高效液相色譜-郝建濤

1、高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）主講：郝鳳霞主講：郝鳳霞能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室能源化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目目 錄錄v 基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)理論v 上機(jī)操作前的準(zhǔn)備工作上機(jī)操作前的準(zhǔn)備工作v Agillent 1100 的操作的操作v 常見故障排除常見故障排除v HPLC在科研中的應(yīng)用在科研中的應(yīng)用一、基礎(chǔ)理論一、基礎(chǔ)理論溶于流動(dòng)相溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，大小、

2、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。從而先后從固定相中流出。 1、色譜柱的分離原理色譜柱的分離原理 色譜分析法的分類色譜分析法的分類v按兩相的狀態(tài)分類按兩相的狀態(tài)分類流動(dòng)相流動(dòng)相液體液體流動(dòng)相流動(dòng)相氣體氣體固定相固定相固體固體液體液體固定相固定相固體固體液體液體名稱名稱液固色譜液固色譜液液色譜液液色譜名稱名稱氣固色譜氣固色譜氣液色譜氣液色譜總稱總稱液相色譜液相色譜總稱總稱氣相色譜氣相色譜2、分離模式、分離模式鍵合相色譜、液液色譜、尺鍵合相色譜、液液色譜、尺寸排阻色譜寸排阻色譜鍵合相色譜鍵合相色譜正相色譜： 流動(dòng)相極性 固定相極性常規(guī)分析，80 色譜圖和峰參數(shù)色譜圖和峰參數(shù)

3、v色譜圖色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線。v基線基線(base line)-經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。v噪音噪音(noise)-基線信號的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。v漂移漂移(drift)-基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。3、HPLC中的基本概念和術(shù)語中的基本概念和術(shù)語v色譜峰色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)

4、的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。v峰高峰高(peak height，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。v峰寬（峰寬（peak width，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。v半峰寬（半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。v峰面積峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。v死時(shí)間死時(shí)間(dead time，t0)-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。v保留時(shí)間保留時(shí)間(retention time，tR)-從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出

5、現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。流動(dòng)相的洗脫方式洗脫方式等度洗脫低壓梯度高壓梯度等度洗脫輸輸液液泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器梯度洗脫 A 泵泵進(jìn)樣進(jìn)樣器器色色譜譜柱柱柱溫箱柱溫箱檢測檢測器器 B泵泵AB時(shí)間時(shí)間B 濃濃度度MeOH / H2O = 4 / 6MeOH / H2O = 8 / 2等度洗脫等度洗脫95%30%MeOH 濃濃度度梯度洗脫梯度洗脫是梯度洗脫是 HPLC 的常用手段的常用手段 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷的改變流動(dòng)相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使樣品中每個(gè)組分都有較高的分離度，從而實(shí)現(xiàn)各組分的圓滿分離，

6、梯度洗脫可提高柱效，縮短分析時(shí)間，改善檢測器的靈敏度，它類似于氣相色譜的程序升溫技術(shù)。4、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍 高效液相色譜法適于分析沸點(diǎn)高、相對分子質(zhì)量大，受熱易分解的不穩(wěn)定有機(jī)化合物、生物活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物，這些化合物約占全部有機(jī)化合物的80%，可應(yīng)用于化工生產(chǎn)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工、醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。5、HPLC的系統(tǒng)v輸液泵 相當(dāng)于人的心臟，不斷提供連續(xù)、穩(wěn)定、精確的流量v進(jìn)樣器 樣品引入系統(tǒng)v色譜柱 關(guān)鍵部分，在這里樣品實(shí)現(xiàn)分離v檢測器 對分離后的樣品進(jìn)行檢測v數(shù)據(jù)記錄與處理裝置數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系

7、統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成Agilent 1100 高效液相色譜儀儲液瓶真空脫氣機(jī)混合室自動(dòng)進(jìn)樣器分離柱VWD六通閥進(jìn)樣演示分離系統(tǒng)色譜柱分離系統(tǒng)色譜柱功能：功能：組分分離組分分離目標(biāo)：目標(biāo)：分辨力強(qiáng)分辨力強(qiáng)效率高效率高吸附劑化學(xué)鍵和固定相色譜柱吸附劑化學(xué)鍵和固定相色譜柱v化學(xué)鍵合相色譜柱化學(xué)鍵合相色譜柱:70% 將不同的官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)將不同的官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而形成化學(xué)鍵和固定相，進(jìn)而形成化學(xué)鍵和相色譜柱。形成化學(xué)鍵和固定相，進(jìn)而形成化學(xué)鍵和相色譜柱。反相反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相

8、色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。正相正相: 20%;-NH2、 -CN其它其它 (手性柱，手性柱， 離子交換柱離子交換柱): 10%柱溫箱柱溫箱控制溫度，保證分析結(jié)果重控制溫度，保證分析結(jié)果重現(xiàn)性現(xiàn)性升高溫度，降低了流動(dòng)相的升高溫度，降低了流動(dòng)相的黏度，降低柱壓，保證色譜黏度，降低柱壓，保證色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性系統(tǒng)的穩(wěn)定性升溫對于反相升溫對于反相 HPLC分離強(qiáng)疏水肽的影響分離強(qiáng)疏水肽的影響 (B27)流動(dòng)相流動(dòng)相: A: 含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2% B / min進(jìn)樣量進(jìn)樣

9、量: 100L (50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV: 210 nm流速流速: 1 mL/min室溫室溫液相色譜柱液相色譜柱: C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室溫室溫300C400C500C600C700C提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）效（提高靈敏度）檢測器選擇性紫外紫外(VWD(VWD、DAD)DAD)熒光熒光電化學(xué)電化學(xué)通用型示差折光示差折光蒸發(fā)光散射蒸發(fā)光散射質(zhì)譜質(zhì)譜檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 檢測器簡介（一）檢測器簡介（一）紫外吸收紫外吸收檢測器（檢測器（UVD）原理：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的 變化來測定樣品濃度的檢測

10、器。它具有波長固定，波長可變和光二極管陣列三種類型。特點(diǎn)：選擇性檢測器、波長檢測范圍：190-800nm ；對流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）；應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)；對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，AKbc2022-6-8光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。檢測器簡介（二）檢測器簡介（二）熒光檢測器（fluorescenc

11、e detector） （FLD）原理：某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)檢測。特點(diǎn)：選擇性檢測器、靈敏度高（10-12g）、對流量和溫度敏感性低。 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。檢測器簡介（三）檢測器簡介（三）檢測器簡介（四）檢測器簡介（四） 蒸發(fā)光散射蒸發(fā)光散射檢測器（檢測器（ELSDELSD）原理：通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的

12、程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測器。檢測器簡介（五）檢測器簡介（五） 電導(dǎo)電導(dǎo)檢測器（檢測器（ECDECD）原理：監(jiān)測溶液的電導(dǎo)率變化的檢測器。特點(diǎn)：選擇性檢測器、測量時(shí)要求恒溫、對流動(dòng)相的組成變化有明顯響應(yīng)、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型化合物。 示差示差折光指數(shù)折光指數(shù)檢測器（檢測器（RIDRID）原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度的檢測器。特點(diǎn)：通用性檢測器，溫變化要保持在0.001、靈敏度低（10-6g） 二、上機(jī)操作前，我們需要準(zhǔn)備好什么？如：樣品怎么處理？ 流動(dòng)相怎么選？ 儀器參數(shù)怎么設(shè)置？

13、 1樣品的前處理樣品的前處理v 最好使用流動(dòng)相溶解樣品。v 使用預(yù)處理除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填 料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。v 使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。樣品準(zhǔn)備樣品完全溶解在流動(dòng)相中樣品沒有完全溶解過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱的溶劑溶解樣品進(jìn)樣量盡量小樣品過濾頭的類型樣品過濾頭的類型：v30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格材料有，纖維素，醋酸纖維，聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。v13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。v3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體

14、積為7l。濾膜類型濾膜類型：v聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。v醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。v尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。v再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。v注意：1：每張濾膜只能用一次。 2：水相和有機(jī)相不要搞混。2流動(dòng)相的配制流動(dòng)相的配制 v 流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。v 流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)v 流動(dòng)相的黏度要盡量小分離效果好柱壓低，延長

15、液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)v流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。v流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。v在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。準(zhǔn)備流動(dòng)相準(zhǔn)備流動(dòng)相1) 色譜級純或優(yōu)級純乙腈或甲醇 水超純水，18.2Mcm過濾裝置為什么要過濾？1、對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用v色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。v儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的

16、磨損。2、消除由于污染對分析結(jié)果的影響3) 溶劑準(zhǔn)備：脫氣溶劑準(zhǔn)備：脫氣目目 的的流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解氣體。v 以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。v 溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。v 若用FLD，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法常用的脫氣方法v氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。v加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。v抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。v超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波

17、容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。v在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。3、流動(dòng)相流速的選擇、流動(dòng)相流速的選擇v具體根據(jù)色譜柱的內(nèi)徑選擇 柱子的內(nèi)徑（5m填料）流速（ml/min）4.61 - 23.00.4 - 0.82.10.2 - 0.41.00.05 - 0.094、波長選擇、波長選擇v首先在可見紫外分光光度計(jì)上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸

18、收度小于0.5時(shí)，HPLC測定的面積將會很小。5記錄時(shí)間記錄時(shí)間v第一次測定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度及是否還有雜質(zhì)峰在較長時(shí)間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。三、三、Agilent 1100 機(jī)器操作機(jī)器操作1、檢查流動(dòng)相、檢查流動(dòng)相vPurge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài)Purge閥 逆時(shí)針打開清洗閥順時(shí)針關(guān)閉清洗閥毛細(xì)管出口,流向進(jìn)樣器廢液管,清洗閥打開時(shí)溶劑由此流向廢液瓶.1、檢查流動(dòng)相vPurge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài)v把流動(dòng)相放入溶劑瓶中，且濾頭浸入到

19、液面下 A 水 B 甲醇 C 乙腈 D 緩沖液2、沖洗管路、沖洗管路v選擇流動(dòng)相為10異丙醇90水 （按此比例配好溶液后存放在礦泉水瓶中） 調(diào)節(jié)流速大約為1d/3s。3、打開電腦，等待、打開電腦，等待TAP窗口出現(xiàn)窗口出現(xiàn)4、打開、打開1100各模塊開關(guān)各模塊開關(guān)指示燈狀態(tài)指示燈狀態(tài)每個(gè)部件接通電源后LED燈顯示綠色關(guān)機(jī) power off準(zhǔn)備進(jìn)樣 power on沒準(zhǔn)備好Not Ready運(yùn)行Run故障Error駐留ResidentBlink儀器LED狀態(tài)顯示電源開關(guān)顯示黑Black黑Black黃Yellow綠Green紅Red黃閃爍Yellow blinking6種LED儀器狀態(tài)：5、待、

20、待1100自檢完畢，雙擊自檢完畢，雙擊online，啟動(dòng)，啟動(dòng)工作站工作站化學(xué)工作站自動(dòng)與化學(xué)工作站自動(dòng)與1100LC通訊，進(jìn)入工通訊，進(jìn)入工作站畫面。作站畫面。其它功能菜單文件處理運(yùn)行控制儀器控制序列放棄任務(wù)在線幫助工作站任務(wù)切換快捷鍵方法存取快捷鍵方法存取快捷鍵序列存取快捷鍵運(yùn)行方法運(yùn)行序列面對工作站，我該怎么辦？What should I do？v我們知道要運(yùn)行樣品需要設(shè)置控制儀器的參數(shù)，比如泵流速、流動(dòng)相比例、柱溫、檢測器波長、樣品校正等；v在Agilent化學(xué)工作站中我們把儀器控制和數(shù)據(jù)分析以及儀器相關(guān)的運(yùn)行等所有參數(shù)稱為一個(gè)方法Method；v所以要運(yùn)行一個(gè)樣品，首先要得到一個(gè)正確

21、的方法；v在Agilent化學(xué)工作站中要得到方法要么調(diào)用一個(gè)已經(jīng)存在的方法，要么自己編輯一個(gè)新的方法；v一般來說，通過查閱資料比如國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、藥典、專業(yè)技術(shù)資料、EPA等都可以得到樣品分析的詳細(xì)方法；v您需要做的就是把這些方法在Agilent化學(xué)工作站中建立起來，然后運(yùn)行儀器并得到數(shù)據(jù)。6、方法的編輯、方法的編輯1）調(diào)用方法在Method中點(diǎn)擊Load Method工作站彈出下面對話框.在右面對話框中選中要調(diào)用的方法名,點(diǎn)擊“OK”,該方法即被激活.使用 Edit Entire Method 編輯一個(gè)完整的方法2）編輯一個(gè)新方法選擇所要編輯的內(nèi)容畫面1:方法組成在你想要的部分前選中,否

22、則方法里將不包括該部分的內(nèi)容。比如本方法不包括數(shù)據(jù)分析的內(nèi)容。方法信息儀器控制與數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)分析運(yùn)行時(shí)間表方法信息 (Method Information)畫面2：方法信息輸入您想要對方法的說明，比如方法的用途、來源等信息。包括：流量(Flow)，流動(dòng)相組成(Solvents)，停止采集時(shí)間(Stop Time)，梯度編程(Timetable)，壓力限制設(shè)定(Pressure Limits)泵的操作參數(shù)壓力限制：Max最高壓力，Min最低壓力流動(dòng)相梯度表輸入流量(Flow)輸入停止采集時(shí)間(Stop Time)輸入流動(dòng)相組成，B、C、D可輸，A=100-B-C-D輸入流動(dòng)相名稱畫面3：泵參數(shù)（

23、四元泵）檢測器參數(shù)設(shè)置畫面5：檢測器參數(shù)VWD輸入使用的波長l控溫范圍：低于室溫1080l兩個(gè)單獨(dú)的加熱區(qū)。 l安裝切換閥可以進(jìn)行柱切換。l可以容納30 cm長色譜柱。l安裝柱識別可以自動(dòng)記錄進(jìn)樣次數(shù)。柱溫箱畫面6：恒溫柱箱參數(shù)設(shè)置輸入控制溫度溫度編程表從Method菜單選擇Save Method / Save Method as或從存貯方法工具圖標(biāo)存貯方法。存貯方法換名保存覆蓋保存另存時(shí)在此處輸入方法名7、樣品的測定要分析單個(gè)樣品, 從RunControl菜單選擇 Sample Info., 輸入樣品信息。樣品信息包括：操作者姓名(Operator Name)，存盤數(shù)據(jù)文件(Data Fil

24、e)，樣品參數(shù)(Sample Parameters)。然后運(yùn)行方法(Run Method)。指定樣品瓶號及數(shù)據(jù)路徑樣品瓶所放位置子目錄名稱數(shù)據(jù)形式Manual為手動(dòng)，Prefix/Counter為自動(dòng)累加。從從Instrument 菜單選擇菜單選擇System on。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊紅色或藍(lán)色標(biāo)題，即可將Y軸顯示成對應(yīng)的相應(yīng)值和單位8、數(shù)據(jù)分析v從“View ”菜單中，單擊“Data analysis”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面 v從“File ”菜單選擇“Load signal ” ，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。 調(diào)用信號文件疊放多個(gè)信號文件v做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“S

25、ignal options ”選項(xiàng)。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時(shí)間，單擊ok，或選擇”Use Ranges ”調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。 圖形優(yōu)化圖形優(yōu)化Signal Options信號選項(xiàng)積積 分分v 從“Integration ”中選擇 “Auto integrate ”，如積分結(jié)果不理想，再從菜單中選擇“Integration Events ”選項(xiàng)，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。積分參數(shù)優(yōu)化Integration Events積分參數(shù)選項(xiàng)（及快捷鍵）積分參數(shù)Sl

26、ope Sensitivity設(shè)置斜率靈敏度，截除噪音積分Peak Width設(shè)置半峰寬度，遠(yuǎn)大于或小于該數(shù)值的峰的積分將被截除Area Reject設(shè)置面積截除，截除面積低于此值的峰的積分Height Reject設(shè)置峰高截除Shoulders設(shè)置肩峰參數(shù)這是一張優(yōu)化了積分參數(shù)的譜圖積分，噪音及雜質(zhì)積分已被截除。9、打印報(bào)告10、回到Method and Run control 可繼續(xù)測量11、關(guān)機(jī)v1）沖洗管路和色譜柱30min A：水 B：甲醇（如果使用了D緩沖溶液，則用一干凈小燒杯盛放超純水） 流速：5ml/minv2）用甲醇2030ml沖洗進(jìn)樣閥v3）關(guān)閉工作站v4）關(guān)閉TAP窗口v

27、5）關(guān)1100的電源v6）關(guān)電腦v7）在大型儀器使用記錄本上登記v8）關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的水、電、氣及門窗等小結(jié)：液相色譜操作步驟小結(jié)：液相色譜操作步驟v倒入流動(dòng)相，裝柱v開機(jī)：計(jì)算機(jī)Bootp 開設(shè)備v打開Chemstation工作站v創(chuàng)建（調(diào)用）方法v排氣：打開排氣閥，先排有機(jī)相、再排無機(jī)相，5ml/minv流速調(diào)至0.1ml/min，擰緊排氣閥。v平衡柱子：梯度升速至最終流速，基線平直1015minv系統(tǒng)平衡后點(diǎn)擊“start”開始進(jìn)樣v操作結(jié)束：10%有機(jī)相+90%水洗柱0.5h；再用純有機(jī)相洗0.51h；梯度降速至0ml/minv關(guān)機(jī)、卸柱子四、常見故障排除四、常見故障排除 液相色譜儀結(jié)構(gòu)復(fù)

28、雜，且不同型號的色譜儀，出故障時(shí)產(chǎn)生液相色譜儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同型號的色譜儀，出故障時(shí)產(chǎn)生的現(xiàn)象有可能不同，以下羅列的現(xiàn)象僅供參考的現(xiàn)象有可能不同，以下羅列的現(xiàn)象僅供參考：現(xiàn) 象原 因排除方法1.柱前導(dǎo)管接頭漏液2.泵柱室內(nèi)有大量氣泡存在3.貯液瓶內(nèi)試劑用完4.輸液泵未工作1.檢查各接口是否有漏液；2.放開泵出口接頭；用“清洗”鍵沖洗泵體；3.添加流動(dòng)相；4.按輸液泵操作方法，檢查其工作狀態(tài)。 常常 見見 故故 障障 排排 除除現(xiàn) 象原 因排除方法1.分離柱阻力過大(陳舊柱子)2.柱前導(dǎo)管堵塞3.泵柱塞內(nèi)有少量氣泡存在4.柱子進(jìn)口處過濾膜堵塞5.進(jìn)樣閥手柄未旋到底(處于中間狀態(tài))6.導(dǎo)管中有顆粒

29、狀固體堵塞1.更換柱子2.從柱后開始逐級向上拆開接頭檢查3.拆開泵接頭，用“清洗”檔趕盡氣泡。4.拆開柱前接頭、更換或清洗過濾膜5.左右旋動(dòng)六通閥至極限位置6.逐級檢查，并更換導(dǎo)管 常常 見見 故故 障障 排排 除除現(xiàn) 象原 因排除方法1.流動(dòng)相中存在大顆粒的物質(zhì)2.樣品未經(jīng)過過濾處理3.柱子輸入端濾片污染1.流動(dòng)相經(jīng)5m的真空抽濾瓶過濾后再使用2.樣品須經(jīng)濾膜過濾3.拆下柱的濾片用超聲波清洗，同時(shí)刮去柱口表面被污染的固定相1.流通池內(nèi)留有大量的氣泡2.流通池漏液3.紫外檢測器有故障1.排除氣泡2.檢修流通池3.停止恒流泵工作，檢查紫外檢測器 現(xiàn) 象原 因排除方法1.波長選擇不正確2.檢測器輸

30、出衰減 太大3.進(jìn)樣口漏液4.進(jìn)樣閥樣品廢液管堵塞，樣品未進(jìn)入定量管 5.進(jìn)樣后未按啟動(dòng)鍵6.定量管容積過小7.樣品濃度過稀8.檢測器燈源老化或失效9.流動(dòng)相不純1.按標(biāo)準(zhǔn)重新選擇波長2.重新選擇輸出量程范圍3.修理進(jìn)樣閥4.拆下六通閥上廢液管(5#，6#)重新安裝5.進(jìn)樣后立即按啟動(dòng)鍵6.更換大容量定量管7.濃縮樣品后再進(jìn)樣8.更換燈源9.選擇高純度的流動(dòng)相 常常 見見 故故 障障 排排 除除現(xiàn) 象原 因排除方法1.設(shè)置溫度值過低2.柱箱密封蓋未蓋好3.溫度控制器未啟動(dòng)4.柱箱升過高溫后， 再設(shè)置低溫5.溫控部件有故障6.控溫鉑電阻接觸 不良1.設(shè)置最低溫度應(yīng) 室溫以上102.檢查柱安裝過程

31、3.按 起始 鍵(指示燈 亮)4.開機(jī)后會逐漸穩(wěn)定 (正?，F(xiàn)象)5.修理溫度控制器6擰緊固定鉑電阻引 線的螺釘 常常 見見 故故 障障 排排 除除現(xiàn) 象原 因排除方法檢測器開機(jī)時(shí)屏幕 顯示不正常，出現(xiàn)缺字、坐標(biāo)圖形異樣、光標(biāo)無法移動(dòng)等現(xiàn)象。工作電源不正?；騼x器附件有強(qiáng)干擾源存在。1.檢查工作電源電壓，采取穩(wěn)壓措施2.關(guān)機(jī)后重新開機(jī)3.檢測器微機(jī)系統(tǒng)故障常見圖譜分析常見圖譜分析 由于液相色譜儀在工作中受到的影響因素較多，因此出現(xiàn)的色譜圖形也較為復(fù)雜，除與操作者的使用和儀器所處的環(huán)境有關(guān)外，還與分離柱、流動(dòng)相性質(zhì)、分析對象的性質(zhì)、所選擇的工作條件有關(guān)?，F(xiàn)僅對與儀器性能有關(guān)的常見圖譜作一粗略分析，供

32、參考。 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除1.環(huán)境溫度變化過大環(huán)境溫度變化過大2.液流不穩(wěn)定或有漏液液流不穩(wěn)定或有漏液3.在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)1.避開室內(nèi)通風(fēng)口位避開室內(nèi)通風(fēng)口位 置和發(fā)熱或制冷源置和發(fā)熱或制冷源2.觀察泵的工作狀態(tài)觀察泵的工作狀態(tài), 并查漏并查漏3. 110-4Au 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除1.外界干擾訊號外界干擾訊號2.輸液泵柱室內(nèi)有氣泡輸液泵柱室內(nèi)有氣泡3.流通池內(nèi)有氣泡流通池內(nèi)有氣泡1.使機(jī)殼良好接地，使機(jī)殼良好接地， 排除附近干擾源排除附近干擾源2.用用“清洗清洗”鍵或排鍵或排 放閥排除氣泡放閥排除氣泡3.

33、拆下輸入導(dǎo)管，大拆下輸入導(dǎo)管，大 流量沖洗池體或在流量沖洗池體或在 池體出口增加阻力池體出口增加阻力 (接長排液導(dǎo)管接長排液導(dǎo)管)漂移漂移1.儀器在穩(wěn)定中儀器在穩(wěn)定中2.在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)在技術(shù)指標(biāo)范圍內(nèi)3.柱箱升過高溫后，柱箱升過高溫后， 再處于室溫工作再處于室溫工作4.檢測器工作不穩(wěn)定檢測器工作不穩(wěn)定1.正?，F(xiàn)象正常現(xiàn)象2.屬正常狀態(tài)屬正常狀態(tài)3.將分離柱從柱箱將分離柱從柱箱 內(nèi)取出后使用內(nèi)取出后使用4.元器件工作點(diǎn)不穩(wěn)元器件工作點(diǎn)不穩(wěn) 定，修理后再使用定，修理后再使用 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除1.組份分離不佳組份分離不佳 a.色譜柱選擇有誤色譜柱選擇有誤 b.

34、流動(dòng)相不符合分析要求流動(dòng)相不符合分析要求 c.柱后導(dǎo)管過長柱后導(dǎo)管過長2.波長選擇不正確波長選擇不正確3.流速過大流速過大1.重疊峰重疊峰 a.更換色譜柱更換色譜柱 b.重新選擇流動(dòng)相重新選擇流動(dòng)相 c.盡可能減短柱后導(dǎo)管長度盡可能減短柱后導(dǎo)管長度2.重選波長，增大組重選波長，增大組 份的吸光度差異份的吸光度差異3.減小流量值減小流量值1流動(dòng)相已用完流動(dòng)相已用完2溫度控制器失控溫度控制器失控 (恒溫開啟條件下恒溫開啟條件下)3在工作過程添加在工作過程添加 流動(dòng)相流動(dòng)相1.突然漂移大多為突然漂移大多為 流動(dòng)相用完造成流動(dòng)相用完造成2.檢查溫度控制器檢查溫度控制器3.盡可能不要在工作盡可能不要在工作時(shí)加流動(dòng)相，可采用時(shí)加流動(dòng)相，可采用較大的貯液瓶較大的貯液瓶 圖圖 譜譜分析原因分析原因現(xiàn)象說明及排除現(xiàn)象說明及排除1放大器量程選擇放大器量程選擇 過大過大2放大器無輸出放大器無輸出3二次儀表或檢測器二次儀表或檢測器 失效失效1.減小量程范圍減小量程范圍(若接若接 積分儀，可減小儀積分儀，可減小儀 器的滿度電壓值器的滿度電壓值)2. 未按起始鍵未按起始鍵 3.更換失效的部件更換失效的部件基線無噪聲基線無噪聲出倒峰出倒峰1.組份吸光度小于流組份吸光度小于流 動(dòng)相的吸光度動(dòng)相的吸光度2.流動(dòng)相在該波長的流動(dòng)相在該波長的 透過率透過率100%3.輸出訊號極性接反輸出訊號極