抗體制備過(guò)程

1、單克隆抗體制備過(guò)程單克隆抗體制備過(guò)程臨床獸醫(yī)系:吳黎明學(xué)號(hào)：08302110124l單抗技術(shù)的基本原理單抗技術(shù)的基本原理l 小鼠骨髓瘤細(xì)胞能在動(dòng)物體外無(wú)限繁殖小鼠骨髓瘤細(xì)胞能在動(dòng)物體外無(wú)限繁殖和分泌無(wú)抗體活性的免疫球蛋白，而免疫和分泌無(wú)抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細(xì)胞具有產(chǎn)生抗體的能力，但不能小鼠脾細(xì)胞具有產(chǎn)生抗體的能力，但不能無(wú)限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體，可通過(guò)無(wú)限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體，可通過(guò)有限稀釋法經(jīng)篩選培育成由單個(gè)細(xì)胞增殖有限稀釋法經(jīng)篩選培育成由單個(gè)細(xì)胞增殖而成的克隆株。該克隆株如不發(fā)生變異，而成的克隆株。該克隆株如不發(fā)生變異，就可大批量的生產(chǎn)高特異性和高純度的單就可大批量的

2、生產(chǎn)高特異性和高純度的單抗?？?。l單克隆抗體的優(yōu)越性單克隆抗體的優(yōu)越性l1. 目的性明確目的性明確 l 人們可以在動(dòng)物體內(nèi)或體外按自己的人們可以在動(dòng)物體內(nèi)或體外按自己的需要生產(chǎn)不同類型的單抗。任何抗原、半需要生產(chǎn)不同類型的單抗。任何抗原、半抗原，包括各種細(xì)菌、病毒、激素、酶類、抗原，包括各種細(xì)菌、病毒、激素、酶類、氨基酸序列、核酸，還有其它異體蛋白或氨基酸序列、核酸，還有其它異體蛋白或糖蛋白等均可以用來(lái)免疫動(dòng)物，利用雜交糖蛋白等均可以用來(lái)免疫動(dòng)物，利用雜交瘤技術(shù)獲得相應(yīng)的單抗。瘤技術(shù)獲得相應(yīng)的單抗。l 2. 特異性高特異性高l 單抗是針對(duì)某一種特定抗原或抗原上特定決定簇制單抗是針對(duì)某一種特定抗

3、原或抗原上特定決定簇制備的，與其它抗原無(wú)交叉反應(yīng)性。與其它常規(guī)免疫備的，與其它抗原無(wú)交叉反應(yīng)性。與其它常規(guī)免疫血清相比，單抗的特異性高、效價(jià)高、質(zhì)地均一，血清相比，單抗的特異性高、效價(jià)高、質(zhì)地均一，便于精制濃縮，應(yīng)用單抗可以提高檢測(cè)方法的敏感便于精制濃縮，應(yīng)用單抗可以提高檢測(cè)方法的敏感性和特異性。同時(shí)，他又可作為提純抗原、制備疫性和特異性。同時(shí)，他又可作為提純抗原、制備疫苗、生產(chǎn)生物制劑和用于基礎(chǔ)研究的重要手段。苗、生產(chǎn)生物制劑和用于基礎(chǔ)研究的重要手段。l 3 .生產(chǎn)簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化 l 一旦選育成功一株高效價(jià)的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定一旦選育成功一株高效價(jià)的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒

4、定合格后可置液氮中長(zhǎng)期保存。如不發(fā)生變異，染色合格后可置液氮中長(zhǎng)期保存。如不發(fā)生變異，染色體不丟失，就可長(zhǎng)久源源不斷的大批生產(chǎn)高特異性體不丟失，就可長(zhǎng)久源源不斷的大批生產(chǎn)高特異性和高純度的單抗和高純度的單抗單克隆抗體制備示意圖單克隆抗體制備示意圖一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備 l ( (一一) )免疫方案免疫方案l 選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的高質(zhì)量的McAbMcAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同免疫方案開始初次免疫，免疫

5、方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。而定。l 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。完全佐劑，福氏不完全佐劑。l 要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。包水的狀態(tài)。l 初次免疫初次免疫 AgAg1 150g50g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射l ( (一般一般0.80.81ml1ml0.2ml0.2ml點(diǎn)點(diǎn)) )l 33

6、周后周后l 第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ipip) )l (ip(ip劑量不宜超過(guò)劑量不宜超過(guò)0.5ml)0.5ml)l 33周后周后l 第三次免疫劑量同上，不加佐劑，第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ipipl (5 (57 7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果) )l 223 3周后周后l 加強(qiáng)免疫，劑量加強(qiáng)免疫，劑量5050500g500g為宜，為宜，ipip或或iv(iv(靜脈內(nèi)注射靜脈內(nèi)注射) )l 33天后天后l 取脾融合取脾融合l( (二二) )飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞l在制備單克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)在制備單

7、克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。是十分必要的。l 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備l 小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠小鼠610周齡周齡l l 拉頸處死浸泡于拉頸處死浸泡于75酒精，消毒酒精，消毒35分鐘分鐘l l 用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜l l 用無(wú)菌注射器注入用無(wú)菌注射器注入68ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液l l 反復(fù)沖洗，吸出沖洗液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液l

8、l 放入放入10ml離心管，離心管，1200轉(zhuǎn)分離心轉(zhuǎn)分離心56分鐘分鐘l l 用用20小牛血清小牛血清(NCS)或胎牛血清或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)110mll l 加入加入96孔板，孔板，100l孔孔l l 放入放入37CO2孵箱培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)l一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得鼠可獲得58106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5106ml，小鼠脾細(xì)胞為，小鼠脾細(xì)胞為1106ml，小鼠的成纖維細(xì)胞小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)11

9、05ml，均為，均為100l孔?？住(三三)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞l骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。l常用骨髓瘤細(xì)胞系有：常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。等。l骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在濃度一般在1020，細(xì)胞的最大密度不，細(xì)胞的最大密度不得超得超10ml，一

10、般擴(kuò)大培養(yǎng)以，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1 10稀釋稀釋傳代，每傳代，每35天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為間為1620小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。l一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，的敏感性，每每36月應(yīng)用月應(yīng)用8AG(8氮雜鳥嘌呤氮雜鳥嘌呤)篩選一篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。次，以防止細(xì)胞的突變。l保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良保證骨髓瘤細(xì)胞

11、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95，也是決，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。在細(xì)胞融合的前一天定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，次日，次日一般即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。一般即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。l(四四)免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞l免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成淋巴母細(xì)胞比例較大，融

12、合的成功率較高。功率較高。l脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細(xì)胞數(shù)為脾臟體積的倍，細(xì)胞數(shù)為10左右。左右。二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤l (一一)細(xì)胞融合流程細(xì)胞融合流程l (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP20，1000rpm離心離心5分鐘，棄上清，分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混

13、懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。次。l (2)同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。次。l (3)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 10或或1 5的比例混合在一起，在的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，次，1200rpm,8分鐘。分鐘。l (4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。的濃度。l (5)輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。輕輕彈

14、擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。l (6)在室溫下融合可先以預(yù)熱在室溫下融合可先以預(yù)熱40:l 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45PEG(Merek,分子量分子量4000)含含5DMSO，邊加邊攪拌。邊加邊攪拌。l 作用作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。秒鐘。l 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔分鐘分別加入作用，每隔分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和和10ml。l (7)離心，離心，800rpm，6分鐘。分鐘。l (8)棄上清，先用棄上清，先用6ml左右左右20小牛血清小牛血清RPMI1

15、640輕輕混懸，切記不能用輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。l (9)根據(jù)所用根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊一塊96孔板?？装?。l (10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，孔板，100l孔，孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng)孵箱培養(yǎng) (一般一塊一般一塊96孔板含有孔板含有1107脾細(xì)胞脾細(xì)胞) 。l （11） 第第3、6、9、10日換入含日換入含HAT的完全的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)

16、胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。l （12）于第）于第12、15日加入含有日加入含有HAT的完全的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來(lái)。大多數(shù)雜交天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來(lái)。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在瘤細(xì)胞在1020天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。后，吸取上清液，檢查抗體。（13） 對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過(guò)程中，依

17、情況取消對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過(guò)程中，依情況取消HAT液和完全液和完全1640液而代之以液而代之以10%FCS1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。l (二二)HAT選擇雜交瘤選擇雜交瘤l 一般在融合一般在融合24小時(shí)后，加小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)液。HT和和HAT均有商品化均有商品化試劑試劑50貯存，用時(shí)貯存，用時(shí)1ml加入加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。小牛血清完全培養(yǎng)液中。l 因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)

18、胞、融合后的細(xì)胞，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200l孔。所孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的量可用全量的23進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。l 50HATl H:510-3Ml A:210-5Ml T:810-4Ml 一般選擇一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測(cè)三、抗體的檢測(cè) 篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲

19、得篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底底110面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。四、雜交瘤的克隆化和凍存四、雜交瘤的克隆化和凍存 l克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化?？寺』话闶侵笇⒖贵w陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更

20、多的克隆。要想將這些細(xì)胞彼有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞所抑制。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。力。l 1.有限稀釋法的程序有限稀釋法的程序l 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液制備飼養(yǎng)細(xì)胞

21、懸液(同融合前準(zhǔn)備同融合前準(zhǔn)備)l 陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1510mll 取取130個(gè)細(xì)胞放入個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞ml，100l孔加孔加A、B、C三排為每孔三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為細(xì)胞數(shù)為10個(gè)個(gè)ml，100l孔加孔加D、E、F三排，為三排，為每孔每孔1個(gè)細(xì)胞。余下個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)胞數(shù)5個(gè)個(gè)

22、ml，100l孔，加孔，加G、H兩排，為每孔兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。個(gè)細(xì)胞。l 培養(yǎng)培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液養(yǎng)液200l孔?？?。l 第第89天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。l 注注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。l2.軟瓊脂法軟瓊脂法l軟瓊脂的配制軟瓊脂的配制l含含20FCS(小牛血清小牛血清)的的2倍濃縮的倍濃縮的RPMI1640l1瓊脂水溶液：高壓滅菌，瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。預(yù)熱。

23、l0.5瓊脂：由瓊脂：由1份份1瓊脂加瓊脂加1份含份含20小牛血清的小牛血清的2倍濃縮的倍濃縮的RPMI1640配制而成。配制而成。置置42保溫。保溫。l用上述用上述0.5瓊脂液瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。待凝固后作為基底層備用。l按按100ml，500ml或或5000ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。l1ml 0.5瓊脂液瓊脂液(42預(yù)熱預(yù)熱)在室溫中分別與在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。l混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室

24、溫中混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于分鐘，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。孵箱中。l45天后即可見針尖大小白色克隆，天后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)?？装逯羞M(jìn)行培養(yǎng)。l檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。l (二二)雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞的凍存l 及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)

25、胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。l 雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1106以上，但對(duì)原始孔的以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。培養(yǎng)

26、，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。l 細(xì)胞凍存液細(xì)胞凍存液:l 50小牛血清小牛血清l 40不完全培養(yǎng)液不完全培養(yǎng)液l 10DMSO(二甲亞砜二甲亞砜)五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)l 大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：l 1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。費(fèi)用較高。l 2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)

27、胞，制備腹水或血清。l 實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按13107ml接種于小鼠接種于小鼠背部皮下，每處注射背部皮下，每處注射0.2 ml, 共共24點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般一般1020天天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mgml。但采血量。但采血量有限。有限。l 腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷降植烷)或液體石臘或液體石臘于于BaLbc鼠，鼠，12周后腹腔注射周后腹腔注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接

28、種細(xì)胞710天天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定六、單克隆抗體的鑒定 l 對(duì)制備的對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:l 1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原抗原)進(jìn)進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。法