實(shí)例圖解簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)

1、a1a2實(shí)例圖解簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)實(shí)例圖解簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)一、序言設(shè)計(jì)一對(duì)合適的引物是PCR 擴(kuò)增目的基因成功的關(guān)鍵，但許多人往往過度依賴 Primer Premier（以下簡(jiǎn)稱PP）或Oligo 等引物設(shè)計(jì)軟件，有時(shí)候引物沒設(shè)計(jì)成，卻身陷軟件之中無(wú)法自拔。其實(shí)，不論特異性引物或簡(jiǎn)并引物，只要掌握了幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，手動(dòng)也可以設(shè)計(jì)出一對(duì)好引物。如果不是大批量設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物序列，下面的四個(gè)常用工具即可輕松勝任引物設(shè)計(jì)任務(wù)。下文以馬鈴薯Y 病毒CP 基因簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)為示例，分享一些個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，希望對(duì)初學(xué)者能起個(gè)拋磚引玉作用。受專業(yè)領(lǐng)域及水平所限，文中有不當(dāng)之處，敬請(qǐng)各位同仁、同學(xué)批評(píng)指正。二、相關(guān)工具M(jìn)E

2、GA5-多重序列比對(duì)、選取基因區(qū)域、序列編輯；DNAMAN8-檢測(cè)兩引物的互補(bǔ)性；Oligo Calc-評(píng)估引物的屬性；1.Web Logo 3-直觀顯示簡(jiǎn)并堿基。a3三、基本原則設(shè)計(jì)一對(duì)好的引物，歸結(jié)起來(lái)就是 5端引物、3端引物之間以及兩者與模板的關(guān)系處理得恰到好處：兩引物的序列要與模板的序列緊密互補(bǔ)；兩引物不能在模板的非目的位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)配；兩引物之間盡量減少二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)生成。四、延伸原則引物長(zhǎng)度：常用為 18-27bp，最大不可超過 38bp，否則容易導(dǎo)致延伸溫度過高，不適合 DNA 聚合酶反應(yīng)；GC 含量：一般介于 40%-60%之間，且兩個(gè)引物之間的 GC 含量相差不能過于懸殊；1.

3、 堿基分布：隨機(jī)分布最佳，但避免連續(xù)的 GC，GC 富集區(qū)容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)反應(yīng)。a4五、特別注意5端引物的作用主要限定 PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度，對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；引物的延伸是從3端開始的，所以 3端引物是影響特異性擴(kuò)增的最關(guān)鍵因素，因此，在實(shí)際設(shè)計(jì)過程中，設(shè)計(jì)3端引物時(shí)，需要綜合考慮以下幾個(gè)內(nèi)容：不要終止于密碼子的第 3 位；末位堿基避免使用堿基 A；避免出現(xiàn)3 個(gè)以上連續(xù)的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；G 的絕對(duì)值不可超過 9；與非特異擴(kuò)增的序列同源性不能超過70%或有連續(xù)8 個(gè)互補(bǔ)堿基源；1.不能進(jìn)行任何修飾。a5六、設(shè)計(jì)流程a6七、示例背景馬鈴薯Y 病毒（Potato viru

4、s Y，PVY）是侵染馬鈴薯、煙草、辣椒等茄科作物并造成嚴(yán)重危害的病毒之一，廣泛分布全球各馬鈴薯種植區(qū)。RT-PCR 技術(shù)具有高度的特異性和靈敏性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為 PVY 檢測(cè)最常見的方法。但由于PVY 株系分化嚴(yán)重，不斷有新的重組株系產(chǎn)生，單一的特異性引物無(wú)法適應(yīng)PVY 不同株系的檢測(cè)需求，需要設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物以能夠滿足生產(chǎn)上的檢測(cè)需求。a7八、詳細(xì)圖解1. 序列準(zhǔn)備：序列準(zhǔn)備：（1）GenBank 下載PVY 全基因組序列；（2）由于基因序列比較大，且數(shù)量多，推薦用MAFFT 多重序列比對(duì)；（3）擴(kuò)增片段區(qū)域選擇，CP 基因長(zhǎng)度及位置如下圖所示：a8 先將光標(biāo)定位在第一條序列任意位置，然后

5、在左下角Site處直接輸入 C P 基 因 上 游 分 界 點(diǎn) 位 置 （ 8 3 9 1 ） 后 回 車 。 接 著 點(diǎn) 擊“Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界點(diǎn)時(shí)按下鍵盤上“Shift”不放，移動(dòng)光標(biāo)到“1”那一列，此時(shí)點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵“Delete”刪除冗余序列。a9 裁切后得到CP 基因編碼區(qū)序列，“Export Alignment”導(dǎo)出CP 基因序列（推薦fasta 格式）。a102. 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)推薦先設(shè)計(jì)3端引物，至于原因，上面的【特別注意】中已提到，這里不再贅述。（1）選擇引物序列）選擇引物序列綜合考慮引物設(shè)計(jì)原則及特別注意，在CP 基因3端位置選取一段合適

6、的序列（784-803bp），804bp 位置為A 且是第三個(gè)密碼子位置，所以棄去末位的 A 堿基。a11 PS：是否位于密碼子的第3 位，可以通過“ Tr a n l a t e d P r o t e i n Sequences”-“DNA sequences”切換查看，如右圖，CP 基因的末端3 個(gè)堿基是終止密碼子所在的位置，A 是第三位密碼子。a12（2）生成）生成 Seq Logo選定序列后，參考上述步驟，刪除冗余序列，保留CP 基因3端序列，同樣導(dǎo)出為Fasta文件，將序列粘貼入Web Logo3的文本框內(nèi)或直接上傳序列文件，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后點(diǎn)擊“Create”生成 Seq Logo

7、 格式的文件。參數(shù)設(shè)置：參數(shù)設(shè)置： “Output format”（輸出格式）推薦用“PDF”，“Color scheme”（顏色方案）推薦用“Classic (NA)”，設(shè) 置 完 畢 ， 點(diǎn) 擊 右 下 角 “ C r e a t e Logo“即可得下圖的Seq Logo 格式文件。a13通過Web Logo 生成的多重比對(duì)圖片可以很直觀得到3端序列為CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查詢簡(jiǎn)并堿基代碼表（下圖），可知C/T/G=B，G/A=R，簡(jiǎn) 并 度 = 3 2 = 6 ， 整 理 后 3 端 序 列 為 CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要

8、合成的3端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （與原序列是反向互補(bǔ)關(guān)系）。簡(jiǎn)并堿基代碼代碼堿基代碼堿基RA, GYC, TKG, TSG, CMA, CWA, TBG, C, TVA, G, CDA, G, THA, C, TNA, G, C, Ta143. 質(zhì)量評(píng)估質(zhì)量評(píng)估（1）參數(shù)評(píng)估將初步得到的引物序列，粘貼入Oligo Calc 的文本框內(nèi)，按下“Calculate”按鈕，得到引物的相關(guān)參數(shù)，如：長(zhǎng)度、GC 含量、Tm 值等信息。（2）自身互補(bǔ)性（Check Self-Complementarity）點(diǎn)擊“Check Self-Complementarity”，檢測(cè)引

9、物自身互補(bǔ)性，主要查看“Potential hairpin formation”、“3 Complementarity”、“All potential self-annealing sites are marked in red (allowing 1 mis-match)”下方顯示內(nèi)容，如果三項(xiàng)均為“none”，則說(shuō)明引物自身不會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)且引物自身不會(huì)互補(bǔ)，引物沒問題！a15a16（3）BLAST 比對(duì)回檢比對(duì)回檢點(diǎn)擊“Blast”可以對(duì)引物進(jìn)行BLAST 比對(duì)檢測(cè)，結(jié)果顯示，都是PVY CP 基因相關(guān)的序列，表明所設(shè)計(jì)的引物特異性良好。a17a18（4）兩引物互補(bǔ)性檢查）兩引物互補(bǔ)性檢

10、查 同樣方式，得到5端序列：GSAAAYGAYACAATYGATGC，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，需要檢測(cè)兩引物之間是否存在序列互補(bǔ)。 打開DNAMAN，依次在“Primer”-“Load primer”，粘貼任意一端引物序列，如：5端序列-GSAAAYGAYACAATYGATGC，確定。a19a20 接 著 ， 在 “ P r i m e r ” - “ T w o p r i m e r s Complementarity”-“Second Primer From Input”，粘貼入另一端序列，這里為3端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下圖：a21 結(jié)果顯示，兩引物間僅有3

11、個(gè)堿基互補(bǔ)，且自由能僅為1.8 Kcal/mol。a22（5）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PCR 擴(kuò)增采用的 50L 反應(yīng)體系為：10 TransTaq HiFi Buffer II 5 L，2.5nM dNTPs 4 L， 5端引物（10 mol/L）2 L，3端引物（10 mol/L）2 L，ddH2O 34.75 L，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/L）0.25 L，cDNA 2 L。PCR 擴(kuò)增程序條件為：94預(yù)變性5min，94變性30s，55復(fù)性30s，72延伸1min，共30 個(gè)循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如下圖所示：a23 M.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：陰性對(duì)照（健康馬鈴薯）和空白對(duì)照；泳道8-12：PVX、PVM、PVA、PVS、PLRVa24九、延伸閱讀九、延伸閱讀 1 吳祖建, 高芳鑾, 沈建國(guó). 生物信息學(xué)分析實(shí)踐.