流式細(xì)胞術(shù)(言)

1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。和分選的新技術(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞不被破壞的狀態(tài)下，的狀態(tài)下，通過通過熒光探針熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析分析或純化或純化分選分選。 細(xì)胞不被破壞，測(cè)量

2、快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur ( BD流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 ）

3、采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。性。 一、工作原理一、工作原理 （1 1） 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) （2 2） 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) （3 3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的

4、基本結(jié)構(gòu)：流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測(cè)細(xì)胞待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色單抗對(duì)其染色 受清潔氣體壓力受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流入流動(dòng)室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。（1）液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）

5、（示意圖）流速與壓力的關(guān)系服從流速與壓力的關(guān)系服從BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2) V V2 2 ( (忽略高度的變化忽略高度的變化) )。改變氣壓。改變氣壓, ,就可獲得不同的流速。就可獲得不同的流速。 FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管噴嘴噴嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系統(tǒng)示意圖液流系統(tǒng)示意圖 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光

6、器 分色反光鏡：反射長(zhǎng)分色反光鏡：反射長(zhǎng)/ /短波長(zhǎng)，通過短短波長(zhǎng)，通過短/ /長(zhǎng)長(zhǎng)波長(zhǎng)波長(zhǎng) 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)）光學(xué)系統(tǒng)FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS D

7、etector光學(xué)系統(tǒng)示意圖光學(xué)系統(tǒng)示意圖PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell 激光激光、透鏡組、光電倍增管等。、透鏡組、光電倍增管等。Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍向周圍360立體角方向散射的光線立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)

8、胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為為前向散射光前向散射光和側(cè)向散射光側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定二、散射光的測(cè)定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度以相對(duì)軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意圖前向散射光示意圖側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（sid

9、e scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射細(xì)激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以胞時(shí)，光以9090角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。結(jié)構(gòu)屬性。FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光側(cè)向散射光示意圖示意圖 測(cè)得的測(cè)得的FSFS與與SSSS信信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到可得到FS-SSFS-SS圖，由圖，由此可僅用散射光信號(hào)此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴

10、細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。 每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同

11、時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。多個(gè)不同特征。 線性放大器和對(duì)數(shù)放大器線性放大器和對(duì)數(shù)放大器三、熒光測(cè)量三、熒光測(cè)量熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)(EMISSION) 通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理四、細(xì)胞分選原理細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含

12、細(xì)胞的液滴含細(xì)胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)機(jī)械振動(dòng)不充電不充電充電充電（一）分選基本原理（一）分選基本原理 參數(shù)：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FL 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙參、雙參數(shù)散點(diǎn)圖數(shù)散點(diǎn)圖 、二維等高圖、二維等高圖 、假三維等高、假三維等高圖圖 、三參數(shù)散點(diǎn)圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖 ） 設(shè)門分析技術(shù)設(shè)門分析技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析FSFS：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆

13、粒被染上的熒光數(shù)量多少一、一、 參數(shù)參數(shù) 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖: :點(diǎn)圖點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析多參數(shù)分析直分析方圖直分析方圖設(shè)門分析設(shè)門分析: :REGION和和GATE設(shè)置設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道信道(chann

14、el(channel ) ) 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號(hào)雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度綠色熒光強(qiáng)度

15、紅色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞2. 二維等高圖二維等高圖 由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。雙參數(shù)直方圖。 等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高等高”。 曲線層次越高曲線層次越高( (越里面的線越里面的線) ) 所代表的細(xì)胞所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。數(shù)愈多。 等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。二維等高圖二維等高圖3. 假三維等高圖假三維等高圖（三）三參數(shù)直方

16、圖（三）三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析 Gate Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門

17、的形狀又分為了線性門、矩形門、圓根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設(shè)門分析技術(shù)三、設(shè)門分析技術(shù)A A 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞B B 單核細(xì)胞單核細(xì)胞C C 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞A A、B B、C C均均為任意門為任意門線性門線性門D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時(shí)，起如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。 熒光素種類 FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色 530nm PE（藻紅蛋白）：橙黃

18、色 575nm PerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色675nm PI(碘化丙啶）：橙紅色 620nm 488nm波長(zhǎng)的氬離子激光激發(fā) APC(別藻蘭蛋白）：紅色 660nm 630nm波長(zhǎng)的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)細(xì)胞組成細(xì)胞組成細(xì)胞功能細(xì)胞功能大小大小細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細(xì)胞活性細(xì)胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞內(nèi)細(xì)胞因子胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性小結(jié)基本工作原理基本工作原理單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程基本過程樣品染色步驟 PBS洗細(xì)胞洗