流式細胞儀原理和一般用法

1、會計學1流式細胞儀原理和一般用法流式細胞儀原理和一般用法Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞術流式細胞術流式細胞分析，又稱流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。他綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各門學科。Partec - Excellence in Flow Cytomet

2、ry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞術流式細胞術流式細胞分析，又稱流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。他綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各門學科。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗特點：特點：（1 1）單細胞分析。）單細胞分析。（2 2）快速分析。）快速分析。（3 3）多參數相關測

3、量。）多參數相關測量。（4 4）定性或定量分析細胞。）定性或定量分析細胞。（5 5）統(tǒng)計學意義明顯。）統(tǒng)計學意義明顯。 （6 6）分選。）分選。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗熒 光有些物質，當用光照射時，它吸收了該種波長的光后還會發(fā)射出各種顏色和不同強度的光，而當光停止照射后，這種發(fā)射的光也隨之消失，這種發(fā)射的光稱為熒光(fluorescence)。熒光的波長比吸收光線的波長要長些。由于物質的分子結構不同，所吸收的光和所發(fā)射的熒光波長也不同。被這些物質吸收的光稱為激發(fā)光，產生的發(fā)射光即熒光。熒光的顏色多為紅、藍、綠或黃等。物質的熒

4、光有兩種，一種是自發(fā)性熒光，即組織在短波長光照射下自行發(fā)射出的熒光。如，組織中的蛋白質和脂類在紫外線照射下能發(fā)射出微弱的淡藍色熒光。另一種熒光是誘發(fā)熒光，即細胞與熒光色素結合后，經一定波長的光線照射后發(fā)出的熒光。常用的是誘發(fā)熒光，能產生熒光的生物染色劑稱為熒光染料(或稱熒光色素)。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗熒光激發(fā)與發(fā)射原理能量級能量級激發(fā)激發(fā)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)發(fā)射發(fā)射激光激光能量損失能量損失Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗免疫熒光技術免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理

5、，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗原或抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測細胞表面或細胞內的相應抗原(或抗體)。從而使形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用流式細胞儀檢測標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(如，黃、綠色或紅色等)，通過確定抗原或抗體的性質、定位來推斷細胞的信息，以及利用定量技術測定含量。常用方法：單抗直接標記Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗嵌入性染料如DAPI、赫斯特、PI等，直接與細胞內的DNA雙螺旋結構中的A-T堿基對結合，從而使細胞在激發(fā)光的照射下發(fā)特定波長的光，通過判斷發(fā)

6、射光的強弱來推算A-T堿基對的多少，從而得知DNA的倍性關系。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗細胞膜電位、離子、脂類探針現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來了各種細胞膜電位、各類離子、pH值、脂類探針，運用這些探針在流式細胞儀上可輕易檢測各種細胞功能，可實現(xiàn)一些意想不到的效果。詳細信息，見細胞探針公司網站： www.molecularPPartec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗與流式細胞儀相關的熒光術語MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome

7、）等量可溶性熒光分子：國際標準單位，用來衡量熒光強度自發(fā)熒光：細胞或顆粒在激發(fā)照射下會發(fā)出各種波長的熒光。白細胞自發(fā)熒光強度為6501150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)熒光更低流式細胞儀精度：分析白細胞要求精度在600MESF以內，分析其他細胞或顆粒需要更高的精度：200MESF以內Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗常見熒光染料列表染料名稱激發(fā)波長（nm）最大發(fā)射波長(nm)應用抗抗體體FITC488530一般應用PEARDI488/565575FITC及2重染色ECD488/565613多重免疫染色用PC5/PE-Cy5488/5

8、65/650670多重免疫染色用PC7/PE-Cy7488/565767多重免疫染色用Cy5633670多重免疫染色用APC650660多重免疫染色用DNA/RNAPl488/5366171色染色體、DNA細胞周期、除去死細胞YOYO-l491509DNA細胞周期、除去死細胞CPO488530/670DNA(530)/RNA(670)、網織紅細胞檢測7-AAD546647G-C特異性、DNA細胞周期、除去死細胞SYTO16488518活細胞染色SYTOX Green504523DNA細胞周期TO-PRO-3642661除去死細胞DAPI360DNA細胞周期Partec - Excellence

9、 in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗常見熒光染料列表鈣鈣Fluo-3AAMA506525細胞內鈣離子的檢測Fura RedAAMA473670細胞內鈣離子的檢測pHBCECF (AM)488535細胞內pHSNARF-l (AM)488587A635細胞內pH (pH6-9)酶酶Fluorecein495519與酶基質結合后使用、檢測活細胞內酶活性Rhodamine-110497520與酶基質結合后使用、檢測活細胞內酶活性其其它它CMFDA488530活細胞內水平檢測、MDRRhodamine-123488530活細胞內線粒體、MDREGFP488510基因表達DiOC2

10、(3)488530細胞膜電位DiBAC4 (3)493516細胞膜電位DCFH-DA488530細胞內活性酶DHR505534細胞內活性酶FDA488530活細胞染色Calcein AM496517活細胞染色、乙啡叮 同型二聚體-1的雙色檢測判斷細胞死活Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗常用熒光染料種類488nm藍色激光激發(fā)： FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色 530nm PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nm PerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：紅色675nm PI(碘化丙啶）：橙紅色

11、620nm637nm紅色激光激發(fā)： APC(別藻蘭蛋白）：紅色 665nm APC-Cy5(別藻蘭蛋白的衍生物）：深紅色 710nm365nm紫外光激發(fā)： DAPI（4，6-咪基-2聯(lián)苯吲哚）：藍色 455nm532nm綠色激光激發(fā)： PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm PE-Dy647 （PE的衍生物）：紅色 647nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nmPartec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞儀的原理概述流式細胞儀（Flow Cytometer 簡稱FCM）是一種自動分析細胞的高端技術設備，其原理是懸浮在液體中的細

12、胞一個個地依次通過測量區(qū)，當每個細胞通過測量區(qū)并被激發(fā)光照射時產生光信號，然后被光電倍增管（PMT）轉化成電信號，這些信號可以代表熒光、普通光散射、光吸收或細胞的阻抗等。這些信號可以被測量、存貯、顯示，于是細胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地測定。上述特征可以是細胞的大小、活性，核酸的數量、酶、抗原等等。儀器還可以根據所規(guī)定的參量把指定的細胞亞群從整個群體中分選出來。廢液檢測器&計數器樣品樣品Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗待測細胞被制備成單個細胞的懸液，經特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進入流動室

13、。流動室內充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞被激發(fā)產生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學系統(tǒng)（透鏡、光闌，濾片和檢測器等）用以收集熒光信號。光電倍增管將收集的光信號轉化為電信號再傳輸至計算機，計算機通過相應的軟件將電信號模擬成圖像。流動室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為350250um的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢,因而細胞受照時

14、間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室內充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液流是一種穩(wěn)定流動的液體，操作人員無法隨意改變其流動的速度,樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，結合樣品噴嘴的特殊結構，從而保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞信息（散射光和熒光）。超過41年的研發(fā)經驗激光，如：488nmFL2 PESSCFSC液路液路電子元件部分電子元件部分計算機計算機FL3 PerCP, Cy5 FL1 FITC光學接收器光學接收器Partec - Excellence in Flow

15、Cytometry超過41年的研發(fā)經驗1. 流動室及液流驅動系統(tǒng)2. 激光光源及光束形成系統(tǒng)3. 光學系統(tǒng)（濾光片組）4. 信號檢測與存儲系統(tǒng)5. 顯示、分析系統(tǒng)Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源，這是因為由于細胞的快速流動，每個細胞經過光照區(qū)的時間僅為微秒左右，每個細胞所攜帶熒光物質被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關，因此要求細胞必須達到足夠的光照強度。激光光束在到達流動室前，先經過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約即短軸稍大于細胞的直徑的光斑。這

16、種橢園形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布;為保證樣品中細胞是一個一個分別受到光照并且受照強度十分一致,須將樣本流與激光束正交且相交于激光能量分布峰值處,臺式機FCM的光路調節(jié)對用戶是封閉的，即安裝時由工程師調試完畢后,無需用戶作任何調節(jié), 所以用戶操作十分方便。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞儀的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。在流式細胞儀的光學系統(tǒng)中主要光學原件是濾光片，主要分為三類：長通濾片 LP短通濾片 SP帶通濾片 BPPartec - Excellence

17、in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗長通濾片長通濾片長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500 nm以上的光通過，而500 nm以下的光吸收或返回。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗短通濾片短通濾片與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗帶通濾片帶通濾片帶通濾片可允許相當窄的一波長范圍內光通過，一般濾片上有兩個數，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光

18、波段的范圍。如BP 500 / 50表示其允許通過波長范圍為475nm525nm。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗信號檢測與分析信號檢測與分析當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射區(qū)時，受激光激發(fā)，產生代表細胞內不同物質、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產生散射光和熒光信號, 下圖是以激發(fā)光光源波長488nm為例的示意圖：Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗1.散射光信號：散射光分為前向角散射( FSC ，F(xiàn)orward Scatter )

19、和側向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(如染色)，因此被稱為細胞的物理參數（或稱固有參數）。(1)前向角散射：代表細胞體積大小，前向角散射與被測細胞的大小有關，確切說與細胞直徑的平方密切相關，通常在FCM應用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。(2)側向角散射：代表細胞內容物多少（或稱為密度），側向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號，側向散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。2.熒光信號：當激光光束與細胞正交時，一般會產生兩種熒光信號。一種是

20、細胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析就能了解所研究細胞參數的存在與定量。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗電壓脈沖ttt電壓脈沖電壓脈沖1.2.3.Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗時間 (s)電壓脈沖面積(A)脈沖高度 (H)脈沖寬度(W)400Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗Partec - Ex

21、cellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗閾值用來定義能夠被光電倍增管識別的最小或最大信號強度，低于閾值下限或高于閾值上限的信號將不被光電倍增管識別，也不在圖形中顯示。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗線性放大： 即放大器的輸出與輸入是線性關系，細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質含量等的測量一般選用線性放大測量。對數放大： 即放大器的輸出成10倍關系，如果原來輸出是1，當輸入增大到原來10倍時，輸出為2；當輸入增大到原來100倍時輸出是3等等。在免疫學樣品中，細胞膜表面抗原的分布有時要差幾十倍甚至幾萬倍

22、。如果用線性放大將無法在一張圖上清晰地將細胞陽性群、陰性群同時顯示出來。 。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞儀數據格式流式細胞儀數據格式FCS：幀校驗序列（FCS）字段，通常為16位（2個字節(jié)長），也可以為4個字節(jié)。軟件執(zhí)行中可以通過預先協(xié)議采用32位FCS來提高差錯檢測效果。FCS 1.0 研發(fā)于1984年FCS 2.0 研發(fā)于1990年，兼容1.0格式FCS 3.0 研發(fā)于1997年，兼容前兩者 支持UNICODE文本 處理單個數據文件大于100MBPartec - Excellence in Flow Cytometr

23、y超過41年的研發(fā)經驗FCS文件結構文件結構存儲于3或4個片段中文件頭信息：用于鑒別FCS文件，包含鑒別文本文件片段的數值。文本信息：描述樣品信息和狀態(tài)的某些數值。數據：在文本信息中存儲的數值的特殊格式。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗文件頭信息：文本信息：Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗參 數FSC/SSC/熒光：第一個細胞第一個細胞第二個細胞第二個細胞最后一個細胞最后一個細胞Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗

24、數據顯示的種類數據顯示的種類直方圖 散點圖 三維圖 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗直方圖（用于單參數分析）橫坐標，X軸表示光強度，強度高的光信號靠右側顯示?？v坐標，Y軸表示數量累計，相同強度的光信號在同一橫坐標點（通道）內向Y軸方向累計。FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFL1-FITCFITCFITCPartec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗散點圖（用于雙參數分析）橫坐標，X軸表示光強度，強度高的光信號靠右側顯示?？v坐標，Y軸表示光強度，強度高的光

25、信號靠上側顯示。與X軸/Y軸平面900垂直相交，Z軸表示數量累計，相同強度的光信號在同一橫/縱坐標點（X/Y軸通道）內向Z軸方向累計。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗什么是什么是Region？用戶在顯示的圖形中限定一個區(qū)域或范圍作為靶區(qū)域或范圍叫做Region。在同一張圖中可以設置多個Region。 使感興趣的簇獨立。 對Region使用顏色可更好地描述該范圍或區(qū)域。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗什么是什么是Gate？1.使用布爾數學體系的操作方法（邏輯學）定義一個或

26、將多個Region進行聯(lián)合叫做Gate。2.被定義的子集數據將被顯示。3.被選定的子集將被計算機計算數據和顯示狀態(tài)。4.解除噪音信號并可以最終被存儲在硬盤上。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗什么是什么是Mean？1.算術定義的平均值。2.幾何定義的平均值。假設樣品為V，數量為n，則：算術定義的平均值=（V1+V2+V3+Vn)/n幾何定義的平均值=Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗如何取平均值？如何取平均值？線性放大 對數放大 對數放大 算術平均值 算術平均值 幾何平均值（

27、4*64+6*128+2*192+1*256）/13 （4*10+6*100+2*1000+1*10000）/13 =128 =972.3 =1001310000e11000e2100e610e4Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗光譜交叉重疊與補償？光譜交叉重疊與補償？當一種激光束激發(fā)兩種熒光染料而發(fā)射出兩種不同波長的熒光時，這兩種發(fā)射光會出現(xiàn)光譜部分重疊的現(xiàn)象，從而造成檢測的準確性下降，必須使用適當的濾片或進行電子補償來盡量減少光重疊對實驗的影響。 FL-1PMTFL-2 PMTFL-1 -% FL-2FL-2 -% FL-1Par

28、tec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗未做補償 R4/R1=41% R3/R1=24.21% R2/R1=34.3%做補償后 R4/R1=41.04% R3/R1=24.75% R2/R1=34.22%補償，我們通常按照細胞聚集區(qū)的中心點來計算，但實際的原理是按細胞團的位置來定的，也就是純粹按照計算得出的，比如上圖的R4細胞團，它在X軸上的位置是0.3到1之間，在Y軸的位置是2到6之間，這團細胞平均值在FL1,FL2中的分部坐標為0.68,3.9;因此斜率為0.68/3.9=17.43，因此FL1的補償后平均值為FL1-17.43%FL2=0.

29、68-17.43%*3.9=0.0023，它的右側區(qū)域應該在1-17.43%*3.9=0.32，左側區(qū)域應該在0.3-17.43%*3.9=-3.79，因為是負數，就自動歸為0.1了，如果是完全按照計算來做補償，圖形將很大一部分跑出了雙參數圖，也就是說無法得到我們滿意的圖形，但由于我們勾選了“Random Bias”，所有的圖形將重新被分配，就像上圖的Q1門中的顯示一樣。，我們通常按照細胞聚集區(qū)的中心點來計算，但實際的原理是按細胞團的平均值來計算。Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗FL1-未染色FL2-未染色FL1-染色FL2-未染色

30、FL1-FITC CD3補償后補償后平均值平均值= 2.0 FL1-染色FL2-未染色Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗上機檢測上機檢測樣本染色及溶血過程處理完后應立即上機檢測打開流式細胞儀 (選擇進行質控程序）打開應用軟件并選擇相應的方案或新建方案加載或重新調節(jié)各參數上樣檢測流式細胞儀使用一般方法及技巧Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗技巧一：定位目標細胞群體技巧一：定位目標細胞群

31、體尋找細胞群：如標本為外周血白細胞，在FSC/SSC散點圖中信號最強的為粒細胞，依次為單核、淋巴、紅細胞碎片。如尋找淋巴細胞，可首先調低FSC/SSC電壓定位粒細胞后逐步調高電壓依次尋找各細胞群。如標本中無明顯特征細胞群，可使用已建淋巴細胞檢測方案根據相對位置定位目標細胞群流式細胞儀使用一般方法及技巧Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗技巧二：陰性或陽性對照技巧二：陰性或陽性對照陰性對照作用：調節(jié)PMT電壓；設立陰、陽性界線使用抗體相應同型熒光免疫球蛋白作為陰性對照，注對照及抗體需出自同一廠家（檢測一過性樣本中的某些指標）使用對照組樣本

32、作陰性對照（與其他實驗中對照組含意相同，但此時仍需使陰性對照初始化儀器）對與非抗體染色，如各類核酸染料或探針：PI、ANNEXIN-V。使用空白標本作為陰性對照，或設立陽性對照。流式細胞儀使用一般方法及技巧Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗技巧三：檢測指標技巧三：檢測指標檢測前要清楚地知道：除陽性百分比指標外，還有熒光強度指標。后者往往比前者更有意義檢測時，靈活應用放大模式：線性或對數（如指標相差不大，使用線性放大，如：SSC、FSC；一般熒光參數使用對數放大）靈活運用設門（Region和Gate）的邏輯關系及顏色示蹤功能，可使檢測結

33、果更為明了合理選擇不同的熒光素標記試劑，以最少的投入獲取最多的信息流式細胞儀使用一般方法及技巧Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗例：檢測正常成人外周血淋巴細胞例：檢測正常成人外周血淋巴細胞CD4/CD8/CD3Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗復雜方案分析復雜方案分析了解流式儀胞儀各參數的意義熟悉設門操作開擴思路，靈活設計各種檢測方案Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗http:/http:/www.partec.de

34、我們的網站Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗流式細胞術流式細胞術流式細胞分析，又稱流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。他綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各門學科。Partec - Ex

35、cellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗常用熒光染料種類488nm藍色激光激發(fā)： FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色 530nm PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nm PerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：紅色675nm PI(碘化丙啶）：橙紅色 620nm637nm紅色激光激發(fā)： APC(別藻蘭蛋白）：紅色 665nm APC-Cy5(別藻蘭蛋白的衍生物）：深紅色 710nm365nm紫外光激發(fā)： DAPI（4，6-咪基-2聯(lián)苯吲哚）：藍色 455nm532nm綠色激光激發(fā)： PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm P

36、E-Dy647 （PE的衍生物）：紅色 647nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nmPartec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經驗待測細胞被制備成單個細胞的懸液，經特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進入流動室。流動室內充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞被激發(fā)產生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學系統(tǒng)（透鏡、光闌，濾片和檢測器等）用以收集熒光信號。光電倍增管將收集的光信號轉化為電信號再傳輸至計算機，計算機通過相應的軟件將電信號模擬成圖像。流動室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為350250um的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢,因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室內充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液流是一種穩(wěn)定流動的液體，操作人員無法隨意改變其流動的速度,樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，結合