第2節(jié) 基本原理與主要分離類型

1、2022-5-21第第十一十一章章高效液相色譜分高效液相色譜分析法析法一、液一、液- -固吸附色譜固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph二、液二、液- -液分配色譜液分配色譜liquid- liquid partition chromatograph三、離子交換色譜三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph四、離子色譜四、離子色譜ion chromatograph五、離子對色譜五、離子對色譜ion-pair chromatograph六、排阻色譜六、排阻色譜size- exclusion chromatograph七、親和

2、色譜七、親和色譜(AC)(AC)Affinity chromatograph第二節(jié)第二節(jié)主要分離類型與原理主要分離類型與原理high performance liquid chromatographbasic principle and main separating typesHPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳鍵合相色譜2022-5-21一、一、 液液-固吸附色譜固吸附色譜liquid-solid adsorpt

3、ion chromatography 固定相固定相：固體吸附劑如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動相流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑，相似相溶，即極性大的試樣用較強(qiáng)的流動相，反之亦然。 基本原理基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2022-5-21 吸附劑含水量是控制吸附劑活性，影響溶質(zhì)保留的重要因素。2022-5-21 當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要

4、它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉啵ㄈ軇┓钟茫┯谑牵诠潭ㄏ啾砻姘l(fā)生競爭吸附:Xs + nMmXm +nMs吸附解吸2022-5-21二、二、 液液-液分配色譜液分配色譜liquid- liquid partition chromatography 固定相與流動相均為液體（互不相溶）； 基本原理基本原理：組分在固定相和流動相上的分配； 流動相流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相正相 normal phase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相固定

5、相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2022-5-212022-5-21 （1）非極性鍵合相 （2）弱極性鍵合固定相 （3）極性鍵合相2022-5-21 表面基團(tuán)為非極性羥基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基（C1）、苯基等。 常用于反相色譜 非極性鍵合相的烷基鏈越長，穩(wěn)定性越好，溶質(zhì)的K越大，載樣量越高，分離選擇性越好。2022-5-21時間，時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3

6、-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯2022-5-21（2）弱極性鍵合固定相）弱極性鍵合固定相 常見的有醚基和二羥基鍵合相常見的有醚基和二羥基鍵合相 可用于正相或反相色譜可用于正相或反相色譜（3）極性鍵合相）極性鍵合相n氨基鍵合相： 硅膠-氨丙硅烷基Si(CH2)3NH2 氰基鍵合相： 硅膠-氰乙硅烷基Si(CH2)2CN 一般用于正相色譜一般用于正相色譜2022-5-21國產(chǎn)：YWG-C18H37 YQG-C18H37 YWG-CN YQG-NH2 YWG-C6H5進(jìn)口：Spherisorb ODS Lichrosorb -CN 2022-5-21特點： 1）不易流失； 2）熱穩(wěn)定

7、性好； 3）化學(xué)性能好：可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性； 4）載樣量大； 5）適于梯度洗脫存在著存在著雙重分離機(jī)制雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；使用時應(yīng)注意：1）流動相pH應(yīng)在28，否則會引起硅膠溶解2）不同廠家，不同批號的同一類型鍵合相也可能表現(xiàn)不同的色譜特性。2022-5-212022-5-212022-5-21三、三、 離子交換色譜離子交換色譜ion-exchange chromatography 固定相固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動相流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定

8、相，采用堿性水溶液； 基本原理基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2022-5-21 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換

9、： 陰離子交換： Xm+ YRs+_Y+mX+Rs+_X_mYR+s_+Y_m+X_R+s2022-5-21 凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 2022-5-21四、四、 離子色譜離子色譜ion chromatography 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。2022-5-21五、五、2022-5

10、-21 陰離子分離陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子； 色譜條件色譜條件：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+ X -后；在兩相間分配。2022-5-21六、六、 排阻色譜色譜排阻色譜色譜size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中

11、速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 2022-5-21七、七、 親和色譜親和色譜(AC) Affinity chromatograph 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2022-5-21八八、液相色譜的流動相、液相色譜的流動相 mobile phases of LC 液相色譜的流動相

12、又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； 1、流動相特性、流動相特性1）與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2）對試樣有適宜的溶解度。使k在1-10范圍內(nèi)。3）與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)到最高靈敏度。2022-5-214）高純度。 否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長增加；5）低的粘度。 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。

13、2022-5-212. 2. 流動相類別流動相類別 按流動相組成分按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2022-5-213. 3. 流動相選擇流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022-5-212022-5-211、相對分子量分子量2000，凝膠色譜柱分子量2000，但同時分