第四章、藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

1、第四章第四章 藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證Quantitative Analysis and Analytical Method Validation內(nèi)容內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 定量分析方法的分類與特點(diǎn)定量分析方法的分類與特點(diǎn)第二節(jié)第二節(jié) 定量分析樣品的前處理方法定量分析樣品的前處理方法第三節(jié)第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證第二節(jié)第二節(jié) 定量分析樣品的前處理方法定量分析樣品的前處理方法一、概述一、概述 含金屬藥物含金屬藥物含鹵素藥物含鹵素藥物C-X根據(jù)所含金屬或鹵素在分根據(jù)所含金屬或鹵素在分子中結(jié)合的牢固程度，采子中結(jié)合的牢固程度，采用不同方法進(jìn)行處理

2、。用不同方法進(jìn)行處理。富馬酸亞鐵富馬酸亞鐵葡萄糖酸銻鈉葡萄糖酸銻鈉枸櫞酸鉍鉀枸櫞酸鉍鉀葡萄糖酸鋅葡萄糖酸鋅酒石酸銻鉀酒石酸銻鉀范影酸范影酸三氯叔丁醇三氯叔丁醇碘番酸碘番酸磺溴酞鈉磺溴酞鈉二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）直接測(cè)定法（一）直接測(cè)定法金屬原子不與碳直接相連的或金屬原子不與碳直接相連的或C-M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物，在水溶液中電離，可選用適當(dāng)方法直接測(cè)定。屬藥物，在水溶液中電離，可選用適當(dāng)方法直接測(cè)定。例 葡萄糖酸銻鈉葡萄糖酸銻鈉為組成不定的五價(jià)銻，采用為組成不定的五價(jià)銻，采用間接碘量法測(cè)定銻的含量。在酸性條件下反應(yīng)：間接碘量法測(cè)定銻的

3、含量。在酸性條件下反應(yīng)：Sb5+ + 2I- = Sb3+ + I2Na2S2O3CH2OHCHOHCHOCHOCHOCOO-SbOHOSbO-OCHCHCHCCHOOCH2-OOHOHONa39H2O葡萄糖酸鈣葡萄糖酸鈣EDTA滴定法測(cè)定。滴定法測(cè)定。富馬酸亞鐵富馬酸亞鐵在熱的稀硫酸中溶解，釋放出在熱的稀硫酸中溶解，釋放出Fe2+，用，用Ce(SO4)2滴定液滴定。滴定液滴定。CCHCCOOOFeOCe4+ + Fe2+ = Fe3+ + Ce3+（二）水解法（二）水解法1.酸水解法酸水解法原理原理Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe3+ NN3Fe2+ - e- -NN3Fe3+紅色

4、紅色淺藍(lán)色淺藍(lán)色OCCHOFeHCCOOOOCCHOHCCO+Fe2+十一烯酸鋅的含量測(cè)定十一烯酸鋅的含量測(cè)定十一烯酸鋅十一烯酸鋅HCl共沸共沸濾除十一烯酸濾除十一烯酸氯化鋅氯化鋅EDTA-2Na（2）堿水解法）堿水解法適用于適用于C-X（鹵素與脂肪（鹵素與脂肪C相連）相連）例：例：三氯叔丁醇含量的測(cè)定三氯叔丁醇含量的測(cè)定CCH3OHCH3CCl3CCl3- -C(CH3)2- -OH + 4NaOH 回流回流(CH3)2- -CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2ONaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCNAgSCN + NH4NO3（淡棕紅

5、色）（淡棕紅色）(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.010- -12 )Fe3+ + SCN Fe (SCN) 2+ 注意：注意：1）沉淀轉(zhuǎn)化）沉淀轉(zhuǎn)化加有機(jī)溶劑或先過(guò)濾；加有機(jī)溶劑或先過(guò)濾； 2）Fe3+的水解的水解酸性中滴定。酸性中滴定。（二）還原法（經(jīng)水解還原后測(cè)定）（二）還原法（經(jīng)水解還原后測(cè)定）鹵素鹵素芳環(huán)芳環(huán)結(jié)合牢固，需在堿性條件下結(jié)合牢固，需在堿性條件下加還原劑加還原劑回流，使回流，使C-X鍵斷裂，形成無(wú)鍵斷裂，形成無(wú)機(jī)鹵化物后測(cè)定。機(jī)鹵化物后測(cè)定。鋅粉鋅粉COOHINHCOCH3IIH3COCHN+ 11NaOH + Zn回流回流COONaN H2 H2N+ 3NaI

6、+ 2CH3COONa + 2Na2ZnO2 + H2OI- + Ag+ = AgI曙紅鈉指示劑曙紅鈉指示劑泛影酸的含量測(cè)定泛影酸的含量測(cè)定碘番酸含量的測(cè)定碘番酸含量的測(cè)定uUSP、BP、 Ch. P均采用均采用NaOH堿性條件堿性條件下用下用Zn粉還原，用粉還原，用AgNO3滴定液進(jìn)行滴定滴定液進(jìn)行滴定。u指示終點(diǎn)方法不同：指示終點(diǎn)方法不同：Ch. P： 曙紅鈉曙紅鈉USP： 四溴酚酞乙酯四溴酚酞乙酯BP： 電位法電位法IH2NIICH2CHCOOHC2H5三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法濕法破壞濕法破壞HNO3-HClO4HNO3-H2SO4H2SO4-MSO4破壞力強(qiáng)，反

7、應(yīng)激烈，注意勿蒸破壞力強(qiáng)，反應(yīng)激烈，注意勿蒸干，以免爆炸。適于生物樣品破干，以免爆炸。適于生物樣品破壞，所得無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)。壞，所得無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)。對(duì)含氮雜環(huán)藥物不適宜。對(duì)含氮雜環(huán)藥物不適宜。適于大多數(shù)有機(jī)藥物的破壞，適于大多數(shù)有機(jī)藥物的破壞，所得無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)，所得無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)，對(duì)堿土金屬藥物不適用，可對(duì)堿土金屬藥物不適用，可用用H2SO4-MSO4法。法。所得金屬離子為低價(jià)態(tài)，含碳所得金屬離子為低價(jià)態(tài)，含碳量低的藥物宜添加適量淀粉等量低的藥物宜添加適量淀粉等多碳化合物，以保證破壞過(guò)程多碳化合物，以保證破壞過(guò)程中將金屬離子轉(zhuǎn)化為低價(jià)態(tài)中將金屬離子轉(zhuǎn)化為低價(jià)態(tài)HNO3

8、-H2SO4-HClO4H2SO4-氧化劑（H2O2，KMnO4）其它濕法破壞后金屬呈高價(jià)態(tài)破壞后金屬呈高價(jià)態(tài)凱氏定氮法（凱氏定氮法（Kjeldahl Nitrogen Determination）用于含氮有機(jī)藥物的定量分析，以H2SO4-MSO4為破壞試劑，通過(guò)消解-蒸餾-滴定三步操作完成含氮藥物的定量測(cè)定。R-NH2H2SO4K2SO4(NH4)2SO4NH4HSO4NH3NaOHCuSO4NH3+ H3BO3 NH4BO2 + H2OH2SO4滴定干法破壞干法破壞1. 高溫?zé)胱品ǜ邷責(zé)胱品ǎ簩⒂袡C(jī)物置于坩堝中，加：將有機(jī)物置于坩堝中，加Ca(OH)2或無(wú)水或無(wú)水Na2CO3或或Mg(NO

9、3)2或或ZnO，先小火加熱，然后高溫灰化。先小火加熱，然后高溫灰化。n適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)藥物（如適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)藥物（如含含N雜環(huán)），以及不能用雜環(huán)），以及不能用H2SO4破壞的有機(jī)破壞的有機(jī)藥物，但不適用含揮發(fā)性金屬的有機(jī)藥物。藥物，但不適用含揮發(fā)性金屬的有機(jī)藥物。注意：本法所得灰分往往不易溶解，注意：本法所得灰分往往不易溶解，但不能丟棄。但不能丟棄。2 氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法待測(cè)元素從有機(jī)結(jié)合狀待測(cè)元素從有機(jī)結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)離子；態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)離子；用于含用于含X, S, N, Se等元素等元素的有機(jī)藥物的鑒別檢查和的有機(jī)藥物的鑒別檢查和含量測(cè)定；含量測(cè)定；裝置裝置

10、將將含有鹵素或硫等元素含有鹵素或硫等元素的有機(jī)藥物在的有機(jī)藥物在充滿充滿氧氣氧氣的的密閉密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒瓶中進(jìn)行燃燒燃燒，并將燃燒產(chǎn)物，并將燃燒產(chǎn)物吸收吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐校俨捎眠m宜的分析方于適當(dāng)?shù)奈找褐?，再采用適宜的分析方法來(lái)檢查或測(cè)定法來(lái)檢查或測(cè)定鹵素或硫等元素的鹵素或硫等元素的含量含量。2. 氧瓶燃燒測(cè)定法氧瓶燃燒測(cè)定法(Oxygen flask combustion method)（1）原理）原理2NaOHCClOHClNaCl- 點(diǎn)燃溶液適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析。 特點(diǎn)特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、破壞完全，尤其適用于簡(jiǎn)便、快速、破

11、壞完全，尤其適用于微量樣品的分析微量樣品的分析（ 2） 儀器與材料儀器與材料 儀器裝置儀器裝置 燃燒瓶為燃燒瓶為500、1000或或2000ml無(wú)色、磨口、厚壁、無(wú)色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空空心，底部熔封鉑絲一根，心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀。稱樣用材料及稱樣稱樣用材料及稱樣 A. 固體樣品固體樣品: 無(wú)灰濾紙無(wú)灰濾紙 B. 液體樣品液體樣品 : 紙袋紙袋 C. 軟膏類樣品：將適量樣品置軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測(cè)成分的不含被測(cè)成分的蠟油紙蠟油紙中包裹嚴(yán)密，中包裹嚴(yán)密，外層再用無(wú)灰濾紙包裹外層再用無(wú)灰濾紙包裹吸收液吸收液 A.

12、作用：將樣品經(jīng)燃燒分解所作用：將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)槲?，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)閱我粏我坏牡谋阌跍y(cè)定的價(jià)態(tài)便于測(cè)定的價(jià)態(tài)氧氣氧氣B. 吸收液的選擇吸收液的選擇氟氟 水水 氯氯 NaOH溶液溶液溴溴 NaOH-SO2飽和溶液飽和溶液碘碘 NaOHSO2飽和溶液飽和溶液 硫硫 H2O2 -H2O 磷磷 硝酸溶液硝酸溶液（3）操作方法）操作方法燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備 用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤(rùn)，小心急速地通入氧氣潤(rùn)，小心急速

13、地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。立即用表面皿覆蓋瓶口。樣品的準(zhǔn)備樣品的準(zhǔn)備 取樣品適量，精密稱定后按規(guī)取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。樣品的燃燒樣品的燃燒 點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（口，俟燃燒完畢（應(yīng)無(wú)黑色碎片應(yīng)無(wú)黑色碎片），充分），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置放置15min15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲

14、，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行檢查或然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行檢查或測(cè)定。測(cè)定。BrBrBrBrOSOHHOSONaOOONaOOO燃燒分解燃燒分解O2HBr + S2- + SO42- + HBr + S2- NaBr + Na2SO4 + H2O NaOH, H2O2Br- + Ag + AgBr剩余的Ag+ + SCN- AgSCN例例 磺溴酞鈉的含量測(cè)定磺溴酞鈉的含量測(cè)定 Ch.P (2010)例例 碘苯酯的含量測(cè)定碘苯酯的含量測(cè)定 Ch.P（2010）碘苯酯碘苯酯CHCH3(CH2)8COOCH2CH3I原

15、理原理 碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣铮^而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氫氧化鈉反應(yīng)，生成碘化物液中，和氫氧化鈉反應(yīng)，生成碘化物與碘酸鹽，加入與碘酸鹽，加入溴溴- -醋酸醋酸溶液，溶液，使全部使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}，過(guò)量的，過(guò)量的溴以甲酸溴以甲酸及及通通空氣去除空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點(diǎn)為終點(diǎn). .滴定

16、度的計(jì)算滴定度的計(jì)算 放大反應(yīng)放大反應(yīng)I2 + NaOHNaIO+NaI3NaIONaIO3+2NaINaI+3Br2+3H2ONaIO3 + 6HBrIO3- + 5I- - + 6H+3I2 + 3H2OI2+ 2S2O32-2I-+S4O62-1mol碘苯酯碘苯酯3 mol I2 6 molNa2S2O3反應(yīng)摩爾比為反應(yīng)摩爾比為1 60.02 416.341.388/6CMTmg mln思考題試述氧瓶燃燒法和凱氏定氮法的原理以及兩法的異同。若用氧瓶燃燒后碘量法測(cè)定泛影酸含量，每1 mLNa2S2O3滴定液（0.02 mol/L）相當(dāng)于多少毫克的泛影酸？COOHINHCOCH3IIH3CO

17、CHN泛影酸泛影酸第五章第五章 體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析一一、常用生物樣品的種類常用生物樣品的種類、采集和貯藏采集和貯藏l血樣血樣血漿血漿(plasma)血清血清(serum)全血全血(whole blood)全血全血+抗凝劑抗凝劑(肝素肝素) 離心離心 上清液上清液全血全血 離心離心 上清液上清液全血全血+抗凝劑抗凝劑(肝素肝素) 混合混合 注意注意：采血后應(yīng)盡快：采血后應(yīng)盡快(24 h)分離出血分離出血漿漿、血清，再冰凍保存血清，再冰凍保存(-20 oC).l尿液尿液(Urine)收集服藥后一定收集服藥后一定時(shí)間時(shí)間內(nèi)內(nèi)(8 h、12 h、24 h)尿樣，記尿樣，記錄體積，混勻后取一定量，

18、測(cè)定尿中藥物濃度，計(jì)錄體積，混勻后取一定量，測(cè)定尿中藥物濃度，計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)尿中藥物的累積量。算一定時(shí)間內(nèi)尿中藥物的累積量。尿中藥物濃度變化較大，其變化不能直接反映血液尿中藥物濃度變化較大，其變化不能直接反映血液中藥物濃度，因此兩者相關(guān)性較差。中藥物濃度，因此兩者相關(guān)性較差。尿中藥物以尿中藥物以原型原型、代謝物代謝物或或綴合物綴合物形式存在。主形式存在。主要用于要用于藥物劑量回收藥物劑量回收，腎清除率，代謝類型研究及，腎清除率，代謝類型研究及人群代謝分型研究。人群代謝分型研究。尿液主要成分是水尿液主要成分是水、尿素尿素、鹽類，易長(zhǎng)細(xì)菌，短期鹽類，易長(zhǎng)細(xì)菌，短期(24-36 h)保存可置保存可置

19、4 oC冷藏或加防腐劑冷藏或加防腐劑(如如甲苯、氯仿甲苯、氯仿、濃鹽酸濃鹽酸等等)，若長(zhǎng)期保存則需冷凍保存。，若長(zhǎng)期保存則需冷凍保存。l唾液唾液(Saliva)漱口漱口15 min后收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌尖在后收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌尖在口內(nèi)攪動(dòng)后流出的混合唾液，離心后取上清?？趦?nèi)攪動(dòng)后流出的混合唾液，離心后取上清。唾液采集不受時(shí)間唾液采集不受時(shí)間、地點(diǎn)限制，容易反復(fù)采地點(diǎn)限制，容易反復(fù)采集，采集時(shí)患者無(wú)痛苦。集，采集時(shí)患者無(wú)痛苦。唾液組成受各種因素影響，個(gè)體差異大，與唾液組成受各種因素影響，個(gè)體差異大，與血漿藥物濃度相比，唾液中藥物濃度變化不大，血漿藥物濃度相比，唾液中藥物濃度變化不大，且濃度

20、較低。但且濃度較低。但部分藥物在血漿中的游離藥物部分藥物在血漿中的游離藥物濃度與唾液中濃度相當(dāng)濃度與唾液中濃度相當(dāng)。因此，可由唾液中藥。因此，可由唾液中藥物濃度推斷血漿中藥物濃度。物濃度推斷血漿中藥物濃度。l組織組織l頭發(fā)頭發(fā)二、生物樣品分析前處理技術(shù)二、生物樣品分析前處理技術(shù)考慮的因素：考慮的因素：l藥物的藥物的理化性質(zhì)理化性質(zhì)（酸堿性、親脂性、揮發(fā)（酸堿性、親脂性、揮發(fā)性、性、UV吸收、穩(wěn)定性、代謝途徑等）吸收、穩(wěn)定性、代謝途徑等）l藥物濃度藥物濃度（ug、ng級(jí)）級(jí)）l樣本類型樣本類型（血、組織需除蛋白；唾液需除（血、組織需除蛋白；唾液需除黏蛋白；尿液需將綴合物水解）黏蛋白；尿液需將綴合

21、物水解）分析技術(shù)：分析技術(shù)：光譜分析（光譜分析（UV、熒光）、熒光）色譜分析（色譜分析（HPLC、GC、LC/MS、GC/MS、TLC）免疫分析（放射免疫分析法（免疫分析（放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析）、酶免疫分析法法（EIA）、）、熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（FIA）樣品處理步驟與分析方法選擇樣品處理步驟與分析方法選擇HPLC、LC/MS/MS1.沉淀蛋白沉淀蛋白2.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH血樣血樣/組織組織提取提取分離分離凈化凈化濃縮濃縮殘?jiān)鼩堅(jiān)芙馊芙馑釅A回提酸堿回提衍生化衍生化免疫分析免疫分析GC/MS光譜法光譜法去除蛋白去除蛋白l意義意義：使結(jié)合型藥物釋放出來(lái)，以測(cè)定藥物總濃度，使結(jié)

22、合型藥物釋放出來(lái)，以測(cè)定藥物總濃度，得到較得到較“干凈干凈”的提取液，消除對(duì)測(cè)定的干擾。的提取液，消除對(duì)測(cè)定的干擾。l方法：方法：u蛋白質(zhì)沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法溶劑沉淀法：溶劑沉淀法：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等中性鹽鹽析法：中性鹽鹽析法：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等磷酸鈉等強(qiáng)酸沉淀法：強(qiáng)酸沉淀法：10%三氯醋酸、三氯醋酸、6%高氯酸高氯酸熱凝固法：熱凝固法：90oC，只能除去熱凝固蛋白，只能除去熱凝固蛋白u(yù)酶水解法酶水解法蛋白水解酶（枯草菌溶素）蛋白水解酶（枯草菌溶素）綴合物（結(jié)合物）水解綴合物（結(jié)合物）水解含含羥基羥基、氨

23、基氨基、羧基羧基、巰基巰基的藥物或代謝物的藥物或代謝物與與葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸結(jié)合成苷，與結(jié)合成苷，與硫酸硫酸結(jié)合成酯。結(jié)合成酯。這些綴合物的極性較母體大，親水性強(qiáng)，不這些綴合物的極性較母體大，親水性強(qiáng)，不易被有機(jī)溶劑提取，需水解處理。易被有機(jī)溶劑提取，需水解處理。方法：方法：酸水解酸水解：簡(jiǎn)便、快速，但專一性差；簡(jiǎn)便、快速，但專一性差；酶水解酶水解：-葡糖糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或兩葡糖糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或兩者的混合酶；者的混合酶；溶劑水解溶劑水解分離、凈化和濃集分離、凈化和濃集u提取法提取法：液：液-液提取、液液提取、液-固提取固提取 液液-液提取液提?。哼x與水不相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)：選與水不

24、相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。行提取。 提取的關(guān)鍵性問(wèn)題：提取的提取的關(guān)鍵性問(wèn)題：提取的選擇性選擇性和提取和提取率的率的重復(fù)性重復(fù)性。影響提取的因素主要有：影響提取的因素主要有：水相水相pH、提取溶、提取溶劑、離子強(qiáng)度劑、離子強(qiáng)度。液液-固提取固提取固相萃取固相萃取 (solid phase extraction, SPE)固相柱種類（固相柱種類（C-8，C-18，離子交換等），離子交換等）規(guī)格（填料量、體積）規(guī)格（填料量、體積）形狀（針筒型、子彈型）形狀（針筒型、子彈型）固相萃取步驟（以反相柱為例）固相萃取步驟（以反相柱為例） 活化活化：6-10倍體積的甲醇或乙腈潤(rùn)洗填料，使倍體積的甲醇或乙腈潤(rùn)

25、洗填料，使其溶劑化；其溶劑化；6-10倍體積的水或緩沖液沖洗柱子，倍體積的水或緩沖液沖洗柱子，使其達(dá)到良好的吸附分離狀態(tài)；使其達(dá)到良好的吸附分離狀態(tài)； 上樣上樣：將樣品加到柱子上，用抽真空或加壓：將樣品加到柱子上，用抽真空或加壓的方法，讓樣品緩緩?fù)ㄟ^(guò)萃取柱。的方法，讓樣品緩緩?fù)ㄟ^(guò)萃取柱。 凈化分離凈化分離：用適當(dāng)溶劑洗滌，使感興趣化合：用適當(dāng)溶劑洗滌，使感興趣化合物保留在柱子上，洗除雜質(zhì)，達(dá)到凈化目的。物保留在柱子上，洗除雜質(zhì)，達(dá)到凈化目的。 洗脫洗脫：改變洗脫劑的極性：改變洗脫劑的極性 和（或）和（或）pH，使待，使待測(cè)物從柱上解吸，收集洗脫液。測(cè)物從柱上解吸，收集洗脫液。SPE示意圖示意圖

26、 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1. 引入雜質(zhì)少引入雜質(zhì)少 2. 提取效率高，可用少量生物樣品進(jìn)行分析提取效率高，可用少量生物樣品進(jìn)行分析 3. 不會(huì)形成乳化現(xiàn)象不會(huì)形成乳化現(xiàn)象 3. 處理樣品速度快處理樣品速度快 4. 安全、價(jià)廉安全、價(jià)廉 5. 萃取操作可在室溫進(jìn)行，適于處理?yè)]發(fā)性及萃取操作可在室溫進(jìn)行，適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。被測(cè)組分的濃集被測(cè)組分的濃集直接吸出適量供分析直接吸出適量供分析 尖底試管，加入小體積的、比重大的有機(jī)溶劑尖底試管，加入小體積的、比重大的有機(jī)溶劑揮去提取溶劑法揮去提取溶劑法l氮?dú)饬鞔蹈煞ǖ獨(dú)饬鞔蹈煞ǎ哼m用于不易揮發(fā)的藥物：適用于不易揮發(fā)的藥物l減壓法減壓

27、法：適用于易揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物：適用于易揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物化學(xué)衍生化化學(xué)衍生化目的目的 增加被測(cè)組分的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性（增加被測(cè)組分的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性（GC）減少被測(cè)組分在樣品處理過(guò)程中因吸附強(qiáng)而減少被測(cè)組分在樣品處理過(guò)程中因吸附強(qiáng)而導(dǎo)致的損失；導(dǎo)致的損失；改善被測(cè)組分的色譜行為；改善被測(cè)組分的色譜行為； 增加被測(cè)組分的檢測(cè)靈敏度和選擇性增加被測(cè)組分的檢測(cè)靈敏度和選擇性提高光學(xué)異構(gòu)體的分提高光學(xué)異構(gòu)體的分離的能力離的能力 方法：方法： GC：硅烷化、?；?、烷基化：硅烷化、?；?、烷基化HPLC：熒胺、丹酰氯、鄰苯二醛：熒胺、丹酰氯、鄰苯二醛三、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證三、體內(nèi)樣品分析方

28、法與方法驗(yàn)證（1）特異（專屬）性（）特異（專屬）性（Specificity）：）：樣品中樣品中含有其他共存物質(zhì)時(shí)，該法定量測(cè)定被測(cè)物的能力。含有其他共存物質(zhì)時(shí)，該法定量測(cè)定被測(cè)物的能力。在生物樣品分析中主要考察：代謝物、內(nèi)源在生物樣品分析中主要考察：代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)，同時(shí)服用藥物的干擾，以及在性物質(zhì)，同時(shí)服用藥物的干擾，以及在LC/MS測(cè)定中的介質(zhì)效應(yīng)。測(cè)定中的介質(zhì)效應(yīng)。HPLC要求提供：要求提供： 空白生物樣品色譜圖；空白生物樣品色譜圖； 空白生物樣品空白生物樣品+對(duì)照物質(zhì)的色譜圖；對(duì)照物質(zhì)的色譜圖； 用藥后的生物樣品色譜圖。用藥后的生物樣品色譜圖。（2）線性）線性范圍范圍與與校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)

29、曲線線性線性是指藥物濃度與響應(yīng)值的相關(guān)性，用回是指藥物濃度與響應(yīng)值的相關(guān)性，用回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)，一般歸方程來(lái)評(píng)價(jià)，一般r0.99。線性范圍線性范圍：標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍。在線：標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍。在線性范圍內(nèi)供試品濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)要求性范圍內(nèi)供試品濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)要求的精確度與準(zhǔn)確度。（偏差在的精確度與準(zhǔn)確度。（偏差在15%以內(nèi)）以內(nèi)） 偏差%=回歸值-標(biāo)示值標(biāo)示值100%至少用至少用6個(gè)濃度個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)，線性范圍能待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì)，線性范圍能覆蓋全部待測(cè)濃度，覆蓋全部待測(cè)濃度，不允許外推不允許外推，標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線曲

30、線不包括零點(diǎn)不包括零點(diǎn)。(3) 精密度精密度(precision)與準(zhǔn)確度與準(zhǔn)確度(accuracy)l選擇選擇高、中、低高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，同三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。l低濃度在定量下限的低濃度在定量下限的3倍內(nèi)倍內(nèi)，高濃度接近，高濃度接近標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，中間選一個(gè)濃度，一般要求標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，中間選一個(gè)濃度，一般要求每個(gè)濃度每個(gè)濃度n5。l日內(nèi)、日間精密度用日內(nèi)、日間精密度用RSD表示，一般表示，一般15%，定量下限這一點(diǎn)定量下限這一點(diǎn)20%。l準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度:表示測(cè)得濃度與真實(shí)濃度的接近程度，表示測(cè)得濃度與真實(shí)濃度的接近程度，用用回收率回收率（recovery）表示，一般應(yīng)在）表示，一般應(yīng)在85-115%之間，定量下限附近在之間，定量下限附近在80-120%之間。之間。（4）定量下限）定量下限Lower Limit of Quantification, LLOQ是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的是