方

22、法的缺點(diǎn)是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常會(huì)帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。（2）環(huán)氧基活化法 在熱的濃堿溶液中，多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物； 在堿性條件下，其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)。 這種活化方法的優(yōu)點(diǎn)是活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的NC、OC 和SC 鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長(zhǎng)，而且

23、便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點(diǎn)是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件，pH 為9-13，溫度為20-40。這樣的條件對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用。 常見的親和色譜：（1）核苷酸及輔酶親和色譜（2）固定化金屬離子親和色譜（3）染料親和色譜（4）免疫親和色譜（5）基團(tuán)專一性大分子親和色譜（1）核苷酸及輔酶親和色譜：指將核苷酸（或輔酶）作為親和配基固定在色譜介質(zhì)上進(jìn)行親和色譜的技術(shù)，主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質(zhì)之間的專一性識(shí)別達(dá)到分離純化目的。（2）固定化金屬離子親和色譜：蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基

24、和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，從而達(dá)到分離的目的。金屬離子如鋅和銅。將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。（3）染料親和色譜：有機(jī)染料具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)，需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)染料具有一定親和力，染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱，染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。（4）免疫親和色譜：抗原和抗體的作用具有高度的專一性, 并且它們的結(jié)合親和力極強(qiáng)。因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上, 便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。 特點(diǎn)：分離效率高，成本高，而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定，容易降解。（5）基團(tuán)專一性大分子親和色

25、譜：指用對(duì)某一類結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質(zhì)上進(jìn)行的色譜技術(shù)。例如：蛋白A親和色譜 伴刀豆球蛋白A親和色譜 肝素親和色譜親和色譜技術(shù)的應(yīng)用：（1）t-PA的純化酶的抑制劑為親和配基（2）干擾素的純化免疫親和色譜（3）脫氫酶的純化色素親和色譜（4）淀粉酶抑制劑的純化固定化金屬離子親和色譜（5）基因重組融合蛋白的純化2、親和過濾（膜分離） 將親和層析和膜過濾技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，包括親和錯(cuò)流過濾和親和膜分離。（1）親和錯(cuò)流過濾（Affinity Cross Flow Filtration：ACFF）: 是將親和層析與超濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯(cuò)流過

26、濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點(diǎn)。親和錯(cuò)流過濾過程： 基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)核表面。配基對(duì)提取的目標(biāo)物進(jìn)行專一可逆的吸附，形成復(fù)合體； 用膜對(duì)混合液進(jìn)行錯(cuò)流過濾，復(fù)合體因分子巨大可被保留，雜質(zhì)隨液體透過膜，目標(biāo)物與其它成分分離。 親和錯(cuò)流過濾特點(diǎn)：以壓差為傳質(zhì)推動(dòng)力，速度快，易于放大；純化水平可接近或達(dá)到親和色譜；制備親和過濾介質(zhì)所用的載體一般為水溶性聚合物或無(wú)孔微粒，無(wú)內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)阻力，目標(biāo)分子的親和結(jié)合速度快；與固定床型親和色譜相比，親和過濾操作中目標(biāo)分子與親和過濾介質(zhì)的接觸在全混槽中進(jìn)行，最多只能達(dá)到一級(jí)吸附平衡，相當(dāng)于色譜過程的一個(gè)理論塔板。采用多級(jí)串聯(lián)親和過濾操作可彌補(bǔ)

27、這一缺點(diǎn)。（2）親和膜分離： 親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。 將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度。 親和膜優(yōu)點(diǎn)：傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設(shè)備體積小。 親和配基固定在膜孔表面，流體在對(duì)流透過膜的過程中目標(biāo)蛋白質(zhì)與配基接觸而被吸附。 親和膜吸附原理示意圖 親和色譜操作速度有限。一般采用徑向放大的方式，才能保證色譜柱的處理量。 如果色譜柱的體積一定，降低柱高而增大柱徑即“短粗”型親和色譜柱有利于提高分離速度。3、親和萃取 利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進(jìn)行的雙水相萃取，在親和

28、配基的親和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。體系：PEG/Dextran，PEG/無(wú)機(jī)鹽 近幾年來(lái)，僅在PEG上可接的配基就有十多種，分離純化的物質(zhì)達(dá)幾十種，產(chǎn)物的分配系數(shù)成百上千倍的提高，如用磷酸酯PEG磷酸鹽雙水相體系萃取-干擾素，分配系數(shù)由原來(lái)的1左右提高到630。4、親和反膠團(tuán)萃?。╝ffinity-based reversed micellar extraction）：是指在反膠團(tuán)相中除通常的表面活性劑（如AOT）以外，添加另一種親水頭部為目標(biāo)分子的親和配基的助表面活性劑（cosurfactant），通過親和配基與目標(biāo)分子的親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在反膠團(tuán)相的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團(tuán)萃取分離的選擇性的分離方法。5、親和沉淀