實(shí)驗(yàn)四 電泳技術(shù)-LDH-SDS-PAGE及western__ blotting

1、實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四電泳技術(shù)電泳技術(shù)一、定義一、定義 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。 帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。正極移動(dòng)。 是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定等。等。第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理+-1.1.許多生物分子帶有電荷，在電場(chǎng)中可以發(fā)生許多生物分子帶有電荷，在電場(chǎng)中可以發(fā)生 移動(dòng)。移動(dòng)。2.2

2、.每種分子遷移率不同，一定時(shí)間內(nèi)在電場(chǎng)中每種分子遷移率不同，一定時(shí)間內(nèi)在電場(chǎng)中 的遷移距離不同。的遷移距離不同。在一定在一定pH條件下，每一種分子條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理原理。原理原理二、電泳遷移率二、電泳遷移率 設(shè)一帶電粒子在電場(chǎng)中所受

3、的力為設(shè)一帶電粒子在電場(chǎng)中所受的力為F F，則，則 F = QEF = QE（Q Q為粒子所帶電荷，為粒子所帶電荷，E E為電場(chǎng)強(qiáng)度）為電場(chǎng)強(qiáng)度） 根據(jù)根據(jù)StokeStoke定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動(dòng)定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動(dòng) 所受的阻力所受的阻力f f為：為： f f = 6 = 6rvrv（v v為分子移動(dòng)速度；為分子移動(dòng)速度；r r為分子半徑；為分子半徑；為介質(zhì)為介質(zhì) 黏度）黏度） 當(dāng)分子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，當(dāng)分子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)， F = F = f f 即即 QE= 6QE= 6rvrv 移項(xiàng)得移項(xiàng)得 v/E=Q/ 6rv/E=Q/ 6r v/E:v/E:表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)速

4、度，稱表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)速度，稱 為為遷移率遷移率，也稱，也稱電泳速度電泳速度，以，以 表示表示。 因此上式也可表示為：因此上式也可表示為： = = Q Q / 6/ 6r r 從上式可推知，從上式可推知，帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)與帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)與: : 粒子大小有關(guān)，顆粒愈小愈快粒子大小有關(guān)，顆粒愈小愈快 粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快 粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素三、影響遷移率的因素1.1.電場(chǎng)強(qiáng)度（電場(chǎng)強(qiáng)度（E E） 電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降。電泳速度與電場(chǎng)電泳速度與電場(chǎng) 強(qiáng)度成正比。強(qiáng)度成正比

5、。電場(chǎng)強(qiáng)度越高電泳速度越快電場(chǎng)強(qiáng)度越高電泳速度越快。 根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度大小，電泳可分為： 常壓電泳：210V/cm 高壓電泳：20200V/cm2.2.溶液的溶液的pHpH值值 pH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少。選擇合適pH，使混合物中各成分所帶電量差別較大。 pHpIpHpI帶負(fù)電帶負(fù)電 pHpIpHpI時(shí)從陰極向陽(yáng)極依次排列為L(zhǎng)DH5、LDH4、LDH3、LDH2、LDH1 。 血清LDH同工酶檢測(cè)的臨床意義：血清LDH同工酶的正常值為L(zhǎng)DH1 32.7%、LDH2 45.1%、LDH3 18.5%、LDH4 2.9%、LDH5 0.8% 不同組織中LDH同功酶譜不一樣，臨床上可根據(jù)酶譜的變化協(xié)助診斷 檢測(cè)原理 乳酸鈉為基質(zhì)，在輔酶I（NAD+）的存在下，LDH能使乳酸鈉脫氫生成丙酮酸，而NAD+還原成NADH+H+，NADH+H+可將氫傳遞給吩嗪二甲酯硫酸鹽