細(xì)菌半數(shù)致死量測定張玉晴

1、細(xì)菌細(xì)菌LD50測定方法測定方法報告人：張玉晴報告人：張玉晴指導(dǎo)老師：李槿年教授指導(dǎo)老師：李槿年教授大綱1LD50基本概念2LD50計算方法LD50具體操作步驟3注意事項4w半數(shù)致死量：LD50（Lethal dose）表示在規(guī)定時間內(nèi),通過指定感染途徑,使一定體重或年齡的某種動物半數(shù)死亡所需最小細(xì)菌數(shù)或毒素量。 1LD50基本概念w1、寇氏法/改良寇氏法w2、累計法（Reed-Muench法）w3、霍恩氏法（Horn氏法）w4、加權(quán)法w5、序貫法w6、固定劑量法w7、logistic模型法LD50計算方法2w1、寇氏法/改良寇氏法 公式：LD50= lg -1Xm i (P 0.5) X50

2、=lgLD50 LD50 95%可信限=lg -1（X50 1.96SX50） LD50平均可信限=LD50 （LD50可信限高限-低限）/2 Xm：最大劑量的對數(shù)值i ：相鄰兩組劑量對數(shù)值之差P：各組動物死亡率，用小數(shù)表示P：各組動物死亡率之總和 n：每組動物數(shù)w預(yù)試驗找出引起0%死亡率和100死亡率劑量的所在范圍w反應(yīng)量大致呈正態(tài)分布w劑量必須按等比級數(shù)分布w各組動物數(shù)相等w2、累計法（Reed-Muench法） 它是先將實驗死亡動物數(shù)和存活動物數(shù)進(jìn)行累計加和, 再用加和的數(shù)據(jù)計算死亡率。在死亡率中有2個數(shù)據(jù)A和B,且A剛好大于50%,B剛好小于50% w計算方便, 更多地運(yùn)用在微生物學(xué)中

3、, 尤其在稀釋分析中w不考慮操作誤差, 計算結(jié)果不夠精確, 粗略判斷LD50。擬態(tài)弧菌對草魚LD50的測定335%來蘇爾浸泡24h自來水沖洗15432一、實驗準(zhǔn)備：二、細(xì)菌總數(shù)測定 挑取HX4單個菌落10mL生理鹽水重懸100mLBHI液體培養(yǎng)基離心收集菌體洗滌菌體3次測量菌落大小30 150r/min振蕩培養(yǎng)24h8000r/min離心8min平板菌落計數(shù)法計數(shù)4保存用于攻毒10-110-310-210-410-510-610-710-810-930倒置倒置培養(yǎng)培養(yǎng)24h記錄平板上菌落數(shù)記錄平板上菌落數(shù)量，肉眼觀察量，肉眼觀察+放放大鏡檢查大鏡檢查w數(shù)據(jù)處理 選取同一稀釋度平均菌落數(shù)在303

4、00個之間的平板1、一個稀釋度，平均菌落數(shù)在30300個之間時，乘以稀釋倍數(shù)報告。2、如有兩個稀釋度平均菌落數(shù)均在30300個之間，則應(yīng)求出兩者總菌數(shù)之比，比值小于或等于2應(yīng)報告平均數(shù)，大于2則報告其中較小的數(shù)字。3、如所有稀釋度的平均菌落數(shù)均多于300個，應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)報告。 4、如所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30個，則按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)報告。5、如所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一個稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。w三、攻毒0.01g/LMS-222麻醉0.3mL

5、1.210102.41094.81089.61071.9107分別腹腔注射5組魚三、攻毒 觀察7天內(nèi)草魚的發(fā)病和死亡情況，記錄結(jié)果，按Reed-Muench氏法計算LD50 病死魚無菌解剖，觀察內(nèi)臟病變情況，并用接種環(huán)蘸取內(nèi)臟接種于BHI固體培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)2d，對分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。組組別別劑量CFU/mL只數(shù)死亡數(shù) 存活數(shù)累計結(jié)果(result)生死死亡比例 死亡率11.2101055014/14100.0%24.01095419/1090.0%31.31095325/862.5%44.41085232/822.2%51.51085050/110.0%LD50=4.2107CFU/mL0表1 HX4菌對斑馬魚的毒力（LD50據(jù)匯總：組別 稀釋比例 死亡率1 原液 100%2 1:3 90.0%3 1:9 62.5%4 1:27 22.2%5 1:81 0.0%w7、LD50計算 距離比例r=（高于50%死亡率50）（高于50%死亡率低于50%死亡率） =（62.550）（62.522.2） =0.310 lgLD50=高于50%死亡率稀釋度倒數(shù)的對數(shù)+距離比例稀釋倍數(shù)的對數(shù) =lg9+0.310lg3=1.1021 LD50=14.3515 即當(dāng)細(xì)菌原液稀釋成1:14.3515時，腹腔注射斑馬魚，能使50%斑馬魚發(fā)生死亡。