分子生物學第五章---DNA分子基本操作技術

1、第五章第五章 DNADNA分子基本操作技術分子基本操作技術1220132013年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 北京時間10月7日下午5點30分，美國、德國三位科學家詹姆斯-E.羅斯曼、蘭迪-W.謝克曼及托馬斯-C.蘇德霍夫因在細胞內運輸系統(tǒng)領域的新發(fā)現(xiàn)而獲得今年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。諾獎委員會說，三人發(fā)現(xiàn)了細胞囊泡交通的運行與調節(jié)機制。3 膜融合的發(fā)現(xiàn)表明蛋白質和其他物質可以在細胞內和細胞間進行傳遞，細胞可以用這一過程來阻止它們的活動并且避免混亂。這一突破性發(fā)現(xiàn)解釋了為什么胰島素釋入血液時會有變化、神經細胞之間的信息傳達，以及病毒感染細胞的方式。4 生物體內細胞的正常運轉有賴于讓

2、合適的分子在合適的時間抵達合適的位置。一部分分子，如胰島素，需要被轉運出細胞之外，而其他分子則需要被在細胞內部進行運輸。細胞內部產生的分子被包裹于囊泡之中（圖中藍色表示），但是這些囊泡具體是如何達成這種精準的運輸?shù)?？這一點一直沒有被理解。5 Randy W. Schekman發(fā)現(xiàn)基因控制下的蛋白質在這種囊泡運輸機制中起到重要作用。正如這里的圖上所展示的那樣，通過對比正常酵母菌細胞（左）和轉運機制缺陷的細胞（右），他成功識別出操控這一轉運過程的基因。6 James E. Rothman發(fā)現(xiàn)一種蛋白質化合物（圖中橘色表示）可以讓囊泡實現(xiàn)與目標細胞膜的融合。囊泡上的蛋白質物質會與目標細胞膜上的特定蛋

3、白質之間發(fā)生結合，從而讓囊泡可以在正確的位置上釋放其所運載的特殊“分子貨物”。7 Thomas C. Sdhof研究了大腦中神經細胞之間是如何互相傳遞信號的，以及鈣離子在這一過程中所起的作用。他識別出一種分子機制（圖中用紫色表示），其可以對進入的鈣離子發(fā)生反應并觸發(fā)囊泡融合，從而解釋了囊泡輸運機制中時間的精確性是如何達成的，以及其所攜帶的信號分子物質是如何能做到受控釋放。8約翰約翰. .戈登戈登 山中伸彌山中伸彌獲獎理由：獲獎理由：發(fā)現(xiàn)成熟細胞可被重編程變?yōu)槎嗄苄?20122012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎第五章第五章 DNADNA分子基本操作技術分子基本操作技術10從20世

4、紀中葉開始，分子生物學研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術的進步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術。11本章內容本章內容 第一節(jié) 核酸凝膠電泳技術 第二節(jié) 核酸分子雜交 第三節(jié) PCR 第四節(jié) 轉化 第五節(jié) 基因組文庫構建 第六節(jié) RNA操作技術 第七節(jié) 基因克隆12 一、常規(guī)電泳 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 二、脈沖凝膠電泳第一節(jié)第一節(jié) 核酸凝膠電泳技術核酸凝膠電泳技術13一、常規(guī)電泳一、常規(guī)電泳自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核

5、酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視?；驹恚荷锎蠓肿釉谝欢╬H條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)。根據分子大小、構型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種

6、成分彼此分離。14 在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔1516171、瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝

7、膠電泳是一種簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據瓊溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的快速連接等181 1）凝膠濃度選擇）凝膠濃度選擇瓊脂糖濃瓊脂糖濃度度(%)線型線型DNA分子的分分子的分離范圍離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍19 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越

8、高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 2 2）電泳緩沖液）電泳緩沖液 常用三種緩沖液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價格較便宜。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產物降解201010TBETBE緩沖液的配制緩沖液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH應為8.08.2 臨用時

9、用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）213 3）核酸電泳的指示劑）核酸電泳的指示劑 指示劑：溴酚蘭二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠濃度膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb22核酸電泳的指示劑核酸電泳的指示劑 二甲苯青：水溶液呈蘭色 電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率遷移率2Kb1.6Kb234 4）載樣緩沖液）載樣緩沖液 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液 作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電

10、泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便24 溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖 凝 膠 電 泳 中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。255 5）核酸電泳的染色劑）核酸電泳的染色劑在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidium bromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結合溴化乙錠的在紫外線的照射下結合溴化乙錠的DNADNA分子發(fā)出熒光分

11、子發(fā)出熒光26瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間27稱樣溶解加熱制板倒膠6 6）核酸電泳操作基本程序）核酸電泳操作基本程序28取樣點樣電泳檢測核酸電泳操作基本程序核酸電泳操作基本程序29結果結果30根據標準DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小31Agarose gel electrophoresis322 2、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離33聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙

12、烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間34聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和過硫酸銨（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的351 1）不同濃度丙烯酰胺和）不同濃度丙烯酰胺和DNADNA有效分離范圍有效分離范圍 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）溴酚蘭溴酚蘭*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0

13、604004516012.040200307015.025150156020.0101001245362 2）材料）材料 電泳儀器： 電泳儀 垂直電泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亞甲基雙丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml裝于棕色瓶內，4可保存二個月372）材料）材料 10%過硫酸銨 過硫酰銨，1克，加水至 10 ml4可保存一周，-20可保存一個月 1TBE電泳緩沖液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）383 3）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 配膠：根據分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃

14、板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出 將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角 按表配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù) 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止39 立即插入適當?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10角，可減少液體泄漏的機會 室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1TBE緩沖液40 小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規(guī)則的表面，將導致以后DNA電泳帶型不規(guī)則

15、 將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內，加樣時不要產生氣泡41 接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳 電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，1530min后取出水洗，紫外儀下觀察結果 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）4243電泳結果分析電泳結果分析 DNA MarkerDNA Marker DNA DNA 人工片段人工片段 100 bp ladder100 bp ladder44酶切分析酶切分析 根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶進行酶

16、切 酶切產物電泳分離后，獲得符合理論的片段 此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究4546PCR-RFLP46二、脈沖凝膠電泳二、脈沖凝膠電泳(PFGE)(PFGE) 普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。超過一定大小的線狀DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（50Kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關，在常規(guī)電泳凝膠中彼此擠壓，形成單一DNA遷移帶。1984年Schwartz和Cantor首次利用脈沖凝膠電脈沖凝膠電泳（泳（pulsed-field gel electrophoresi

17、s, PEGE ）解決了這一問題。4748PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小，小分子小分子DNA比大分子比大分子DNA更容易在凝膠中重新定位更容易在凝膠中重新定位，因而遷移速度更快。該法可分離長至10Mb的DNA分子。B+A-+A-B49A-+AB-+B正交交變電泳凝膠電泳(OFAGE)電場逆轉凝膠電泳(FIGE)夾角等值均一電場(CHEF)旋轉膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+PEGE類型50影響PFGE分辨率

18、的因素1、脈沖時間（脈沖時間（0.1s-1000s）：）：增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。2、電壓：、電壓：若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導致較小片段泳動的紊亂。3、電場夾角：、電場夾角：電場方向的夾角常為110O - 120O，研究證實90O夾角也非常有效。4、溫度：、溫度：標準瓊脂糖電泳基本在室溫進行，PFGE一般應在4進行。較高的溫度DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。51第二節(jié)第二節(jié) 核酸分子雜交核酸分子雜交核酸分子雜交技術，是在1968年由華盛頓卡內基學院（Cavnegie Ins

19、titute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。 52核酸的分子雜交核酸的分子雜交 將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。53 不同溫度下DNA的構型變化一54 不同溫度下DNA的構型變化二55 雜種核酸分子：雜種核酸分子： 彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用 檢測

20、特定生物有機體之間的親源關系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。56一、核酸雜交常用幾種膜的性能比較一、核酸雜交常用幾種膜的性能比較571 1、硝酸纖維素膜、硝酸纖維素膜 不能滯留小于150bp的DNA片段，不能同RNA結合。 改進：應用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片段DNA的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結合到膜上。58 尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。利用的是毛細管作用 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標記的DNA/RNA進行雜交。

21、592 2、SouthernSouthern（薩瑟恩）（薩瑟恩）DNADNA印跡印跡雜交雜交 根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E. Southern于1975年首先設計出來的，故又叫Southern DNA 印跡轉移技術。 60SouthernSouthern印跡分析基本流程印跡分析基本流程濾紙NC膜凝膠濾紙電泳電泳 轉移轉移 雜交，顯影雜交，顯影酶切酶切DNADNA樣品上樣樣品上樣 DNADNA印跡印跡重物緩沖液61雜交模式

22、圖雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉移探針雜交62Southern 雜交(Southern bloting)的主要步驟 待測DNA樣品的制備、酶切 待測DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳 凝膠中DNA的變性：堿變性 Southern轉膜： 硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜 毛細管虹吸印跡法、電轉印法、真空轉移法 探針的制備 Southern雜交 雜交結果的檢測6364（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝膠轉移凝膠轉移雜交技術雜交技

23、術656667Southern DNA Southern DNA 印跡雜交之印跡雜交之X X光顯像圖片光顯像圖片 水稻（水稻（Oryza sativa LOryza sativa L.) .)的葉綠體的葉綠體DNADNA分別用核酸內切限制酶分別用核酸內切限制酶Bgl(A-C)Bgl(A-C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、和）、和HindHind（J-LJ-L）消化，加樣在含有）消化，加樣在含有EtBrEtBr染料的染料的1%1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同3232P P標記的玉米標記的玉米psbApsbA探

24、針作探針作SouthernSouthern雜交。雜交。X X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶 ，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbApsbA基因序列?；蛐蛄?。68Southern BlottingSouthern Blotting的過程的過程1.1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNADNA2.2.通過電泳液的移動轉移膠中的通過電泳液的移動轉移膠中的DNADNA3.3.固定膠中的固定膠中的DNADNA4.4.預雜交和雜交（放射性和熒光檢測）預雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.5.結果檢測結果檢測69 在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射

25、自顯影技術在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每帶電泳條帶僅含有，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術，雖，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為安全。然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為安全。常用的熒光染料：常用的熒光染料：C5、C3等等703 3、諾賽恩、諾賽恩RNARNA印跡技術（印跡技術（Northern Northern blottingblotti

26、ng）1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術（Northern blotting）。 而將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應，這種技術叫做韋斯頓蛋白質雜交技術（Western blotting）。71 1、Northern blot基本原理和基本過程與 Southern blot基本相同 2、用于鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣

27、品為總RNA或mRNA72Northern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點印跡的不同點 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理，Southern 印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA73Step 1. Antibody Recognitionof target protein/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color Development744 4、斑點

28、印跡雜交和狹線印跡雜交、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點印跡雜交（dot blotting）和狹線印跡雜交（slot blotting ）是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種類似的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術更適應于核酸樣品的定量檢測。75 1、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量76斑點印跡雜交斑點印跡雜交 將RNA或DNA直接點樣

29、于NC膜或尼龍膜上，可做半定量分析 優(yōu)點：簡單、快速、可同時檢測多個樣品 一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。 DNA斑點雜交 RNA斑點雜交 完整細胞斑點雜交7778（1 1）DNADNA斑點雜交：斑點雜交： 先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。 將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點 5l(210g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2 2）

30、RNARNA斑點雜交：斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10g總RNA（經酚/ 氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5l DEPC水，加5l 甲醛/SSC緩沖液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然 后取5-8l點樣于處理好的濾膜上，烘干。（3 3）完整細胞斑點雜交：）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標

31、本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。 794 4、菌落雜交、菌落雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。 鑒定重組子。80檢測重組體克隆的菌落雜交技術81821）定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據檢測物分細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA

32、雜交83 保持組織細胞的形態(tài) 對核酸無抽提、修飾與降解作用 不改變核酸在組織細胞內的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用 理化性質穩(wěn)定 2）雜交過程：（1）組織或細胞的固定 理想固定液應具備：84（2）組織細胞雜交前的預處理 去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質 組織細胞內的核酸與蛋白質結合成核酸蛋白復合體 控制消化時間，避免細胞結構破壞和核酸從載玻 片上脫落85（3）探針的選擇與標記 以獲得最好雜交效果為依據選擇探針 探針的長度一般為50300bp ,有時達1.5kb 放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結果分辨率高，但信號

33、檢測時間長 非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察86（4）雜交 雜交液體積?。?020l cDNA和RNA探針雜交溫度約為50 雜交時間:DNA探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使DNA變性 沖洗溫度一般 不超過50 87（5）雜交結果檢測 所用探針為核素標記,放射自顯影檢測 所用探針為非核素標記,比色或化學發(fā)光檢測8889直接法熒光原位雜交原理89熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）90 5 5、蛋白質、蛋白質/DNA/DNA、蛋白質、蛋白質/RNA/RNA雜交技術雜交技術91又叫D

34、NA遷移率變動實驗（DNA mobility shift assay），也稱作Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。 原理： DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。92凝膠阻滯實驗的基本原理圖凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標記的放射性標記的DNADNA由于同一種細胞蛋白質由于同一種細胞蛋白質B B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自

35、顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影凝膠電泳放射性標記的DNA細胞蛋白質提取物蛋白質與DNA結合BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合93 不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片段結合的蛋白質分子 而且可以研究發(fā)生此種結合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）94(a)(b) (c) 在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質結合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶

36、消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。蛋白質與未蛋白質與未標記的競爭標記的競爭DNA結合結合凝膠電泳凝膠電泳放射自顯影放射自顯影蛋白質與標蛋白質與標記的探針記的探針DNA結合結合95 可以間接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。 1. 用具有已知轉錄因子結合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉錄因子 2. 在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。96 凝膠阻滯實驗能揭示在體內發(fā)生的DNA與蛋白質之間的相互作用的有關信息，但無法確定兩者結合的準確部位。而足跡實驗可以解決這個問題97

37、足跡實驗足跡實驗（footprintingfootprinting assay assay） 是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。9832p1 5 101 5 101 4 8 101 4 8 10加入蛋白質X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510A BA B足跡足跡(a)(c)(b)DNaseI DNaseI 足跡實驗足跡實驗99 如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我

38、們也可以加入非標記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據此測定其核苷酸序列的特異性。 100 硫酸二甲酯（DMS）足跡實驗： DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，六氫吡啶會對甲基化的G殘基作特異的化學切割。 而與蛋白結合的DNA片段上的G殘基，不會被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片段，出現(xiàn)了空白區(qū)。101甲基化干擾實驗（甲基化干擾實驗（methyltion interference assaymethyltion interference assay）根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異

39、切割甲基化的G殘基這一原理，設計出了另一種研究DNA與蛋白質相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。DMS化學干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。 102凝膠電泳凝膠電泳和和1034 4、體內足跡實驗、體內足跡實驗me硫酸二甲酯分離分離DNA并用并用六氫吡啶切割六氫吡啶切割應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗應用甲基化保護作用進行

40、的體內足跡實驗104105基因芯片發(fā)展歷史基因芯片發(fā)展歷史106轉錄組學的研究方法轉錄組學的研究方法DNA芯片技術芯片技術107基因芯片技術流程 一、PCR技術原理 二、PCR技術主要類型 三、PCR技術主要應用第三節(jié)第三節(jié) 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應108Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction聚合酶鏈式反應，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。一、一、PCRPCR技術原理技術原理109（一）（一）PCRPCR技術簡史技術簡史DNA

41、的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長110PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物111PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

42、35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶112PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明19711971年，年，KhoranaKhorana提出：經過提出：經過DNADNA變變性，與合適引物雜交，用性，與合適引物雜交，用DNADNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆克隆tRNAtRNA基因。基因。但由于測序和引物合成的困難，以但由于測序和引物合成的困難，以及及7070年代基因工程技術的發(fā)明使克年代基因工程技術的發(fā)明使克

43、隆基因成為可能，所以，隆基因成為可能，所以，KhoranaKhorana的的設想被人們遺忘了設想被人們遺忘了113PCR技術簡史DNA的復制聚合酶鏈反應的發(fā)明19851985年，美國年，美國PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人發(fā)明了聚等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（合酶鏈反應（PCRPCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的基本原理是在試管中模擬細胞內的DNADNA復制復制最初采用最初采用E-coliE-coli DNA DNA聚合酶進行聚合酶進行PCRPCR，由于該酶，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱耐熱DNAD

44、NA聚合酶的應用使得聚合酶的應用使得PCRPCR能高效率的進行，能高效率的進行，隨后隨后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一臺公司推出了第一臺PCRPCR自動化熱循自動化熱循環(huán)儀環(huán)儀19931993年，年，MullisMullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎等因此項技術獲諾貝爾化學獎114 PCR的發(fā)明人，一般公認是穆里斯（K. Mullis），他獲得了1993年的諾貝爾化學獎。穆里斯在許多作品中，包括1990年在科學美國人上的一篇文章，及1998年的自傳心靈裸舞（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR這個構想的起源。115“頓悟頓悟” 那是在

45、1983年春天的一個周五晚上，他開車帶著女友前往鄉(xiāng)間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復復制的景像，在他的腦海里冒了出來。穆里斯原以為這樣簡單的想法，應該有人提出過，但搜索文獻后卻發(fā)現(xiàn)沒有。116PCRPCR技術的發(fā)明技術的發(fā)明 PCRPCR的發(fā)明是的發(fā)明是DNADNA操作技術的革命操作技術的革命 美國美國MullisMullis教授教授 開汽車時的聯(lián)想開汽車時的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路逶迤崎嶇的山路 行駛的汽車行駛的汽車 19881988年發(fā)明了年發(fā)明了PCRPCR技術技術 19931993年獲諾貝爾年獲諾貝爾獎獎117118 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項

46、重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。119 國內復旦大學 1988 年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫(yī)學科學院馬立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自動裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC51A/B 型 DNA 熱循環(huán)儀體積小，造型美觀，價格適宜，操作簡單，尤為適宜國內應用。120 PCR 發(fā)明不到 10 年，卻已獲得廣泛應用。目前，每年都有上千篇文章 發(fā)表。1991 年，期刊“PCR 方法與應用”（PCr Methods and Application）在美國創(chuàng)刊，使有關學者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。PCR 技術作為一種

47、方法學革命，必將大大推動分子生物學各有關學科的研究，使其達到一個新的高度。121 1993 年度諾貝爾化學將已于 10 月 13 日揭曉，Kary Mullis 因發(fā)明了“聚合酶鏈式反應”而獲得此殊榮。現(xiàn)在世界各地都在使用 PCR 檢測病人血液中的微量遺傳物質，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學院說：“PCR 方法已經廣泛應用于生物醫(yī)學中。該方法同 DNA 測序法結合起來很可能將成為研究動植物分類學的一種革新工具。”一名加拿大籍英國科學家Michael Smith 因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與 Mullis 同享此榮。122引物引物引物引物123()40

48、50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20124125（二）（二）PCRPCR的基本原理的基本原理 類似于DNA的體內復制。首先將待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復。126127PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePCRP

49、CR原理示意圖原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；128PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；129PCR

50、 Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板- -引物引物結合物在結合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP為反應原為反應原料，靶序列為模料，靶序列為模板，按堿基配對板，按堿基配

51、對與半保留復制原與半保留復制原理，合成一條新理，合成一條新的與模板的與模板DNA DNA 鏈。鏈。130End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一每完成一個循環(huán)需個循環(huán)需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時小時就能將待就能將待擴目的基擴目的基因擴增放因擴增放大幾百萬大幾百萬倍。倍。131Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266

52、4201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon132（三）（三）PCRPCR反應反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應條件：10X10X緩沖液緩沖液 10 10 L L4 4種種dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol

53、100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L133PCRPCR儀儀134PCRPCR反應反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點1351234522557294時間（min）溫度（）PCRPCR反應反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍136模板DNA95137PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的

54、特點50引物1引物2DNA引物138PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶139PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第1輪結束第2輪開始140PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaq141PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第2輪結束142PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+

55、x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 143PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高靈敏度高1. 1. 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級擴增到微克量級擴增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平水平2. 2. 能從能從100100萬個細胞中檢出一個靶細胞萬個細胞中檢出一個靶細胞3. 3. 病毒檢測的靈敏度可達病毒檢測的靈敏度可達3 3個個RFURFU（空斑形成單位）（空斑形成單位）4. 4. 細菌檢測的最小檢出率為細菌檢測的最小檢出率為3 3個細菌個細菌簡便、快速簡便、快速1. 1. 一次性加好反應液，一次性加好反應液，2 24 4 小

56、時完成擴增小時完成擴增2. 2. 擴增產物一般用電泳分析擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低對標本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提組織的粗提DNADNA144標準的標準的PCRPCR反應體系反應體系 10擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙蒸水至 100ul（四）（四）PCRPCR反應體系反應體系1451 1、PCRPCR反應五要素（反應成分）反應五要素

57、（反應成分）1) 引物（primers）2) 酶 （Taq DNA polymerase） 3) dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4) 模板 （template） 5) Mg2+ （magnesium）1461 1）引物）引物理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈作引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增147引物設計的原則引物設計的原則引物長度： 15-30bp，常用為20mer左右 引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74），不能保證PCR擴增產物特異性引物擴增跨度：以500bp為

58、宜 特定條件下可擴增長至10kb片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列148引物設計的原則引物設計的原則避免引物內部出現(xiàn)二級結構 避免兩條引物間互補， 特別是 3端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性擴增條帶引物3端的堿基要求嚴格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗引物中有或能加上合適的酶切位點 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處引物設計的原則引物設計的原則引物的特異性： 引物應與核酸序列數(shù)據庫的其它

59、序列無明顯同源性引物量： 每條引物的濃度0.2 1umol，以最低引物量產生所需結果為佳 引物濃度偏高會導致錯配和非特異性擴增，且又增加引物之間形成二聚體的機會150GenBank網址：網址： 使用使用Blast程序，輸入引物序列，等待結果報告程序，輸入引物序列，等待結果報告151引物設計網址引物設計網址/cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi152 DNAstar Primer premierSoftware for primer design依靠經驗直接設計依靠

60、經驗直接設計1532）酶及其濃度）酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應 天然酶：從嗜熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成 一個典型的 PCR反應約需酶量 2.5U（指總反應體積為100 ul時） 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少1543）dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應相等 濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量則降低反應產量 dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。1554 4）模板）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA