第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)

1、 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 補(bǔ)體參與的抗原補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 補(bǔ)體參與的抗原補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的條件及附加因素，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式： 1溶液中沉淀反應(yīng) 2凝膠中沉淀反應(yīng) 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)

2、 根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的條件及附加因素，沉淀反應(yīng)可分為兩種主要形式： 1溶液中沉淀反應(yīng) 2凝膠中沉淀反應(yīng) 1 1溶液中沉淀反應(yīng)溶液中沉淀反應(yīng)（Precipitation reaction in solution） 是指在清徹透明的液體中，呈溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見的絮狀或顆粒狀的不溶性沉淀物。溶液中沉淀反應(yīng)溶液中沉淀反應(yīng) 鹽溶液抗原抗原 + + 抗體抗體 沉淀沉淀 2056、pH68 抗原：沉淀原 抗體：沉淀素1 1溶液中沉淀反應(yīng)溶液中沉淀反應(yīng)（Precipitation reaction in solution） （1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（2）免疫比濁法（3）免

3、疫沉淀技術(shù)（1 1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn) （ring precipitation test） 或毛細(xì)管內(nèi)沉淀反應(yīng)（precipitation in capillary tube）（2 2）免疫比濁法）免疫比濁法(immunonephelomytry）可溶性的抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁。復(fù)合物的量與濁度成正比。 與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可計(jì)算出樣品中的抗原或抗體含量。免免疫疫沉沉淀淀技技術(shù)術(shù)免疫共沉淀免疫共沉淀GST pull-downGST pull-down技術(shù)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的條件及附加因素，沉

4、淀反應(yīng)可分為兩種主要形式： 1溶液中沉淀反應(yīng) 2凝膠中沉淀反應(yīng) 2 2凝膠中沉淀反應(yīng)凝膠中沉淀反應(yīng)（Precipitation reaction in gel） 1968年Ouchterlong發(fā)明的。即將抗原抗體溶液放在瓊脂凝膠板上的小孔中，使它們彼此對向擴(kuò)散，在抗原抗體相遇的地方形成沉淀線。2 2凝膠中沉淀反應(yīng)凝膠中沉淀反應(yīng) 此沉淀線的突出性質(zhì)性質(zhì)是：特異性抗原抗體不能通過；與沉淀線無關(guān)的抗原和抗體分子則可自由通過此沉淀線。2 2凝膠中沉淀反應(yīng)凝膠中沉淀反應(yīng)（1）單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（2）雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（3）免疫電泳（4）火箭電泳試驗(yàn)（5）免疫印跡技術(shù)單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（3 3

5、）免疫電泳）免疫電泳（immunoelectrophoresis）（4 4）火箭電泳試驗(yàn)）火箭電泳試驗(yàn)又稱Western blotting電泳印漬及檢測（5 5）免疫印漬技術(shù)）免疫印漬技術(shù)（immunoblottingimmunoblotting）免疫印漬第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 補(bǔ)體參與的抗原補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 1直接凝集反應(yīng) 2間接凝集反應(yīng)3橋梁凝集反應(yīng) 4共同凝集反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 1直接凝集反應(yīng) 2間接

6、凝集反應(yīng)3橋梁凝集反應(yīng) 4共同凝集反應(yīng) 1 1直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)（direct agglutinationdirect agglutination） 是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與其相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。1 1直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)（1）微生物凝集反應(yīng)如診斷傷寒病的肥達(dá)氏 （Widal reaction）反應(yīng)（2）同種紅細(xì)胞凝集反應(yīng) 如檢查血型的血細(xì)胞凝集現(xiàn)象第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 1直接凝集反應(yīng) 2間接凝集反應(yīng)3橋梁凝集反應(yīng) 4共同凝集反應(yīng) 2 2間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination） 用可溶性抗原（或抗體）包被在一種與免疫無關(guān)的、

7、具一定大小的不溶性顆粒（即載體顆粒，如：乳膠顆?；蚣t細(xì)胞）的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在有適宜電解質(zhì)存在的條件下，結(jié)合產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象。2 2間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)正向間接凝集反應(yīng)：將抗原先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。 反向間接凝集反應(yīng)：將特異性抗體先吸附在載體表面，然后與相應(yīng)抗原結(jié)合產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。 既可檢測抗原，也可檢測抗體； 方法簡便、敏感。正向間接凝集反應(yīng)正向間接凝集反應(yīng) 此方法對檢測微量抗原具有較高的敏感性。而且由于相關(guān)病原體的抗原成分一般情況下比血清抗體出現(xiàn)早，所以可用于某些傳染病如鉤端螺旋體抗原和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或原發(fā)性肝癌AFP的檢

8、測等。反向間接凝集反應(yīng)反向間接凝集反應(yīng)第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 1直接凝集反應(yīng) 2間接凝集反應(yīng)3橋梁凝集反應(yīng) 4共同凝集反應(yīng) 3 3橋梁凝集反應(yīng)橋梁凝集反應(yīng) 又稱Coombs抗球蛋白試驗(yàn)。此試驗(yàn)用于檢測不完全抗體。第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 1直接凝集反應(yīng) 2間接凝集反應(yīng)3橋梁凝集反應(yīng) 4共同凝集反應(yīng) 4 4共同凝集反應(yīng)共同凝集反應(yīng) 又稱協(xié)同凝集反應(yīng)。指由兩種顆粒成分相互作用而發(fā)生的凝集反應(yīng)。 4 4共同凝集反應(yīng)共同凝集反應(yīng)（1）細(xì)菌抗體與攜帶蛋白A的金黃色葡萄球菌Cowan 系致敏，即通過其IgG的Fc段與蛋白A結(jié)合，再與相應(yīng)細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)。（2）玫瑰花結(jié)試驗(yàn)：主要用于研究各種淋

9、巴細(xì)胞特性。 E花環(huán)形成示意圖 B細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖 淋巴細(xì)胞的分離玫瑰花結(jié)淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)的主要模式 玫瑰花結(jié)玫瑰花結(jié)的類型的類型 紅細(xì)胞的類紅細(xì)胞的類型及處理型及處理 淋巴細(xì)胞類型淋巴細(xì)胞類型 E花結(jié)花結(jié) 綿羊紅細(xì)胞 T、50%NK EA花結(jié)花結(jié) 抗體致敏的紅細(xì)胞 B、T、NK、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞 EAC花結(jié)花結(jié) 補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞 B 第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 補(bǔ)體參與的抗原補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié)補(bǔ)體參與的抗原

10、抗體反應(yīng)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng) 1補(bǔ)體參與直接的抗原抗體反應(yīng) 2補(bǔ)體參與間接的抗原抗體反應(yīng) 第三節(jié)第三節(jié)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng) 1補(bǔ)體參與直接的抗原抗體反應(yīng) 2補(bǔ)體參與間接的抗原抗體反應(yīng) 1 1補(bǔ)體參與直接的補(bǔ)體參與直接的抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) （1）溶血反應(yīng) （2）溶菌反應(yīng)（1 1）溶血反應(yīng)）溶血反應(yīng)（hemolytic assay） 溶血反應(yīng)常作為是否存在游離補(bǔ)體的指示系統(tǒng)。（1 1）溶血反應(yīng)）溶血反應(yīng) 1942年Rutstein和Walker根據(jù)補(bǔ)體能使兔抗羊紅細(xì)胞抗體致敏的羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的特點(diǎn)，建立了測定血清中總補(bǔ)體活性的方法（即50%溶血反應(yīng)CH50 測定方

11、法）（2 2）溶菌反應(yīng)）溶菌反應(yīng) 溶菌反應(yīng)常作為某血清中是否存在相應(yīng)抗體的檢測方法。 第三節(jié)第三節(jié)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng) 1補(bǔ)體參與直接的抗原抗體反應(yīng) 2補(bǔ)體參與間接的抗原抗體反應(yīng) 2 2補(bǔ)體參與間接的補(bǔ)體參與間接的抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) （1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn) （3）溶血空斑試驗(yàn) （1 1）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test） 1901年由Bordet和Gengou首先應(yīng)用溶血反應(yīng)作為指示系統(tǒng)，建立的檢測抗原抗體反應(yīng)的方法。補(bǔ)補(bǔ)體體結(jié)結(jié)合合試試驗(yàn)驗(yàn)原原理理（2 2）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn)）被動(dòng)紅細(xì)胞溶解試驗(yàn) 即

12、吸附抗原的紅細(xì)胞在有相應(yīng)抗體和補(bǔ)體存在時(shí)，出現(xiàn)紅細(xì)胞溶解反應(yīng)。 抗原致敏紅細(xì)胞加入待測血清和補(bǔ)體判斷結(jié)果（陽性對照：加入相應(yīng)抗體和補(bǔ)體） （3 3）溶血空斑試驗(yàn)）溶血空斑試驗(yàn) 是測定B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體功能的一種體外試驗(yàn)方法。溶血空斑試驗(yàn)第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 第二節(jié)第二節(jié) 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 補(bǔ)體參與的抗原補(bǔ)體參與的抗原 抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 第五章第五章經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 第四節(jié)第四節(jié) 中和反應(yīng)中和反應(yīng) 中和反應(yīng)（neutralization）： 是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用于檢測中和抗體是否存在及其效價(jià)的試驗(yàn)，反映抗體中和病毒感染性或細(xì)

13、菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)。 中和抗體：病原微生物侵入機(jī)體后，使之產(chǎn)生能中和相應(yīng)微生物及其毒性產(chǎn)物（毒素），從而使病原微生物喪失感染能力或毒力的抗體。 （中和抗體：能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體。 抗毒素：能與細(xì)菌外毒素結(jié)合，中和其毒性作用的抗體。） 中和反應(yīng)的原理中和反應(yīng)的原理 即將被檢血清與病原微生物混合，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間作用后，接種于宿主系統(tǒng)（包括動(dòng)物、雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞），按照對其產(chǎn)生的保護(hù)效果的差異，可判斷該微生物或毒素是否已被中和，并計(jì)算出中和的程度（中和指數(shù)），即代表中和抗體效價(jià)。 中和反應(yīng)的特點(diǎn)：中和反應(yīng)的特點(diǎn)： （1）檢測機(jī)體內(nèi)是否存在中和抗體以及中和抗體的效價(jià)，直接反應(yīng)機(jī)體抗病毒的能力，

14、有利于臨床診斷；（2）中和抗體在體內(nèi)存留時(shí)間一般較長，可用于流行病學(xué)調(diào)查；（3）中和反應(yīng)有嚴(yán)格的種、型特異性，可對分離的病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：操作麻煩，試驗(yàn)時(shí)間較長。中和反應(yīng)的類型：中和反應(yīng)的類型： 1終點(diǎn)法中和反應(yīng) 2蝕斑減少法中和反應(yīng) 1 1終點(diǎn)法中和反應(yīng)終點(diǎn)法中和反應(yīng) 根據(jù)滴定被血清中和后的殘余毒力，來判斷血清中中和抗體的效價(jià)。 （1）固定病毒稀釋血清法 （2）固定血清稀釋病毒法 （1 1）固定病毒稀釋血清法）固定病毒稀釋血清法 先固定病毒的毒價(jià)，再與等量的遞進(jìn)稀釋的待測血清混合，置37 1小時(shí)，每一稀釋度接種36只動(dòng)物（或雞胚、培養(yǎng)細(xì)胞），接種后記錄每組動(dòng)物（或雞胚）的存活數(shù)和死亡數(shù)（或培養(yǎng)細(xì)胞破壞程度），然后計(jì)算其半數(shù)保護(hù)率（PD50），即該血清的中和效價(jià)。 （2 2）固定血清稀釋病毒法）固定血清稀釋病毒法 將病毒原液作10倍遞進(jìn)稀釋，分別與等量正常血清（對照組）、待測血清（試驗(yàn)組）混合，置37 1小時(shí)，每一稀釋度接種3