第八章20104miRNA

1、miRNA與siRNA非編碼小分子RNAmiRNAsiRNA非編碼小分子RNA從“生物垃圾”到“年度分子” 真核生物基因組中99%為非編碼序列，外顯子和調(diào)控序列外稱為“垃圾” 非編碼序列轉(zhuǎn)錄出的RNA為“垃圾RNA分子” 非編碼核糖核酸：除成熟mRNA分子外所有獨(dú)立存在的RNA分子。 進(jìn)化越高，“垃圾”越多？ 1993年，線蟲，lin-4 2000年，線蟲，let-7 很快分離出一類21-22 小分子RNA 1998, RNA干擾現(xiàn)象 2001，人工合成，siRNA，抑制同源序列基因的表達(dá) 至此，“垃圾”變“寶物” 非編碼RNA的研究成果先后7次在近10年scince評選：年度十大科技突破 2

2、000年，RNA的研究進(jìn)展被美國科學(xué)雜志評為重大科技突破； 2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”； 2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。 同時， Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成功之一。 2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。 RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與HGP（人類基因組計(jì)劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一 除了除了mRNA、tRNA、rRNA三種三種RNA外外，細(xì)胞的不同部位存

3、在的許多其他種類的小，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子分子RNA，統(tǒng)稱為，統(tǒng)稱為非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 u snmRNAs:u snmRNAs的種類的種類:核內(nèi)小核內(nèi)小RNA (small nuclear RNA, snRNA)核仁小核仁小RNARNARNA (small nucleolar RNA, snoRNA)胞質(zhì)小胞質(zhì)小RNA RNA (small cytoplasmic RNA, scRNA)催化性小催化性小RNA RNA (small catalytic RNA)小片段干涉小片段干涉 RNARNA (s

4、mall interfering RNA, siRNA)起始起始RNARNA (initiator RNA，iRNA) 微小微小RNA（micro RNA, miRNA） u snmRNAs的功能：的功能： U系列系列snRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成snRNP，參與參與hnRNA和和rRNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)。的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)。如如U1、U2、U3、U4、U5、U6等。等。多種多樣多種多樣 siRNA和和miRNA參與某些基因表達(dá)調(diào)控。參與某些基因表達(dá)調(diào)控。 iRNA作為作為DNA合成的引物。合成的引物。MicroRNAmicroRNA是誰？ MicroRNA也可以寫做miRNA ，是一種21

5、25nt長的單鏈小分子RNA。 它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。成熟的miRNA，5端有一個磷酸基團(tuán)，3端為羥基。 編碼miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈RNA前體（pre-miRNA）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。 成熟的miRNA 5端的磷酸基團(tuán)和3端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志。 miRNA 5端第一個堿基對U（尿苷）有強(qiáng)烈的傾向性，而對G卻排斥，但第二到第四個堿基缺乏U。一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。

6、這些分子能夠與那些和它的序列互補(bǔ)的mRNA分子相結(jié)合，有時候甚至可以與特定的DNA片斷結(jié)合。這種結(jié)合的結(jié)果就是導(dǎo)致基因的沉默。這種方式是身體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個重要策略。 miRNA研究的開端 miRNA的研究起始于時序調(diào)控小RNA（stRNAs）。 1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegan）中發(fā)現(xiàn)了第一個定時調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4 2002年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個異時性開關(guān)基因let-7 2001年10月science報(bào)道了三個實(shí)驗(yàn)室從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個類似C.elegan的lin-4的小RNA基因，

7、稱為microRNA。 隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs，并且發(fā)現(xiàn)它與多種重要的生命過程有關(guān)。 MiRNA的作用方式 miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種： 第一種以線蟲lin-4為代表，作用時與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性（不改變mRNA豐度），這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類； 第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA； 第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式：當(dāng)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合時，直接

8、靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細(xì)胞中l(wèi)et-7直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA；當(dāng)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合時，起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3端非翻譯區(qū)不完全配對結(jié)合后，抑制調(diào)節(jié)基因的翻譯。Differences in miRNA Mode of ActionGenomics of microRNAMiRNA的特異性 研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性在特定的時間、組織才會表達(dá)。細(xì)胞特異性或組織特異性是miRNA表達(dá)的主要特點(diǎn)，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象

9、；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)，這同時體現(xiàn)了miRNA的又一特點(diǎn)基因表達(dá)時序性。 MiRNA表達(dá)的時序性和組織特異性暗示miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。MiRNA的產(chǎn)生“話說在“廣袤”的細(xì)胞質(zhì)中游蕩著一個名叫Dicer的浪子。與此同時，在細(xì)胞的腹地細(xì)胞核中，一個身形頎長的RNA降生了即pri-miRNA。Dicer在細(xì)胞質(zhì)中遇到了一個雙鏈的RNA并被她所吸引，于是尾隨她并最終在她身上咬了一口，結(jié)果siRNA降生了。D

10、icer又繼續(xù)游蕩，這時他看到了一個非常漂亮的發(fā)夾狀的RNA（她其實(shí)就是在細(xì)胞核中降生的那條RNA的化身pre-miRNA），于是非常仰慕并最終歷經(jīng)艱辛將她咬了一口。這樣我就“哇”的一聲來到了這個世界上”miRNA說?！拔液蛃iRNA有許多共同點(diǎn)，但我們的差別也很多，所以可別把我們混在一起哦，”它補(bǔ)充說。 MiRNA的功能研究 最近，miRNA常常在那些頂級雜志上露面，人類對它在生長發(fā)育中的調(diào)節(jié)功能以及與疾病關(guān)系的了解也一點(diǎn)一點(diǎn)地在增加。 研究發(fā)現(xiàn)miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，而且研究人員推測這種小分子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因！ 目前認(rèn)為m

11、iRNA在人體中有200多種類型。發(fā)表在6月2日的Nature雜志上的一項(xiàng)研究表明miRNA與感染的病毒的復(fù)制有關(guān)之前認(rèn)為這種分子只與內(nèi)生的物質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)，而于外源病毒的調(diào)節(jié)無關(guān)。因此，這一發(fā)現(xiàn)對miRNA的功能有了新的認(rèn)識 2005年6月9日的自然雜志上的文章顯示microRNA的活動模式能夠被用于診斷癌癥。 研究人員Todd R. Golub和Robert Horvitz等人證明miRNA表達(dá)特征能用于劃分人類癌癥以及區(qū)別正常細(xì)胞和癌細(xì)胞。研究表明miRNA表達(dá)特征甚至能夠鑒別出那些從外形上無法確定的癌細(xì)胞。 發(fā)表在同期自然雜志上的第二篇文章表明一種特殊的miRNA束能夠?qū)е滦∈蟮牧馨土觥?/p>

12、 由霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Joshua Mendell和同事發(fā)表在自然的第三篇文章顯示一些miRNA與一種已知能導(dǎo)致人類癌癥的基因相互協(xié)作。這讓人懷疑miRNA可能充當(dāng)一種新型的癌基因。通過確定出大多數(shù)常見癌癥中表達(dá)的特殊miRNA以及分析它們對癌癥發(fā)生和癌癥基因的影響，這三項(xiàng)同期公布在自然雜志上的研究改變了癌癥遺傳學(xué)的前景。 新的研究表明miRNA在從癌癥、心臟病到艾滋病的各種疾病中起到一定的作用，而且有間接的證據(jù)表明如果將兩個miRNA從人類基因組中刪除就會發(fā)生白血病。 對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程，造血過程，器官形成，凋亡，細(xì)

13、胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生(Kim, 2005)。miRNA controls some plant phenotypemiRNA controls the miRNA controls the differentiation of the differentiation of the hematopoietic stem cellhematopoietic stem cellExpression studies on Expression studies on mammalian microRNAsmammalian microRNAsObesity 肥胖Host-virus interacti

14、on: a new role for Host-virus interaction: a new role for microRNAsmicroRNAsmiRNA and CancermiRNA and CancerComparison of small RNAComparison of small RNAcharacterization methodscharacterization methodsMicroRNA Quantitation by RT-MicroRNA Quantitation by RT-PCRPCRMicroRNA Quantitation by RT-PCRMicro

15、RNA Quantitation by RT-PCRSBC-miRNA microarryhybridization resultScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600掃描像素值： 5m，PMT(%)數(shù)值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a為肝標(biāo)志小RNAMIR-19b為癌標(biāo)志小RNAScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600掃描像素值： 5mPMT(%)數(shù)值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a為肝標(biāo)志小RNAMIR-155,20a ,le

16、t7 family為癌標(biāo)志小RNAsiRNA 小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是小RNA的最主要組成部分，它們的相關(guān)性密切，既具有相似性，又具有差異性。對小RNA的深入研究將使我們更深一步了解生命的奧秘。RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，通過這種方式，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默，迅速阻斷基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個堿基對組成，包括5個磷酸

17、根，2個核苷和3個懸臂。 在哺乳動物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，shRNA）來進(jìn)行RNA干涉以使基因沉默已經(jīng)成為強(qiáng)大而有力的生物工具。 圖1 dsRNA可以沉默目標(biāo)基因。在植物中，通過注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重復(fù)序列可以誘導(dǎo)目標(biāo)基因沉默。在線蟲中，沉默也可以用注射dsRNA的方式來誘導(dǎo)。這兩種生物體中，沉默是系統(tǒng)的并且傳遍全身。a) 沉默信號從脈桿傳到葉片組織。綠色是綠色熒光蛋白；紅色是葉綠素?zé)晒?，可以在綠色熒光蛋白被沉默后看出。b,c）通過實(shí)驗(yàn)，使得線蟲的核中表達(dá)綠色熒光蛋白。實(shí)驗(yàn)者在左邊加上對照dsRNA，右邊加上綠色熒光蛋白的d

18、sRNA。一些神經(jīng)元核仍然可以檢測到熒光，對應(yīng)于少量的蛋白質(zhì)表達(dá)。c）Hela細(xì)胞加上ORC6 siRNA之后，針對微管蛋白（綠色）和DNA（紅色）進(jìn)行染色。ORC6的去除導(dǎo)致多核細(xì)胞的積累。穩(wěn)定的沉默也可以通過表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者折回的雙鏈RNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。d）當(dāng)和野生型的果蠅相比（右邊），成體果蠅中表達(dá)控制白色基因的發(fā)夾同源物（左邊）導(dǎo)致眼睛喪失色素。 1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn)2125nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾谵D(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。 隨后，Hammond 等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)證明了小分子RNA在RN

19、Ai 中的作用，這些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。 RNAi能夠調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動。 RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅提升了人們對RNA分子的認(rèn)識，還大大推進(jìn)基因功能的研究，更為各種類型的傳染病和癌癥提供了一種新的手段。 近年來，有關(guān)RNAi研究成果令人眼花繚亂：人們利用RNAi途徑來人為調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)以達(dá)到治療遺傳疾病甚至癌癥的目的，而且已經(jīng)有不少的成功信息公布。 siRNA是RNAi途徑的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他們有許多共同點(diǎn)也有許多不同點(diǎn)。相同點(diǎn)/聯(lián)系點(diǎn)siRNAmiRNA長度及特征都約在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羥

20、基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的Dicer酶依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白參與RISC組分二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊；產(chǎn)生了on target和off target的問題作用方式都可以阻遏靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致mRNA降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用進(jìn)化關(guān)系可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補(bǔ)充，miRNA在進(jìn)化過程中替代了siRNA不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNA機(jī)制性質(zhì)往往是外源引起的

21、，如病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生，屬于異常情況是生物體自身的一套正常的調(diào)控機(jī)制直接來源長鏈dsRNA發(fā)夾狀pre-miRNA分子結(jié)構(gòu)siRNA是雙鏈RNA，3端有2個非配對堿基，通常為UUmiRNA是單鏈RNA對靶RNA特異性較高，一個突變?nèi)菀滓餜NAi沉默效應(yīng)的改變相對較低，一個突變不影響miRNA的效應(yīng)作用方式RNAi途徑miRNA途徑生物合成，成熟過程由dsDNA在Dicer酶切割下產(chǎn)生;發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為Drosha酶處理后成為60nt的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；這些pre-miRNAs在轉(zhuǎn)運(yùn)

22、到細(xì)胞核外之后再由Dicer酶進(jìn)行處理，酶切后成為成熟的miRNAs；發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNAArgonaute (AGO) 蛋白質(zhì)各有不同的AGO蛋白質(zhì)各有不同的AGO蛋白質(zhì)互補(bǔ)性（complementarity）一般要求完全互補(bǔ)不完全互補(bǔ)，存在錯配現(xiàn)象RISCs的分子量不同(Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004)siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物學(xué)功能不同抵抗病毒的防御機(jī)制；沉默那些過分表達(dá)的mRNA；保護(hù)基因組免受轉(zhuǎn)座子的破壞對有機(jī)體的生長發(fā)育有重要作用(Rhoades et al., 2002)重要特性高度特異性高度的保守性、時序性和組織特異性不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNA作用機(jī)制單鏈的siRNA結(jié)合到RISC復(fù)合物中，引導(dǎo)復(fù)合物與mRNA完全互補(bǔ)，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNAs，通過反義siRNA鏈識別目的mRNA片段，通過內(nèi)切酶活性切割目的片段，接著再通過細(xì)胞外切酶進(jìn)一步降解目的片段。同時，siRNA也可以阻遏3U