生物大分子分離純

1、會(huì)計(jì)學(xué)1生物大分子分離純生物大分子分離純 在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作。 生物材料的選擇及預(yù)處理組織與細(xì)胞破碎初級提取分離精細(xì)分離純化純度鑒定產(chǎn)物處理 制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的來源無非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。 選擇的材料應(yīng)含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加

2、工處理。 動(dòng)物組織動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛。绻蟮某煞衷诩?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。 植物植物要先去殼、除脂。 微生物材料微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。 生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動(dòng)物材料則需深度冷凍保存。 (2)物理法：1) 反復(fù)凍融法：反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2) 超聲波處理法：超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長一些。3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹

3、底破碎細(xì)胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4) 冷熱交替法冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1) 自溶法：自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。2) 溶脹法：溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞

4、內(nèi)含物。 3) 酶解法：酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。 4) 有機(jī)溶劑處理法：有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。 “提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。 影響提取的因素主要有： 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； 由固相擴(kuò)散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常：極性物質(zhì)

5、易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。生物大分子的提取離子交換層析法離子交換層析法 電泳法電泳法電荷性質(zhì)的差異電荷性質(zhì)的差異分子大小形狀差異分子大小形狀差異凝膠過濾法凝膠過濾法 超濾法超濾法 透析法透析法 離心法離心法溶解度差異溶解度差異分配層析分配層析萃取萃取結(jié)晶結(jié)晶鹽析鹽析有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀 選擇性沉淀選擇性沉淀沉沉淀淀法法取動(dòng)物肝臟組織制作組織漿液所需蛋白的粗提蛋白的純化活性的檢驗(yàn)?zāi)z電泳鑒定提取純度實(shí)驗(yàn)主

6、要流程實(shí)驗(yàn)主要流程制作組織漿液取新鮮動(dòng)物肝臟剪碎取新鮮動(dòng)物肝臟剪碎冰放進(jìn)培養(yǎng)皿中冰放進(jìn)培養(yǎng)皿中移入勻漿器過濾勻漿液為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷勻漿液+藥品混勻轉(zhuǎn)移離心粗蛋白粗蛋白純化蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白SDS凝膠電泳根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比對鑒定出蛋白 在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作。 “提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。 影響提取的因素主要有： 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； 由固相擴(kuò)散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易