實驗三 病原細菌的鑒定與藥物敏感性(大)

1、1實驗三實驗三 病原細菌的分離、鑒定與毒力分析病原細菌的分離、鑒定與毒力分析一、實驗目的一、實驗目的1 1掌握無菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；掌握無菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；2 2了解細菌鑒定的方法，熟悉細菌常用的生理生化反應及原理。了解細菌鑒定的方法，熟悉細菌常用的生理生化反應及原理。2二、實驗內容二、實驗內容1. 1. 平板劃線法分離病原細菌；平板劃線法分離病原細菌；2 2病原細菌的形態(tài)與生理生化鑒定；病原細菌的形態(tài)與生理生化鑒定；3 3病原細菌的人工感染（課外選作實驗）。病原細菌的人工感染（課外選作實驗）。3三、主要儀器及試材三、主要儀器及試材顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包

2、括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術剪、顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術剪、大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。蒸餾水、魚用生理鹽水，蒸餾水、魚用生理鹽水，70%70%的乙醇、的乙醇、BHIBHI培養(yǎng)基、生化管等。培養(yǎng)基、生化管等。人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚（剪掉部分背鰭或腹鰭（剪掉部分背鰭或腹鰭作為標記作為標記) )。4四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟（一）（一） 病原細菌的分離病原細菌的分離1 1無菌操作打開病魚的腹腔：無菌操作打開病魚的腹腔：2 2

3、細菌劃線接種：細菌劃線接種：3 3培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)與觀察：（二）病原細菌的革蘭氏染色（二）病原細菌的革蘭氏染色分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個人分離的未知菌株進行分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個人分離的未知菌株進行革蘭氏染色，記錄結果。革蘭氏染色，記錄結果。5四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟（三）病原細菌的生理生化鑒定（三）病原細菌的生理生化鑒定分別測定分別測定分離菌分離菌和和嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌的的1212種生化指標：氧化酶，吲哚實驗，種生化指標：氧化酶，吲哚實驗，VPVP，H H2 2S S，鳥氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，

4、蔗糖，鳥氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖，纖維二糖，明膠。纖維二糖，明膠。取生化管于距離內容物上方取生化管于距離內容物上方2cm2cm處用砂輪割開，迅速于酒精燈火焰消毒，處用砂輪割開，迅速于酒精燈火焰消毒，然后接種菌株，以然后接種菌株，以封口膜封口膜或液體石蠟封口，置或液體石蠟封口，置3535孵育，依據(jù)說明書進行。孵育，依據(jù)說明書進行。6四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟（四）病原細菌的毒力分析（四）病原細菌的毒力分析1 1實驗魚：實驗魚：實驗環(huán)境下暫養(yǎng)實驗環(huán)境下暫養(yǎng)7-107-10天。每組不少于天。每組不少于5050條條，設不少于，設不少于3 3個平行重復。

5、個平行重復。2 2菌懸液制備：菌懸液制備：液體培養(yǎng)基增殖，用無菌生理鹽水懸浮。經計數(shù)后采用等對數(shù)間距設計約液體培養(yǎng)基增殖，用無菌生理鹽水懸浮。經計數(shù)后采用等對數(shù)間距設計約5 5個感染劑量個感染劑量進行感染試驗。對照組以無菌生理鹽水。進行感染試驗。對照組以無菌生理鹽水。3 3注射方法：注射方法：感染前實驗魚用感染前實驗魚用MS-222MS-222麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。（1 1）腹腔注射：腹鰭基部無鱗片處。）腹腔注射：腹鰭基部無鱗片處。（2 2）肌肉注射：背鰭前端與側線之間的中部區(qū)域。）肌肉注射：背鰭前端與側線之間的中部區(qū)域。7四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟

6、（四）藥物敏感性實驗（四）藥物敏感性實驗（一）紙片擴散法（一）紙片擴散法 1.1.原理：原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度遞減的濃度梯度，細菌的生長被抑，細菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥物敏感性越強。物敏感性越強。8四、實驗

7、方法與步驟四、實驗方法與步驟2.2.實驗操作實驗操作 1 1）倒平板）倒平板 2 2）菌懸液制備：）菌懸液制備：挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將菌液濃度調到挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將菌液濃度調到1 1* *107 107 cfu/mLcfu/mL。以玻璃刮鏟將。以玻璃刮鏟將0.1mL0.1mL細菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面；細菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面； 3 3）貼片：）貼片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片

8、。為了能準確觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準確觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）；分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：2828溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24 h24 h，記錄結果；，記錄結果；9四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟結果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細菌濃度有直接關系，觀察抑菌圈的有無。若有抑菌結果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細菌濃度有直接關系，觀察抑菌圈的有無。若有抑菌圈，則測量抑菌圈直徑；若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。圈，則測量抑菌圈直徑；若無抑菌圈，則

9、說明該菌對此藥具有耐藥性。 抑菌圈直徑抑菌圈直徑15mm 15mm 高度敏感高度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10mm 10mm 低度敏感低度敏感 無抑菌圈無抑菌圈 不敏感或耐藥不敏感或耐藥氟：氟：7575g/mLg/mL；恩：；恩：5 5 g/mL g/mL 磺：磺：300300g/mLg/mL；青：；青：10IU/mL10IU/mL10磺磺氟氟靑靑嗯嗯12四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟（二）肉湯試管稀釋法（二）肉湯試管稀釋法 1.1.原理：原理：以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測定以肉湯液

10、體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（MICMIC）。）。 2.2.實驗操作實驗操作 1 1）菌液準備：）菌液準備：挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將菌液濃度調到菌液濃度調到1 1* *107cfu/mL107cfu/mL備用；備用；13四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟2 2）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：配制藥物原液濃度為配制藥物原液濃度為8 8萬萬IU/mLIU/mL（8

11、0mg/mL80mg/mL），），0.45 0.45 m m濾器除菌。濾器除菌。 準備準備1111支支2 mL2 mL無菌無菌EPEP管編號管編號010010排好，在排好，在0 0號管和號管和1 1號管中加號管中加1.8 mL1.8 mL無菌生理鹽水，無菌生理鹽水，210210號管加號管加1 mL1 mL； 吸取吸取0.2 mL0.2 mL藥原液加入第一支藥原液加入第一支EPEP管中混勻，從第一支試管中吸取管中混勻，從第一支試管中吸取0.2 mL0.2 mL加入第二支加入第二支EPEP管混勻，然后吸管混勻，然后吸取取1 mL1 mL加入第三支混勻加入第三支混勻以此類推，直到第十一支；以此類推，

12、直到第十一支； 取取1212支滅過菌的玻璃試管編號支滅過菌的玻璃試管編號1-121-12排好，各加入排好，各加入1.8mL1.8mL滅過菌的培養(yǎng)液，然后從編號相對應的滅過菌的培養(yǎng)液，然后從編號相對應的EPEP管中管中吸取稀釋過的藥液再做吸取稀釋過的藥液再做1010倍比稀釋。倍比稀釋。14四、實驗方法與步驟四、實驗方法與步驟3 3）接種：）接種：每只試管中加入每只試管中加入0.1ml0.1ml的菌液；的菌液； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：置置3737溫箱，培養(yǎng)溫箱，培養(yǎng)24h24h；5 5）結果觀察：）結果觀察：肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌的肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見生長

13、的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MICMIC。根據(jù)結果換算出最小抑菌濃度（根據(jù)結果換算出最小抑菌濃度（g/mLg/mL）。）。8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78無菌生理鹽水無菌生理鹽水1.8mL0.2mL抗生素抗生素8萬萬/mL 下排培養(yǎng)液每管下排培養(yǎng)液每管1.8mL對應加對應加0.2mL 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3 0.15 00.816五、實驗注意事項五、實驗注意事項 分離、接種時嚴格按照無菌操作要求進行。分離、接種時嚴格按照無菌操作要求進行。 革蘭氏染色過程中涂片務求均勻，切忌過厚，染色過

14、程中不可使染液干涸。革蘭氏染色過程中涂片務求均勻，切忌過厚，染色過程中不可使染液干涸。 藥敏實驗，在貼片時用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片藥敏實驗，在貼片時用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。17六、實驗安排六、實驗安排1-41-4節(jié)節(jié)(1)(1)配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（1010包），配制生理鹽水，滅菌（包），配制生理鹽水，滅菌（4 4瓶）；瓶）；(2)(2)完成細菌染色、觀察和生化指標測定；完成細菌染色、觀察和生化指標測定；4-84-8節(jié)節(jié)(1)(1)倒平板接種貼紙；倒平板接種貼紙；(2)(2)藥液稀釋接種；（藥液稀釋接種；（3 3）第二天早上看結果。）第二天早上看結果。18七、實驗報告（一）七、實驗報告（一）1 1記錄菌落特征、細菌形態(tài)、染色結果和生理生化結果（記錄菌落特征、細菌形態(tài)、染色結果和生理生化結果（3030分）。分）。2 2，據(jù)細菌形態(tài)特征和生化指標初步鑒定分離自患病魚的細菌種類（，據(jù)細菌形態(tài)特征和生化指標初步鑒定分離自患病魚的細菌種類（2020分