第二章基因工程的載體和工具酶

1、第二章第二章 基因工程的基因工程的載體和工具酶載體和工具酶第一節(jié)第一節(jié) 載載 體體載體必須是復(fù)制子。載體必須是復(fù)制子?；蚩寺〉哪康幕蚩寺〉哪康氖鞘鼓康幕蛟谔囟ǖ臈l件下得到是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于助于“載體載體”及其及其“寄主細(xì)胞寄主細(xì)胞”來實現(xiàn)來實現(xiàn)作為基因克隆的載體必須具備以下特性作為基因克隆的載體必須具備以下特性具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組子的篩選。具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組子的篩選。具備多克隆

2、位點（具備多克隆位點（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量較小，拷貝數(shù)高。自身分子量較小，拷貝數(shù)高。在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。（一）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（二）質(zhì)粒載體的制備（二）質(zhì)粒載體的制備 （三）質(zhì)粒載體的改造（三）質(zhì)粒載體的改造（四）幾個常用質(zhì)粒載體（四）幾個常用質(zhì)粒載體一一 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectorsplasimid vectors）（1）質(zhì)粒質(zhì)粒是是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀( (少數(shù)為線形和少數(shù)為線形和RNARNA） DNADN

3、A分子。分子。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（2）質(zhì)粒的大小質(zhì)粒的大小差異很大差異很大，最小的只有，最小的只有1kb,只能編碼中等大只能編碼中等大 小的小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。（3）質(zhì)粒的生存質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中在寄主細(xì)胞中“友好友好”地地“借居借居”，離開了，離開了寄主寄主 它本身無法復(fù)制；同時質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸它本身無法復(fù)制；同時質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸 桿菌的復(fù)制起點不一定能在其它生物細(xì)胞中繁殖。桿菌的復(fù)制起點不一定能在其它生物細(xì)胞中繁殖。（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)

4、粒的生物學(xué)特性（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型質(zhì)粒的復(fù)制類型（5）質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒的不親和性根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型嚴(yán)緊型”質(zhì)粒質(zhì)粒（stigent plasmid），），拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為1-3；“松弛型松弛型”質(zhì)粒質(zhì)粒（relaxed plasmid），），拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為10-60。不過即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同不過即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的變化。的生長環(huán)境也可能有很大的變化。兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。載

5、體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)。接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒分子量大分子量大嚴(yán)緊型復(fù)制嚴(yán)緊型復(fù)制 非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒分子量小分子量小松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制 是否含有接是否含有接合轉(zhuǎn)移基因合轉(zhuǎn)移基因 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含tra基因；可以為轉(zhuǎn)基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有tra基因；能通過結(jié)合基因；能通過結(jié)合作用從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。作用從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。在一般情況下，

6、質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 （7）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種螺旋三種 雙螺旋共價閉合雙螺旋共價閉合環(huán)（環(huán)（SC構(gòu)型）構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）構(gòu)型）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（L構(gòu)型）構(gòu)型）（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（二）質(zhì)粒（二）質(zhì)粒DNADNA的制備的制備目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。

7、這個方法主要包括。這個方法主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA與染色體與染色體DNA分開及除去蛋白質(zhì)和分開及除去蛋白質(zhì)和RNA。分離質(zhì)粒的方法有多種，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析分離質(zhì)粒的方法有多種，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法等。柱過濾法等。堿變性法質(zhì)粒提取的原理堿變性法質(zhì)粒提取的原理 通過冷卻或恢復(fù)中性通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用

8、乙醇沉淀，的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒獲得質(zhì)粒DNA。 在在pH值值12.012.5范圍內(nèi)時，線性的范圍內(nèi)時，線性的DNA會被變性而共會被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性。卻不會被變性。堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒1 1 挑取挑取LBLB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于3.0ml LB3.0ml LB（含相（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，3737、250rpm250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約振蕩培養(yǎng)過夜（約16-17hr16-17hr）。）。2 2 取取1.5ml1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心培養(yǎng)物入微

9、量離心管中，室溫離心12000rpm12000rpm，1min1min， 棄上清棄上清3 3 將細(xì)菌沉淀重懸于將細(xì)菌沉淀重懸于100l100l預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液中，重懸，使菌體分中，重懸，使菌體分 散混勻散混勻4 4 加加200l200l新鮮配制的溶液新鮮配制的溶液，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振 蕩），并將離心管放置于冰上蕩），并將離心管放置于冰上2-3min2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液，使細(xì)胞膜裂解（溶液 為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）5 5 加入加入150l150l預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色，將管溫和

10、顛倒數(shù)次混勻，見白色 絮狀沉淀，可在冰上放置絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min3-5min。6 6加入加入450l450l的苯酚的苯酚/ /氯仿氯仿/ /異戊醇，振蕩混勻，異戊醇，振蕩混勻，44離心離心 12000g 12000g 10min 10min7 7 小心移出上清于一新微量離心管中，加入小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.52.5倍體積預(yù)冷的倍體積預(yù)冷的 無水乙醇，混勻，室溫放置無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min2-5min，44離心離心12000g12000g15min15min8 1ml8 1ml預(yù)冷的預(yù)冷的70%70%乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀1-21-2次，次，44離心離

11、心8000g8000g10min10min， 棄上清，將沉淀在室溫下晾干棄上清，將沉淀在室溫下晾干9 9 沉淀溶于沉淀溶于20l TE20l TE（含（含RNase A 20g/mlRNase A 20g/ml），），3737水浴水浴 30min 30min以降解以降解RNARNA分子，分子，-20-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。溶液溶?I50 mM50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-/ 25 mM Tris-H HCl / 10 mM EDTACl / 10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0Tris-HClTris-HCl控制溶液的控制溶液的pHpH葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌

12、不會快速沉積到管子的底部，因葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，因此如果缺了葡萄糖幾乎沒有影響；此如果缺了葡萄糖幾乎沒有影響；EDTAEDTA螯合是螯合是CaCa2+2+和和MgMg2+2+等二價金屬離子，高達(dá)等二價金屬離子，高達(dá)10 mM 10 mM 的的EDTAEDTA就就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉，抑制是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉，抑制DNaseDNase的活性，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，如果的活性，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，如果不加不加EDTAEDTA也不用怕也不用怕DNADNA會迅速被降解會迅速被降解溶液溶液II

13、0.2 N NaOH / 1% SDS用新鮮的用新鮮的0.4 N0.4 N的的NaOHNaOH和和2 2的的SDSSDS等體積混合后使用；新鮮的等體積混合后使用；新鮮的0.4 N0.4 N的的NaOHNaOH是保證是保證NaOHNaOH溶液沒有吸收空氣中的溶液沒有吸收空氣中的CO2CO2而減弱了堿而減弱了堿性，因為破裂細(xì)胞的主要是堿，而不是性，因為破裂細(xì)胞的主要是堿，而不是SDSSDS；這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組條件下基因組DNADNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然片斷會慢慢斷裂；第二，必須

14、溫柔混合，不然基因組基因組DNADNA也會斷裂，基因組也會斷裂，基因組DNADNA的斷裂會帶來麻煩的斷裂會帶來麻煩在在pHpH值介于值介于12.0 -12.512.0 -12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋變性。共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒解旋變性。共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈的氫鍵會斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，緊密地結(jié)合在一起彼此相互盤繞，緊密地結(jié)合在一起溶液溶液III3 M 醋酸鉀醋酸鉀 / 2 M 醋酸（醋酸（pH4.8）加入后就會有大量的沉淀，是因為加入后就會有大量的沉淀，是因為SDSSDS遇到鉀離子后變成了十二烷基

15、硫酸遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（鉀（potassium dodecylsulfate, PDSpotassium dodecylsulfate, PDS），），PDSPDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀；高濃度的鹽淀；高濃度的鹽(3 M(3 M醋酸鉀醋酸鉀) ) ，使得沉淀更完全；溶液，使得沉淀更完全；溶液IIIIII加入并混合均加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了勻后在冰上放置，目的是為了PDSPDS沉淀更充分一點沉淀更充分一點 2M2M的醋酸是為了中和的醋酸是為了中和NaOHNaOH，調(diào)，調(diào)pHpH值至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒值至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNAD

16、NA的兩的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因而復(fù)性迅速而準(zhǔn)確；而線性染色體條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因而復(fù)性迅速而準(zhǔn)確；而線性染色體DNADNA的兩條的兩條互補(bǔ)鏈因彼此已完全分開，復(fù)性緩慢且錯誤率高，纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)互補(bǔ)鏈因彼此已完全分開，復(fù)性緩慢且錯誤率高，纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)平均兩個氨基酸上結(jié)合一個平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDSSDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了；絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了；盡管盡管SDSSDS并不與并不與DNADNA分子結(jié)合，由于染色體分子結(jié)合，由于染色體DNADNA太長且纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，太長且纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大腸桿菌的基因組

17、大腸桿菌的基因組DNADNA也同時被共沉淀也同時被共沉淀另外長時間的堿性條件會打斷另外長時間的堿性條件會打斷DNADNA，基因組，基因組DNADNA一旦發(fā)生斷裂成一旦發(fā)生斷裂成5050100 kb100 kb大小的片斷，就不會被大小的片斷，就不會被PDSPDS共沉淀；所以堿處理的時間要短，而且不得激共沉淀；所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNADNA混入混入25/24/1的苯酚的苯酚/氯仿氯仿/異戊醇異戊醇苯酚用來變性蛋白質(zhì)苯酚用來變性蛋白質(zhì)但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如但是水飽和

18、酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/ /氯仿始終在下氯仿始終在下層，方便水相的回收層，方便水相的回收酚與水有很大的互溶性，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酚與水有很大的互溶性，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)）；用酚酶切反應(yīng)）；用酚/ /氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被

19、除干凈異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收清晰，也方便了水相的回收2.52.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇倍體積預(yù)冷的無水乙醇與含有質(zhì)粒的水相混勻，室溫放置與含有質(zhì)粒的水相混勻，室溫放置2-5min2-5min，44離心離心12000g12000g15min15min水相含有足夠多的鹽，只要水相含有足夠多的鹽，只要2 2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNADNA沉淀沉淀如果放到如果放到2020，時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀，時間一長反而會導(dǎo)

20、致大量鹽的沉淀如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用7070的乙醇多洗幾次，每次的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，或者在室溫放置一個小時以上，或者44離心離心8000g8000g7min7min，并用，并用tiptip將沉淀打碎將沉淀打碎TETE緩沖液含緩沖液含RNaseRNase（50 ug/ml50 ug/ml）3737水浴水浴30min30min以降解以降解RNARNA分子，分子，-20-20保存?zhèn)溆?，不然大量保存?zhèn)溆?，不然大量未降解的未降解的RNARNA會干擾電泳結(jié)果會干擾電泳結(jié)果堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNADNA三條帶

21、以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）如果不小心在溶液如果不小心在溶液IIII加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb20-100kb的大腸桿菌基因組的大腸桿菌基因組DNADNA的片斷的片斷有時候抽提到的質(zhì)粒會有有時候抽提到的質(zhì)粒會有7 71010條帶，這是由于特殊的條帶，這是由于特殊的DNADNA序列序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)

22、不同）所致導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒DNADNA顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快超螺旋超螺旋DNADNA分子遷移率比線性分子遷移率比線性DNADNA分子快分子快線性線性DNADNA分子比開環(huán)分子比開環(huán)DNADNA分子快分子快線性線性DNADNA分子的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比分子的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。（三）質(zhì)粒載體的改造（三）質(zhì)粒載體的改造去掉不必要的去掉不必要的DNA區(qū)段。區(qū)段。減少限

23、制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的 限制性酶切位點）。限制性酶切位點）。加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。對質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。對質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。（四）幾個常用質(zhì)粒載體（四）幾個常用質(zhì)粒載體1. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322pBR3224363（1）氨芐青霉素抗性基因）氨芐青霉素抗性基因（ampr或或Apr）含）含3種限制酶種限制酶 單一識別位點單一識別位點 。（2）四環(huán)素抗性基因（）四環(huán)素抗性基因（tetr或或Tcr）內(nèi)部有內(nèi)部有7種，啟動區(qū)內(nèi)有種，啟動區(qū)內(nèi)有2種限

24、制酶單一識別位點種限制酶單一識別位點 。（3）DNA復(fù)制起點（復(fù)制起點（ori）結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點pBR3224363（4）對多種常見的限制性內(nèi)切）對多種常見的限制性內(nèi)切 核酸酶只含有一個能切割的核酸酶只含有一個能切割的 位點位點pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點（1）具有較小的分子量。）具有較小的分子量。 4363bp，2.6106Da（2）具有兩種抗菌素抗性基因可）具有兩種抗菌素抗性基因可 供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號 （3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng) 過氯霉素擴(kuò)增之后過氯霉素擴(kuò)增之后,每個細(xì)每個細(xì) 胞中可累積胞中可累積10003000個個 拷貝拷貝外源

25、外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端連接酶連接酶重組子重組子(ampstetr) 空載體空載體(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 導(dǎo)入導(dǎo)入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重組子轉(zhuǎn)化子重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體轉(zhuǎn)化子空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空載體轉(zhuǎn)化子空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)對比兩個平板上的菌落，凡在對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是平板上不能生長

26、的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。2. pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采用采用MCS技術(shù)在技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的基礎(chǔ)上構(gòu)建的結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點（4）MCS區(qū)段區(qū)段:是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個載體中密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個載體中是唯一的。是唯一的。（1）來自于）來自于pBR322的的Ori（2）氨芐青霉素

27、的抗性基因（）氨芐青霉素的抗性基因（ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化但核苷酸序列發(fā)生了變化（3） LacZ基因基因 ：編碼：編碼半乳半乳 糖酶的糖酶的肽鏈即氨基末端。肽鏈即氨基末端。2. pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體與與pBR322相比，相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：質(zhì)粒載體優(yōu)點：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)如如pUC8為為2 750bp，pUCl8為為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，基因的缺失，平均每個細(xì)胞即可達(dá)平均每個細(xì)胞即可達(dá)500700個拷貝個拷貝（2）適用于組織化學(xué)法檢測重組體）適用于組織化學(xué)法檢測重組體通過通過 -互補(bǔ)互

28、補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子作用，利用菌落顏色篩選重組子（3）具有多克隆位點區(qū)段（）具有多克隆位點區(qū)段（MCS）可以定向克隆防止載體自我連接可以定向克隆防止載體自我連接 -互補(bǔ)互補(bǔ) (alpha-complementation)大腸桿菌大腸桿菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的質(zhì)，當(dāng)該酶的 -片段片段和和 -片段片段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶該酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中，而在一些基因插入到載體的多克隆

29、位點的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的 片段片段。這樣一來，含有。這樣一來，含有功能性完整的功能性完整的LacZ 基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時，載體編碼的基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時，載體編碼的 -片片段段就能和寄主編碼的就能和寄主編碼的 片段片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對底物發(fā)生互補(bǔ)并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是 alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 釋放出的藍(lán)色

30、物質(zhì)可以釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍(lán)色，將整個菌落染成藍(lán)色，非 常 容 易 辨 別 ， 如 果非 常 容 易 辨 別 ， 如 果 LacZ插入外源基因被破插入外源基因被破壞，菌落則是無色的壞，菌落則是無色的 。X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物異丙基異丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛藍(lán)靛藍(lán)檢測重組體檢測重組體第二節(jié)第二節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四四 修飾性工具酶修飾性工具酶（一）限制性

31、核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四）（四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用由寄主控制的由寄主控制的限制限制和和修飾修飾現(xiàn)象現(xiàn)象-20世紀(jì)世紀(jì)60年代，年代，Linn和和Arber 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) (B) (K)大腸桿菌大腸桿菌B大腸桿菌大腸桿菌K11410 410 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platin

32、g外源外源DNA自身自身DNA（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)111C10-4110-4B10-410-41Kccbbkk大腸桿菌大腸桿菌噬菌體噬菌體E.coliB含有含有EcoB核酸酶和核酸酶和EcoB甲基化酶甲基化酶當(dāng)當(dāng)(k)噬菌體侵染噬菌體侵染E.coliB時，由于其時，由于其DNA中有中有EcoB核酸酶特核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的的DNA中雖然也中雖然也存在這種特異序列，但可在存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基

33、轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。堿基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。核酸酶不能識別已甲基化的序列。限制限制修飾的酶學(xué)系統(tǒng)修飾的酶學(xué)系統(tǒng) (B) (B)酶切位點酶切位點不被修飾不被修飾噬菌體噬菌體DNA被切割被切割酶切位點酶切位點被修飾被修飾基因組基因組DNA不被切割不被切割最早分離出的限制內(nèi)切酶最早分離出的限制內(nèi)切酶1968年，年，Meselson和和Yuan，大腸桿菌大腸桿菌B和和K菌株，菌株，EcoB和和EcoK， 是是I型的，沒有實用型的，沒有實用價值。價值。首個首個II型限制內(nèi)切酶型限制內(nèi)切酶1970年，年，H.O.S

34、mith等從等從Heamophilus influenzae的的Rd菌株中菌株中Hind II 。使得。使得DNA分子的體外精確切分子的體外精確切割成為可能。割成為可能。從此，相關(guān)研究展開。如從此，相關(guān)研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純公司的提取和克隆。目前已純化出化出3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在是在NEB發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)的 。限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease ）：是一類能）：是一類能夠識別雙鏈夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的

35、核酸內(nèi)切酶。切開的是雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是3，5磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性 特性特性1. 限制修飾活性限制修飾活性2. 內(nèi)切酶的蛋白內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)結(jié)構(gòu)3. 限制輔助因子限制輔助因子4. 切割位點切割位點5. 特異性切割特異性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型雙功能的酶雙功能的酶3種不同亞基種不同亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特異性位點距特異性位點5端至少端至少1000bp不是（隨機(jī)）不是（隨機(jī)）無用無用 II 型型限制酶和修飾酶分開限制酶和修飾酶分開單一成分單一成分 Mg

36、2+位于識別位點上位于識別位點上 是是非常有用非常有用 III 型型雙功能酶雙功能酶2種亞基種亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特異性位點特異性位點3端端24-26bp處處是是用處不大用處不大（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為表示為Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為表示為 Hi

37、n；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如Eco R I、 Hind III。（四）（四）IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點1、識別位點的特異性、識別位點的特異性 每種酶都有其特定的每種酶都有其特定的DNA識別識別 位點，通常是由位點，通常是由48個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識別序列的對稱性、識別序列的對稱性 靶序列通常

38、具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱 的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點的規(guī)范性、切割位點的規(guī)范性 交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。分子）。幾種幾種IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 與與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念注注 意：意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩由同

39、尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。兩種酶的任一種所識別。 粘性末端粘性末端 cohesive ends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來?；膯捂溠由炷┒私Y(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平平 末末 端端 Blunt end在識別序列對稱處同時切開在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊分子兩條鏈，產(chǎn)生的平

40、齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。 同裂酶同裂酶 isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。同尾酶同尾酶 isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如制性核酸內(nèi)切酶。如BamH I 、BclI、BglII和和Xho I 是一組同尾酶。是一組同尾酶。平齊末端帶帶5P端的黏性末端端的黏性末端帶帶3OH 和和5P端的平末端端的

41、平末端例如例如Hpa和和Msp是同裂酶，識別順序都是是同裂酶，識別順序都是 5C|CG G3 3G GC|C5 如果其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能夠切割，不能夠切割，MspI能切割。能切割。 經(jīng)同尾酶消化的經(jīng)同尾酶消化的DNADNA末端連接示意圖末端連接示意圖5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3

42、 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II 一個限制酶單位一個限制酶單位（U）指：指：在理想的反應(yīng)條件（適在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37）下，）下，1h內(nèi)內(nèi)中完中完全降解全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：影響酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的純度的純度 DNA的甲基化程度的甲基化程度酶切反應(yīng)的溫度（通常為酶

43、切反應(yīng)的溫度（通常為37 ）DNADNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 在在“非最適的非最適的”反應(yīng)條件下反應(yīng)條件下, ,有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生異性便會發(fā)生“松動松動”，從其，從其“正確正確”識別序列以外的其它位點識別序列以外的其它位點切割切割DNADNA分子，這種現(xiàn)象分子，這種現(xiàn)象叫星號活性叫星號活性。用。用* *表示。表示。 （五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)酶酶 切切 反反 應(yīng)應(yīng) 的的 基基 本本 步步 驟驟電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKMBuffer (10X) 2.

44、0 LddH2O 約約16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT（一）（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)（二）（二） DNA連接酶作用特點連接酶作用特點（三）（三） DNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件（四）（四）DNA連接的策略連接的策略二二 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用（一）（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)環(huán)形環(huán)形DNADNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種 切口的酶存在。切口的酶存在。 首個首個DNADNA連接酶連接酶(l

45、igase)(ligase)19671967年，年，大腸桿菌大腸桿菌DNA連連接酶接酶，是大腸桿菌基因編碼是大腸桿菌基因編碼 。1970年，發(fā)現(xiàn)了年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶連接酶 ， 由大腸桿菌由大腸桿菌T4噬菌體噬菌體基因編碼的?；蚓幋a的。（二）（二）DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點A.A. 連接的連接的兩條鏈兩條鏈必須分別具有自由必須分別具有自由3 3OHOH和和5 5P P，而且這兩，而且這兩 個基團(tuán)彼此個基團(tuán)彼此相鄰相鄰；B. B. 在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。E.coli DNA連接酶連接酶 連接具互補(bǔ)堿基黏

46、性末端連接具互補(bǔ)堿基黏性末端(最初研究表明），最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末端；需現(xiàn)在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。輔助因子，活性低，不常用。T4DNA連接酶連接酶連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端，需連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助輔助因子，活性高，常用。因子，活性高，常用。 是兩條鏈?zhǔn)莾蓷l鏈因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。環(huán)化起來。 OH P 是相鄰的是相鄰的因此不能封閉因此不能封閉gap，只能封閉，只能封閉nick.gap NONick OK（三）（三）T4DNA連接酶連接反應(yīng)的條件連接酶連接反應(yīng)的條件影響

47、連接效率的因素有：影響連接效率的因素有：A A 溫度（通常在溫度（通常在4 415 15 ）B ATPB ATP的濃度的濃度(10ML )C C 連接酶濃度（連接酶濃度（一般平末端大約需一般平末端大約需1 12U2U，黏性末端僅需，黏性末端僅需0.1U0.1U）D D 反應(yīng)時間（通常連接過夜）反應(yīng)時間（通常連接過夜）E E 插入片段和載體片段的摩爾比（插入片段和載體片段的摩爾比（ 1 1 1 15 5 1 1） （四）（四）T4 DNA連接酶對目的連接酶對目的DNA片段片段和載體連接的一般方案和載體連接的一般方案1 連接反應(yīng)一般在滅菌的連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。離心管中進(jìn)行。

48、2 10l體積反應(yīng)體系中：取載體體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例，加入一定比例 的外源的外源DNA 分子（一般線性載體分子（一般線性載體DNA分子與外源分子與外源DNA 分子摩爾數(shù)為分子摩爾數(shù)為1 11 5），補(bǔ)足），補(bǔ)足ddH2O 至至8l。3 輕輕混勻，稍加離心，輕輕混勻，稍加離心，56水浴水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4 加入含加入含ATP的的10Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位，連接酶合適單位， 用用ddH2O補(bǔ)至補(bǔ)至10l，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般14 16）連接）連接8-14hr。粘性末端粘性末端DN

49、A片段的連接片段的連接DNA連接酶連接法連接酶連接法NickNick平末端平末端DNA片段的連接末端同聚物加尾法片段的連接末端同聚物加尾法33553355末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA連接酶連接酶平末端平末端DNA片段的連接銜接物連接法片段的連接銜接物連接法 銜接物銜接物(linker)(linker)，也叫接頭，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段是有人工化學(xué)合成的一段10-10-1212個核苷酸組成，具有有個核苷酸組成，具有有1 1個或幾個限制性酶切位點的平末端的個或幾個限制性酶切位點的平末

50、端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙鏈寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割切割GATCCG連接酶經(jīng)連接酶經(jīng)BamHI切割的切割的pBR322GCCTAGBamHI銜接物銜接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG連接酶連接酶重組重組DNA分子分子GATCCGGCCTAG（一）大腸桿菌（一）大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（二）（二）Klenow片段片段酶酶（三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三三 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ 4dNTP

51、sATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+ 4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+ T1 5 3聚合酶活性：聚合酶活性： 模板，模板， 帶帶3OH游離基團(tuán)的引物、游離基團(tuán)的引物、 4dNTPs、 Mg2+ 2 雙鏈特異性的雙鏈特異性的53核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 35核酸外切酶活性：核酸外切酶活性：從游離的雙鏈或單鏈從游離的雙鏈或單鏈DNA的的3端降端降 解。不過對于雙鏈的降解可被解。不過對于雙鏈的降解可被5 3 的多聚活性所抑制。主要是校正作用的多聚活

52、性所抑制。主要是校正作用（一）（一） 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I （E. Coli DNA pol I）Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌年首先從大腸桿菌E. Coli 細(xì)胞中分離出來細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括的。它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：種不同的酶活力： 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 的三種用途的三種用途A. 利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針探針 利用其利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。B. 用于用于DNA連接前的大缺口填充連接前的大缺口填充 利用利用5-3

53、的聚合酶活性。的聚合酶活性。C. 用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。 大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例的應(yīng)用示例缺口轉(zhuǎn)移制備探針缺口轉(zhuǎn)移制備探針Pol I + Mg2+32P dNTPs （二）（二） Klenow片段酶片段酶KlenowKlenow片段片段是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌聚合酶 I I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為76KD 76KD 。酶催活性：酶催活性：5 533 的聚合酶活性的聚合酶活性3 355 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性CCGATAGCC

54、TGGCTACCGATAGCCTGGCTAKlenow+Mg2+ Klenow片段的主要用途（片段的主要用途（利用利用5 3 的聚合酶活性）的聚合酶活性）修補(bǔ)限制性酶消化修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的形成的3隱蔽末端隱蔽末端標(biāo)記標(biāo)記DNA片段的末端片段的末端 底物用底物用32PdNTPs cDNA克隆中第二鏈克隆中第二鏈cDNA的合成的合成 DNA序列的測定序列的測定3隱蔽末端就是用限制性內(nèi)切酶消化之隱蔽末端就是用限制性內(nèi)切酶消化之后所形成的后所形成的5端突出而端突出而3端向內(nèi)凹的現(xiàn)象端向內(nèi)凹的現(xiàn)象 （三）（三） T4DNA聚合酶聚合酶T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶是從是從T4T4噬菌體感

55、染了的大腸桿菌中分離得到的。噬菌體感染了的大腸桿菌中分離得到的。酶催活性：酶催活性：5353的聚合酶活性的聚合酶活性3535的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶酶 I I 的活性高的活性高200200倍。倍。比比Klenow Klenow 片段酶片段酶強(qiáng)強(qiáng)1001001,0001,000倍。倍。 可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行取代合成取代合成反應(yīng)：反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTPdNTP或沒有底物時，這時或沒有底物時，這時T T4 4DNADNA聚合聚合酶就會表現(xiàn)出酶就會表現(xiàn)出3535

56、外切酶活力，從雙鏈外切酶活力，從雙鏈DNADNA的的33開始降解，開始降解，直到露出底物直到露出底物dNTPdNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。反應(yīng)。CGTCGCGCAGCGCGTCGCGCAGCGdTTPMg+CGTGCAGCG32P dNTPsMg+ T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1 1 利用取代合成反應(yīng)制備探針利用取代合成反應(yīng)制備探針2 2 標(biāo)記具有平末端的或具有標(biāo)記具有平末端的或具有33隱蔽末端的隱蔽末端的DNADNA片段片段 利用較強(qiáng)的利用較強(qiáng)的3 5 3 5 外切酶活性和外切酶活性和 5353聚合活性聚合活性3 3 用于用于DNADNA序列分析序列分析 （四）（四） 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴是一種依賴RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。此酶首先是此酶首先是19701970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的個課題組的論文都發(fā)在了同一期的NatureNature雜志上。雜志上。最普遍使用的是從鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（最普遍使用的是從鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（AMVAMV）分離出來的。）分離出來的?；钚裕夯钚裕阂环N可以有效地將一種可以有效地將mRNAmRN