浙液相色譜講義五：液相色譜的實(shí)用技術(shù),色譜柱的保養(yǎng)、樣品前處理

1、液相色譜實(shí)用技術(shù)液相色譜實(shí)用技術(shù)色譜柱的使用及保養(yǎng)良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測(cè)柱效保留在新色譜柱上測(cè)得的色譜圖，并記錄條件定期檢測(cè)柱效定期檢測(cè)儀器的譜帶展寬色譜柱的使用及操作色譜柱的使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換.特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱 樣品及溶劑的要求記記住住拿拿到到一一根根從從未未用用過過的的色色譜譜柱柱時(shí)時(shí) 一一定定要要先先看看其其使使用用說說明明！色譜柱的保養(yǎng)（一）色譜柱的保養(yǎng)（一）樣品方面.除去微粒及雜質(zhì).了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出 .了解樣品與色譜柱的基

2、質(zhì)/填料是否相互作用色譜柱的保養(yǎng)（二）色譜柱的保養(yǎng)（二）流動(dòng)相方面.除去微粒.純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量.流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例在線的保護(hù)裝置在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù).除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù).防止分析柱被化學(xué)污染裝置.在線過濾器.自裝填料保護(hù)柱.預(yù)裝保護(hù)柱在線過濾器在線過濾器In-Line Filter，部件號(hào) WAT084560.防止顆粒在色譜柱頭累積.優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效.在需要高柱效的分析時(shí)中常用（如：氨基酸分析）可更換

3、的消耗品.更換濾芯，部件號(hào) WAT005139 (5/pkgs).更換墊圈，部件號(hào) WAT084567 (10/pkgs)保護(hù)柱保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個(gè)色譜柱的柱效，特別是在用微柱時(shí)保護(hù)柱的種類.普通自裝填料的保護(hù)柱Waters的部件號(hào)，WAT084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大.Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters的部件號(hào)，WAT088141有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低可換芯式保護(hù)柱可換芯式保護(hù)柱新型的保護(hù)柱新型的保護(hù)柱 Sentry Guard適應(yīng)的用戶類型.非常臟, 非常復(fù)雜的樣品本底生化樣品, 溶液環(huán)境

4、樣品食品.不想作太多的固相萃取.不想降低柱效新型的保護(hù)柱新型的保護(hù)柱 Sentry GuardSentry Guard 的特點(diǎn)的特點(diǎn)特點(diǎn).高質(zhì)量, 高效填料 - 不損失柱效.增加分析柱效 - 增加適應(yīng)范圍.20mm柱長(zhǎng) - 臟樣品載荷能力大，能延長(zhǎng)保護(hù)柱壽命.手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具通用柱套 - 適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑)整體式（對(duì)Waters柱）- 使用方便，容易.各種不同填料配合Waters柱Sentry Guard 的規(guī)格的規(guī)格產(chǎn)品描述.3.920mm柱長(zhǎng).適應(yīng)任何色譜柱，不需工具即可安裝及更換.可換柱芯式設(shè)計(jì)，提供各種填料:BondaPak: C18, phen

5、yl, CN, NH2, SilicaNova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, SilicaResolve: C18, C8, SilicaDelta-Pak: C18, C4Symmetry:C18, C8色譜柱的清洗色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗記記住住每每種種色色譜譜柱柱可可能能有有特特定定的的方方法法 一一定定要要先先看看其其使使用用說說明明！色譜柱的存放色譜柱的存放存放前

6、的處理.除去雜質(zhì)、鹽 合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度色譜柱常見毛病色譜柱常見毛病柱壓過高.多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低柱壓過高柱壓過高 為什么柱壓會(huì)過高.微粒堵塞樣品流動(dòng)相密封墊.柱床膨脹.不可逆吸附.細(xì)菌生長(zhǎng)柱效低柱效低為什么柱效低.色譜柱被污染.過濾片部分堵塞樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞.色譜柱內(nèi)的死體積流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯重復(fù)性差、回收率低重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差.色譜柱被污染.流動(dòng)相

7、pH值及組成不合適造成鍵合相流失.樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰.“不可逆”吸附.固定相過強(qiáng)或流動(dòng)相過弱.非特異性吸附色譜柱以外的因素（一）色譜柱以外的因素（一）“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！.儀器問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測(cè)器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞.流動(dòng)相問題：色譜柱未平衡好.進(jìn)樣量太大色譜柱與儀器的聯(lián)接色譜柱與儀器的聯(lián)接除HP外，不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時(shí)，會(huì)造成：.色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：.自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭.使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動(dòng)的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從Phase

8、Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。Waters色譜柱的聯(lián)接色譜柱的聯(lián)接Waters及Phase Separations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長(zhǎng)度不同，其長(zhǎng)度被稱為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長(zhǎng)度為0.130英寸Spherisorb品牌的色譜柱及Phase Separations公司其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其 stop-depth 為0.090英寸不同的不同的Stop-Depth長(zhǎng)度長(zhǎng)度色譜柱以

9、外的因素（二）色譜柱以外的因素（二）柱壓過高問題，不一定是色譜柱問題！.系統(tǒng)反壓?jiǎn)栴}阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱.壓力傳感器不準(zhǔn)確.流速是否錯(cuò)誤?色譜柱以外的因素（三）色譜柱以外的因素（三）實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差.梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足.溫度波動(dòng).流動(dòng)相組成改變.樣品溶劑不同.樣品穩(wěn)定性不好.方法的開發(fā)不好緩沖液的pH值不合適緩沖液的緩沖能力不足簡(jiǎn)單的判別方法簡(jiǎn)單的判別方法高的柱反壓是否伴隨著.保留時(shí)間變化? .峰形變壞? .分辨率變壞? 測(cè)量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬.典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于 100 微升.如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng)測(cè)量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬測(cè)量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬卸下

10、色譜柱，用UNION代替之按測(cè)柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約25微升用5 sigma方法測(cè)4.4%峰高處的峰寬：W儀器參數(shù).流速 1.0 ml/min.紙速 20 cm/min (用記錄儀時(shí)，接檢測(cè)器10mV檔).檢測(cè)器靈敏度 0.5-1.0AUFS (用記錄儀時(shí)).檢測(cè)器時(shí)間常數(shù) 小于0.2譜帶展寬（ml） =1000W（cm）/20（記錄儀）=1000W（min） （工作站）流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有.與檢測(cè)器匹配.脫氣.避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）.溶劑的粘度.細(xì)菌的

11、生長(zhǎng)流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的.使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高.提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低.保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動(dòng)相脫氣的方法流動(dòng)相脫氣的方法加熱.簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空.同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波.簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）.可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī).可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的.除去微粒.減少干擾雜質(zhì).濃縮微量的組份.提高檢測(cè)的

12、靈敏度及選擇性.改善分離的效果.有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品的預(yù)處理重要性樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例.樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大.消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié).影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟是決定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取 / 液-液萃取. Sep-Pak樣品處理小柱其他樣品預(yù)處理的過程樣品預(yù)處理的過程去除微粒去除微粒過濾.過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)膜片可更換.一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉

13、污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g超濾超濾機(jī)理.超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的.根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份.除去小分子樣品中的大分子蛋白.脫鹽選擇性沉淀選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白.有機(jī)溶劑乙腈，甲醇.強(qiáng)酸三氯乙酸，過氯酸.鹽50% 硫酸銨10% TCA樣品衍生樣品衍生提高檢測(cè)的靈敏度.增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)的靈敏度.增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離的選擇性.改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子.氨基酸分析樣品衍生樣品衍生 氨基酸分析氨基酸分析PICO-TAG方法NCSNH2CH

14、COO-RNHCSNHCH COO-R氨基酸異硫氫酸苯酯AccQ-Tag 衍生法衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+AQC衍生試劑及氨基酸衍生后的氨基酸CO26-氨基鄝啉N-羥基琥珀酰亞胺N-羥基琥珀酰亞胺半衰期1秒半衰期約15秒濃縮樣品濃縮樣品濃縮樣品的方法. 萃取/吹干. 沉淀/再溶解. 色譜法. 液固抽提/Sep-Pak小柱固相萃?。ü滔噍腿。⊿PE）技術(shù)）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性.實(shí)驗(yàn)室中6080%的成本及工作量在樣品制備上加速樣品的制備時(shí)間降低樣品前處理的成本提

15、高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動(dòng)化減少樣品處理步驟降低對(duì)不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性Waters的的Sep-Pak小柱小柱Waters專門開發(fā)了固相萃取技術(shù)（SPE）Sep-Pak小柱的應(yīng)用領(lǐng)域.除去雜質(zhì)及干擾組份.把樣品分成不同極性的組分析.富集微量的組份Sep-Pak小柱的主要種類.反相.正相.離子交換Sep-Pak的種類的種類根據(jù)Sep-Pak及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用. 讓所感興趣的樣品通過小柱，雜質(zhì)留在柱上. 讓雜質(zhì)留在柱上，所感興趣的樣品通過小柱反 相正 相離子交換固定相非非極極性性極極性性帶帶電電荷荷溶 劑從從

16、極極性性到到非非極極性性從從非非極極性性到到極極性性p pH H或或離離子子強(qiáng)強(qiáng)度度( (低低到到高高) )各種各種Sep-Pek小柱（一）小柱（一）正相.包括 Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina可先用6到10倍柱體積的非極性（通常是樣品溶液）平衡加入樣品用非極性溶劑洗脫不想要的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份.在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如 NH2 / CN.確認(rèn)回收率各種各種Sep-Pek小柱（二）小柱（二）反相.包括 C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol

17、 / NH2 / CN可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中加入樣品用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份.確認(rèn)回收率各種各種Sep-Pek小柱小柱(三三)離子交換.包括 Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡，樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中加入樣品用弱緩沖液洗脫不想要的組份用強(qiáng)一些緩沖液（改變pH或離子強(qiáng)度）洗脫第一組感興趣的組份用更強(qiáng)的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組

18、份.確認(rèn)回收率Sep-Pak小柱的方法開發(fā)小柱的方法開發(fā)SPE方法開發(fā)的幾個(gè)關(guān)鍵因素.文獻(xiàn)查閱Waters有專門Sep-Pak應(yīng)用資料的數(shù)據(jù)庫（P/N = 88286）查閱Waters的網(wǎng)頁（http:/）.流速控制同色譜理論：以10ml/min潤(rùn)濕小柱，15ml/min加載樣品離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品以15ml/min流速洗脫樣品.注意樣品本底的不同.注意載荷量及加樣方式用用Sep-Pak C18除去雜質(zhì)除去雜質(zhì)使極性的雜質(zhì)先流出中等極性樣品流出，保留并分析小柱及其非極性雜質(zhì)丟棄舉例：多肽混合物脫鹽.小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。.把樣品載入小柱.鹽等極性物先流出