《現(xiàn)代食品微生物學(xué)》實驗：土壤中的微生物分離純化和菌相分析上海海洋大學(xué)碩士課程寧喜斌歐杰

1、一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康?掌握用平板分離法和劃線分離法分離土掌握用平板分離法和劃線分離法分離土壤中的微生物（好氣性細菌、放線菌壤中的微生物（好氣性細菌、放線菌和一般真菌）。和一般真菌）。 二、實驗原理二、實驗原理 從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。 分離微生物時一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、分離微生物時一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、PH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌生長，不利于或加入某種抑制劑

2、造成只利于該菌生長，不利于其他菌種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。其他菌種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。 微生物分離純化的方法主要有：平板劃線分離法微生物分離純化的方法主要有：平板劃線分離法和稀釋涂布平板法。后者除能有效分離純化微生物和稀釋涂布平板法。后者除能有效分離純化微生物外，還可用于測定樣品中活菌數(shù)量。外，還可用于測定樣品中活菌數(shù)量。三、實驗器材三、實驗器材1.1.土壤土壤2.2.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）（5050g/mLg/mL制霉菌素制霉菌素乙醇溶液）乙醇溶液） 高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（1010滴滴

3、100g/L100g/L石碳酸和石碳酸和5050g/mLg/mL制霉菌制霉菌素乙醇溶液）素乙醇溶液） 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDAPDA）（）（1000mL1000mL培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入2mL2mL氯霉素）氯霉素）3.3.溶液與試劑：溶液與試劑： 9mL9mL或或4.5mL4.5mL無菌水的試管，無菌水的試管，90mL90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶燒瓶四、操作步驟四、操作步驟1.1.倒平板：將培養(yǎng)基加熱溶化，保溫倒平板：將培養(yǎng)基加熱溶化，保溫55-6055-60，每個培養(yǎng)皿倒入每個培養(yǎng)皿倒入15-20mL15-20mL培養(yǎng)基，靜置冷卻培養(yǎng)基，靜

4、置冷卻固化。固化。（一）稀釋涂布平板法（一）稀釋涂布平板法倒平板的方法：倒平板的方法： 右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶置火焰旁邊，右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕的拔出，試管口或瓶口保用左手將試管塞或瓶塞輕輕的拔出，試管口或瓶口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住試管塞。左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開一縫，住試管塞。左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約迅速倒入培養(yǎng)基約15mL15mL，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在底皿底部，然后平置于桌面上，待培

5、養(yǎng)基均勻分布在底皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。凝后即為平板。倒平板倒平板2.制備十倍梯度菌稀釋液：用一支制備十倍梯度菌稀釋液：用一支1mL無菌無菌 吸管吸取吸管吸取0.5mL菌懸液加入菌懸液加入4.5mL無菌水的無菌水的 試管中充分混勻，此為試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類稀釋液，以此類 推制成推制成10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6六種十倍六種十倍 梯度稀釋的菌懸液。梯度稀釋的菌懸液。從土壤中分離微生物從土壤中分離微生物 的操作過程的操作過程3.3.涂布：將上述每種培養(yǎng)基的平板底部或培養(yǎng)涂布：將上述每種培養(yǎng)基的平板底部或培養(yǎng)皿蓋周邊用記號筆分別寫上皿蓋周

6、邊用記號筆分別寫上10-4、10-5和和10-6三種三種稀釋度字樣，每種培養(yǎng)基每稀釋度標(biāo)記稀釋度字樣，每種培養(yǎng)基每稀釋度標(biāo)記2 2皿，然后皿，然后用無菌吸管分別由用無菌吸管分別由10-4、10-5和和10-6 三三管菌懸液中吸管菌懸液中吸取適量對號放入已寫好稀釋度的平板中央位置，取適量對號放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿準(zhǔn)確放入每皿準(zhǔn)確放入0.2mL，用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表，用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕面輕輕涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕的來回推動，使之分布均勻，然后改變方向的來回推動，使之分布均勻，然后改變方向90沿另沿另一垂直線

7、來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂布一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂布棒在涂布幾次，室溫下靜置棒在涂布幾次，室溫下靜置5-10min。4.4.培養(yǎng)：將平板倒置于培養(yǎng)：將平板倒置于3737溫室中培溫室中培 養(yǎng)養(yǎng)1-2d1-2d。5.5.挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許 菌苔接種在不同培養(yǎng)基的斜面上，置菌苔接種在不同培養(yǎng)基的斜面上，置37/28 培培養(yǎng)；待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時養(yǎng)；待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細胞圖片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微將細胞圖片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物細胞。若發(fā)現(xiàn)有

8、雜菌，須再進行一次分離與生物細胞。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，須再進行一次分離與純化直到獲得純培養(yǎng)。純化直到獲得純培養(yǎng)。 1.1.倒平板倒平板2.2.劃線：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，劃線：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取待測菌懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很挑取待測菌懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，培養(yǎng)后能形成單個菌落。樣品在平板上進行稀釋，培養(yǎng)后能形成單個菌落。（二）平板劃線分離法（二）平板劃線分離法劃線方法劃線方法方法一方法一：用接種環(huán)按無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，用接種

9、環(huán)按無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行線先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行線3-43-4次，再次，再轉(zhuǎn)動平板約轉(zhuǎn)動平板約7070角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后挑取懸液穿過第一次劃線部分進行第二次劃線，卻后挑取懸液穿過第一次劃線部分進行第二次劃線，再用同樣的方法穿過第二次劃線部分進行第三次劃線再用同樣的方法穿過第二次劃線部分進行第三次劃線或再穿過第三次劃線部分進行第四次劃線。劃線完畢或再穿過第三次劃線部分進行第四次劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。方法二：方法二：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板

10、培養(yǎng)基上作連將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連 續(xù)劃線，完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，溫室培續(xù)劃線，完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，溫室培 養(yǎng)。養(yǎng)。平板劃線操作圖平板劃線操作圖A A 分段劃線分段劃線 B B 連續(xù)劃線連續(xù)劃線3.3.挑菌落：從分離的平板上單個菌落挑取挑菌落：從分離的平板上單個菌落挑取 少許菌苔于不同培養(yǎng)基斜面上，做鋸齒狀劃少許菌苔于不同培養(yǎng)基斜面上，做鋸齒狀劃 線，線，3737培養(yǎng)后，涂在載玻片上，在顯微鏡培養(yǎng)后，涂在載玻片上，在顯微鏡 下觀下觀 察細胞的個體形態(tài)，結(jié)合菌落形態(tài)特察細胞的個體形態(tài)，結(jié)合菌落形態(tài)特 征，綜合分析。如不純，仍需平板分離法進征，綜合分析。如不純，仍需平板分離法進

11、行純化，直至確認(rèn)為純化培養(yǎng)為止。行純化，直至確認(rèn)為純化培養(yǎng)為止。一、實驗原理一、實驗原理 平板菌落計數(shù)法（活菌計數(shù)）是根據(jù)微生物在固平板菌落計數(shù)法（活菌計數(shù)）是根據(jù)微生物在固 體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖 而成的現(xiàn)象進行的，也就是說一個菌落即代表一個而成的現(xiàn)象進行的，也就是說一個菌落即代表一個 單細胞。計數(shù)時，先將待測樣品作一系列稀釋，再單細胞。計數(shù)時，先將待測樣品作一系列稀釋，再 取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分 布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細胞生布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)

12、，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細胞生 長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可換算出樣品長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可換算出樣品 中的含菌數(shù)。中的含菌數(shù)。活菌計數(shù)活菌計數(shù) 這種計數(shù)法的優(yōu)點是能測出樣品中的活菌數(shù)。這種計數(shù)法的優(yōu)點是能測出樣品中的活菌數(shù)。 但平板菌落計數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測定值常受各但平板菌落計數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測定值常受各 種因素的影響。種因素的影響。二、實驗步驟（方法一）二、實驗步驟（方法一）1.1.編號：取無菌培養(yǎng)皿編號：取無菌培養(yǎng)皿6 6套，分別用記號筆表明套，分別用記號筆表明 10-4、10-5、10-6各各2 2套。另取套。另取6 6支支4.5mL4.5mL無菌水無菌水 的試管，

13、依次表明的試管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6。2.2.稀釋：用稀釋：用1mL無菌吸管準(zhǔn)確吸取無菌吸管準(zhǔn)確吸取0.5mL已充分混勻已充分混勻 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)液，加入標(biāo)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)液，加入標(biāo) 有有10-1字樣的試管中，此為字樣的試管中，此為10倍稀釋，吸管中多余的菌倍稀釋，吸管中多余的菌 液放回試管中。將液放回試管中。將1010-1-1試管在手掌中或置于振蕩器上振試管在手掌中或置于振蕩器上振 蕩，使菌液充分混勻。另取一支蕩，使菌液充分混勻。另取一支1mL吸管插入吸管插入10-1試管試管 菌液中吸取菌液中吸取1mL

14、，精確的放，精確的放0.5mL菌液于菌液于10-2試管中，試管中， 此為此為100倍稀釋倍稀釋其余依次類推直至所需倍其余依次類推直至所需倍 數(shù)。數(shù)。3.3.倒平板：倒入熔化后冷卻至倒平板：倒入熔化后冷卻至4545左右的牛肉左右的牛肉 膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約15mL15mL于平皿中，置水平于平皿中，置水平 為止，迅速旋動平皿，待培養(yǎng)基凝固后備用并為止，迅速旋動平皿，待培養(yǎng)基凝固后備用并 標(biāo)號。標(biāo)號。4.4.取樣：用取樣：用3 3支支1mL1mL的無菌吸管分別吸取的無菌吸管分別吸取1010-4-4、1010-5-5和和 1010-6-6稀釋菌懸液各稀釋菌懸液各0.2mL0.2mL

15、，放入已標(biāo)號的平板中，涂，放入已標(biāo)號的平板中，涂 布。靜置半小時后，將平板倒置于布。靜置半小時后，將平板倒置于3737恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)后計數(shù)。中培養(yǎng)后計數(shù)。 5.5.計數(shù)：培養(yǎng)計數(shù)：培養(yǎng)48h48h后取出培養(yǎng)平板，根據(jù)統(tǒng)計的后取出培養(yǎng)平板，根據(jù)統(tǒng)計的 菌落數(shù)，計算出同一稀釋度菌落數(shù)，計算出同一稀釋度2 2個平板上的菌落平個平板上的菌落平 均數(shù)，按下列公式進行計算：均數(shù)，按下列公式進行計算： 每毫升樣品中菌落形成單位每毫升樣品中菌落形成單位（CFU/mL） = =同一稀釋度同一稀釋度2 2次重復(fù)的平均菌落數(shù)次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)5活菌計數(shù)流程圖活菌計數(shù)流程圖 細菌細菌放線

16、菌放線菌霉菌霉菌霉菌酵母酵母實驗方法二實驗方法二1. 編號：取無菌培養(yǎng)皿編號：取無菌培養(yǎng)皿6 6套，分別用記號筆表明套，分別用記號筆表明 10-4、10-5、10-6各各2 2套。另取套。另取6 6支支4.5mL4.5mL無菌水無菌水 的試管，依次表明的試管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6。2.2.稀釋：用稀釋：用1mL無菌吸管準(zhǔn)確吸取無菌吸管準(zhǔn)確吸取0.5mL已充分混勻已充分混勻 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)液，加入標(biāo)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)液，加入標(biāo) 有有10-1字樣的試管中，此為字樣的試管中，此為10倍稀釋，吸管中多余的倍稀釋，吸

17、管中多余的菌菌 液放回試管中。將液放回試管中。將1010-1-1試管在手掌中或置于振蕩器上試管在手掌中或置于振蕩器上 振蕩，使菌液充分混勻。另取一支振蕩，使菌液充分混勻。另取一支1mL吸管插入吸管插入10-1試試 管菌液中吸取管菌液中吸取1mL，精確的放，精確的放0.5mL菌液于菌液于10-2試管試管 中，此為中，此為100倍稀釋倍稀釋其余依次類推直至所需倍數(shù)。其余依次類推直至所需倍數(shù)。3.3.用用3 3支支1mL1mL的無菌吸管分別吸取的無菌吸管分別吸取1010-4-4、1010-5-5和和1010-6-6 稀釋菌懸液各稀釋菌懸液各0.2mL0.2mL，放入已滅菌的平板中，然后，放入已滅菌的平板中，然后 倒入冷卻至倒入冷卻至4545左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約 15mL15mL，迅速旋動平皿，混勻培養(yǎng)基和菌稀釋液，后靜，迅速旋動平皿，混勻培養(yǎng)基和菌稀釋液，后靜 置凝固，倒置于置凝固，倒置于3737恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后計數(shù)。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后計數(shù)。4.4.計數(shù)：培養(yǎng)計數(shù)：培養(yǎng)48h48h后取出培養(yǎng)平板，根據(jù)統(tǒng)計的菌落后取出培養(yǎng)平板，根據(jù)統(tǒng)計的菌落 數(shù)，計算出同一稀釋度數(shù)，計算出同一稀釋度2 2個平板上的菌落平均數(shù)，按個平板上的菌落平均數(shù)，按 下列公式進行計算：下列公式進行計算：每毫升樣品中菌