實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

1、熒光定量熒光定量PCR技術(shù)技術(shù) 生化教研室生化教研室研究生實(shí)驗(yàn)研究生實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握熒光定量掌握熒光定量PCR的原理的原理 熟悉熒光定量熟悉熒光定量PCR的操作步驟。的操作步驟。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 ABI Prism7500型熒光定量型熒光定量PCR儀儀 7500功能一覽：功能一覽： 絕對(duì)定量絕對(duì)定量(Absolute Quantification) 自動(dòng)計(jì)算基線、閾值、自動(dòng)計(jì)算基線、閾值、CT值、濃度、百分值、濃度、百分比比 相對(duì)定量相對(duì)定量(Relative Quantification) 等位基因分型等位基因分型(Allelic Discrimination)

2、陰陽性鑒定陰陽性鑒定(Plus/Minus with IPC)實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)原理技術(shù)原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可對(duì)特定核苷酸）可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定可通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記性分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量分析。無論定后的光密度掃描來進(jìn)行定量分析。無論定性還是定量分析，分析的都是性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。終產(chǎn)物。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過對(duì)通過對(duì)PCR

3、擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反反應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖 三、三、四、四、五、實(shí)時(shí)熒光定量五、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 六、思考題六、思考題 1. 熒光定量熒光定量PCR的應(yīng)用。的應(yīng)用。 2. 使用使用SYBR Green I作熒光染料，作熒光染料，如何提高熒光定量如何提高熒光定量PCR結(jié)果可靠結(jié)果可靠性？性？七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告