Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 定義：n印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。n1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。n而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法Western Blot基本原理基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種

2、固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。n蛋白樣品的制備nSDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色 蛋白樣品的定量Bradford法 考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ 將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/

3、ml, 0.5mg/ml。）管號012345678ddH2O807070707070707070蛋白標(biāo)準(zhǔn)液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電

4、價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過硫酸銨(時間)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉(zhuǎn)膜半干法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。

5、只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。 一抗、二抗孵育n把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時，4 過夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。n加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 37一小時，4 過夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。 辣根過氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（AP） 化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)？ 背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高 原原因因?qū)Σ卟咿D(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)