酶在食品中的應(yīng)用PPT講稿

1、酶在食品中的應(yīng)用酶在食品中的應(yīng)用匯報(bào)人：張玉冬 通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。 目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域，如食品保鮮、制糖工業(yè)、釀造工業(yè)、焙烤工業(yè)、乳制品工業(yè)、水果蔬菜加工、肉類及魚蝦類加工、蛋品加工、天然食品添加劑的生產(chǎn)以及改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味等諸多方面。 食品在加工、運(yùn)輸和保鮮過程中，常易受到氧氣、微生物、溫度、濕度、光線等各種外界因素的影響，因使食品的色、香、味及營(yíng)養(yǎng)會(huì)發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致食品敗壞，降低食品的食用價(jià)值。因此，食品保鮮已是食品加工、

2、運(yùn)輸、保藏中的重要問題，已引起食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。 酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對(duì)食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長(zhǎng)食品保藏期的技術(shù)。 目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點(diǎn)、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。 大多數(shù)用途是在原料的加工與食品的生產(chǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：淀粉類食品、蛋白質(zhì)類食品、果蔬類食品、乳制品、飲料、天然食品添加劑等。1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用2、在蛋白質(zhì)制品的

3、加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等?；蚩梢陨晒咸菨{、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖果、冰淇淋、飲料、面包等的加工。蛋白質(zhì)食品是一種以蛋白質(zhì)為主要原料加工而成的食品。以天然的大分子蛋白存在的蛋白質(zhì)往往不具有生物活性或加工性能較差，而經(jīng)過某些蛋白酶的水解后往往能夠提高其生物活性或加工性能。目前較常用的是蛋白酶

4、和乳糖酶。在果蔬類食品的生產(chǎn)過程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。將酶制劑應(yīng)用于果蔬加工，主要有以下幾方面的作用。果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁、褐變等不良因素的主要原因，以傳統(tǒng)的壓榨和過濾等生產(chǎn)工藝難以使果蔬汁達(dá)到較高品質(zhì)，并且營(yíng)養(yǎng)成分大量損失。而酶技術(shù)的應(yīng)用，不僅克服了傳統(tǒng)加工工藝的缺點(diǎn)，且大幅度增加了果蔬汁的品質(zhì)。在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。此外在增香、除異味、提取果膠、真空或加壓滲酶法處理完整果蔬和提取蔬菜汁中酶的應(yīng)用也非常廣泛。1、啤

5、酒工業(yè)中的應(yīng)用 啤酒以其特有的“麥芽的香味、細(xì)膩的泡沫、酒花的苦澀、透明的酒質(zhì)”為人們所喜愛。由于啤酒含有豐富的氨基酸和維生素, 因此被稱為“液體面包”。制麥芽大麥含有全麥啤酒釀造用到的所有的酶, 現(xiàn)在企業(yè)用到大量的谷物作為替代品, 所以需要外源酶。而利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)與傳統(tǒng)啤酒釀造技術(shù)相結(jié)合, 將提高啤酒質(zhì)量, 降低生產(chǎn)成本, 增加企業(yè)效益。酶在啤酒生產(chǎn)中的作用主要有輔料液化、提高發(fā)酵度降低雙乙酰、改善麥汁過濾、增加- 氨基酸、提高啤酒穩(wěn)定性、改善膜過濾速度、消除雜菌污染、啤酒除氧等。2 、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用 白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國(guó)的一大傳統(tǒng)民族工業(yè), 多年來為我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大

6、貢獻(xiàn)?，F(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn), 既要保持原酒的風(fēng)味特色, 又要提高出酒率、簡(jiǎn)化操作, 這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。目前, 酶在這兩種酒的生產(chǎn)應(yīng)用中已經(jīng)很廣泛。釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力強(qiáng)、用量少、使用方便等優(yōu)點(diǎn),適量添加可提高出酒率和品質(zhì)。糖化酶、液化酶是白酒黃酒釀造中主要用酶, 目前流行的生料釀酒和液化法黃酒釀造也主要是利用這兩種酶直接將淀粉液化糊化糖化來代替蒸煮作用的原理, 而通過酶的固定化技術(shù)將它們固定在載體上, 效果更好, 也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 在一些國(guó)家對(duì)用化學(xué)劑改良法 將作出立法限制，這 就 意味著更 需要用酶 法工

7、藝來生產(chǎn)受歡迎的產(chǎn)品。用作焙烤食品面粉來源的小麥和其他谷物含有一些天 然存在的 酶,這些酶對(duì)于谷物的發(fā)芽和 生長(zhǎng)是必 需的。這 些酶在焙烤工藝中亦十分重要,沒有它們,焙烤加工便不可能。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。 近年,酶在乳品中的應(yīng)用已擴(kuò)展到更廣的領(lǐng)域?？偟膩碚f,當(dāng)前在乳制品生產(chǎn)中最常用、最重要的幾種酶為蛋白酶主要為凝乳酶、乳糖酶、乳過氧化物酶和脂肪酶等。酶在乳制品中最主要的應(yīng)用是蛋白酶的應(yīng)用,特別是用凝乳酶加工干酪,以及用乳糖酶將乳糖分解,以提高有乳糖不耐癥的人對(duì)乳制品的消化力。乳過氧化物酶保鮮鮮奶和乳制品也已在國(guó)內(nèi)、國(guó)際得到了較廣泛的應(yīng)用。 食品添加劑是指用于改

8、善食品品質(zhì)和風(fēng)味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的少量化學(xué)合成或天然物質(zhì)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代食品行業(yè)中不可缺少的部分。 按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑、抗結(jié)劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護(hù)色劑、酶制劑、增味劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、防腐劑、甜味劑、增稠劑、香味劑等二十余類。 隨著酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，作為高效、安全的生物催化劑，酶已在食品添加劑的生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。 D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶家族酶因其底物專一性的不同,被分為D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶(DTEase酶)和D-阿

9、洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶(DPEase酶)兩類。自1993年,日本學(xué)者第一次于Pseudomonas cichorii ST-24中發(fā)現(xiàn)一種可以催化己酮糖C-3位差向異構(gòu)化的酶,命名為D-己酮糖 3-差向異構(gòu)酶。因其最適底物為D-塔格糖,后重新命名為DTEase酶。隨后,又發(fā)現(xiàn)另一種潛在的DTEase酶,該酶的最適底物為D-阿洛酮糖,可高效催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化,因此被命名為DPEase酶。與DTEase酶相比,DPEase酶對(duì)果糖的差向異構(gòu)活性更高,具有更高的應(yīng)用價(jià)值,所以近年來研究主要集中在DPEase酶上。微生物來源不同的DTEase家族酶具有不同的酶學(xué)性質(zhì)。雖然DTEase

10、家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化,其活性中心,金屬離子結(jié)合部位和底物結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守。來源于A. tumefaciens和C. cellulolyticum的DPEase酶及來源于 P. cichorii的DTEase酶的晶體結(jié)構(gòu)被揭示。DTEase家族酶具有一個(gè)典型的TIM桶狀結(jié)構(gòu),由8個(gè)重復(fù)的-折疊和-螺旋單元構(gòu)成(/)8結(jié)構(gòu)。其中包含的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)表明金屬離子在催化時(shí)對(duì)于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。Clostridium Clostridium boltea

11、ebolteae D-D-阿洛酮糖阿洛酮糖3-3-差向異構(gòu)差向異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程與食品級(jí)表達(dá)酶的蛋白質(zhì)工程與食品級(jí)表達(dá)江南大學(xué)食品生物技術(shù)2014.6糖尿病是一種世界性新興的疾病, 嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。因此,利用低血糖應(yīng)答的甜味劑代替蔗糖成為預(yù)防糖尿病的有效方法。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味劑,屬于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%,但其能量?jī)H為蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神經(jīng)保護(hù)等重要的生理功能。在食品加工過程中,可改善凝膠特性并可產(chǎn)生良好

12、的風(fēng)味。D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開發(fā)使D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613 進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng),確定該菌株具有催化 D-果糖差向異構(gòu)生成 D-阿洛酮糖的能力,無副產(chǎn)物產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上,對(duì)該鮑氏梭菌(C. bolteae)ATCC BAA-613 全基因組中預(yù)測(cè)的 DPEase 酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá);對(duì) DPEase 酶進(jìn)行分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、構(gòu)效關(guān)系及分子改造等方面進(jìn)行研究;實(shí)現(xiàn) DPEase 酶在食品級(jí)宿主枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis 中表達(dá),并分別基于 Cre/

13、lox 系統(tǒng)和反向篩選標(biāo)記 mazF 基因,成功構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。 1、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)（1）、 C. bolteae DTEase 酶基因的擴(kuò)增（2）、 PCR 產(chǎn)物的克?。?）、 C. bolteae DTEase 酶基因的測(cè)序及序列分析（4）、 D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（5）、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化（6）、重組 E. coli 細(xì)胞催化 D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)（7）、 D-阿洛酮糖的鑒定證明基因CLOBOL_00069 所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序列與 DTEase 家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,

14、因此,EDP19602 可能是一種 DTEase 家族酶。將質(zhì)粒 pMD-CLOBOL_00069 與載體 pET-22b(+)分別用 Nde I 和 Xho I 酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖 2-8 所示。載體 pET-22b(+)帶有C 末端 His-Tag 序列,利用 pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有 6 個(gè) His 標(biāo)記,可利用Ni2+-Chelating Fase Flow 親和色譜柱進(jìn)行純化。2、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶的分離、 純化及酶學(xué)性質(zhì)研究（1）、 Ni2+-Chelating Sepharose Fast F

15、low 親和層析（2）、 Superdex 200 (10/300 GL) 凝膠層析純化結(jié)果（3）、 Superdex 200 凝膠色譜確定 C. bolteae DPEase 酶的分子量（4）、 金屬離子對(duì) C. bolteae DPEase 酶酶活的影響（5）、C. bolteae DPEase 酶的最適 pH 及 pH 穩(wěn)定性（6）、C. bolteae DPEase 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性（7）、 C. bolteae DPEase 酶的底物特異性及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究（8）、C. bolteae DPEase 酶的平衡率C. bolteae DTEase酶亞基分子量約為34 kDa,

16、比預(yù)測(cè)的分子量33 kDa大約1 kDa,可能是由于在其C端增加6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。經(jīng)過 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 親和層析柱純化后,即可獲得較純的目的蛋白。計(jì)算得到目的蛋白分子量約為139 kDa,說明該DTEase酶可能是四聚體。此結(jié)果與來源于A. Tumefaciens和C. cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。該酶的最適反應(yīng) pH 為 7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在 pH 6.07.5的緩沖液中保持 2 h 后,殘余酶活可在 90%以上;而在偏酸或偏堿性環(huán)境下,其酶活損失較大。酶的在55的酶活最高當(dāng)溫度6

17、0 后,酶活力隨溫度升高而顯著下降3、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶基因的催化機(jī)理初探及分子改造（1）、 C. bolteae DPEase 的結(jié)構(gòu)分析及活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)（2）、 改造位點(diǎn)的確定（3）、 Ala 掃描定點(diǎn)突變（4）、催化活性中心關(guān)鍵氨基酸 Glu152 和 Glu246 的定點(diǎn)突變（5）、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸 Glu158,His188 和 Arg217 的定點(diǎn)突變（6）、底物識(shí)別關(guān)鍵氨基酸 Tyr68 和 Gly109 的定點(diǎn)突變（7）、 Y68 和 G109 位突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)（8）、雙突變體酶 Y68I/G109P 的酶學(xué)性質(zhì)研究4、C. bolteae

18、D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)（1）、 C. bolteae DPEase 酶基因克?。?）、 B. subtilis 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定（3）、 B. subtilis 重組菌的表達(dá)及活性鑒定（4）、重組 C. bolteae DPEase 酶的分離純化（5）、重組 C. bolteae DPEase 酶的酶學(xué)性質(zhì)5、基于Cre/lox系統(tǒng)的C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶基因的食品級(jí)表達(dá)（1）、重疊 PCR（2）、 pP43DPE 載體的克?。?）、表達(dá)載體 pDGI-7S6 的構(gòu)建（4）、表達(dá)載體 pDGI-7S6-DPE 的構(gòu)建（5）、重

19、組菌B. Subtilis/7S6-DPE 的構(gòu)建及篩選（6）、重組菌B. subtilis/lox-DPE, pTSC 的構(gòu)建及篩選（7）、重組菌B. subtilis/lox-DPE 的構(gòu)建及篩（8）、重組菌B. subtilis/lox-DPE 的發(fā)酵曲線6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶基因的食品級(jí)表達(dá)（1）、表達(dá)載體 pDGI-DPE 的構(gòu)建（2）、重組菌 B. subtilis/REF 的構(gòu)建及篩選（3）、重組菌 B. subtilis/DPE 的構(gòu)建及篩選（4）、重組菌 B. subtilis/DPE 的發(fā)酵曲線1、利用PCR的方法擴(kuò)

20、增獲得C. bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia. coli BL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E. coli BL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。2. 對(duì)重組菌株 E. coli BL21/ pET-22b(+)-CLOBOL_00069 的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期 OD 值為 1.0 左右后,加入終濃度為 5 g/L 的乳糖,20 條件下誘導(dǎo) 7 h,可達(dá)到最大酶活,為 6.1 U/mL 發(fā)酵液。利用重組菌株 E. coliBL21/p

21、ET-22b(+)-CLOBOL_00069 全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)鑒定,產(chǎn)物為 D-阿洛酮糖,說明C. bolteae ATCC BAA-613 的 DPEase 基因在 E. coli BL21中表達(dá)正確并具有轉(zhuǎn)化 D-果糖為 D-阿洛酮糖的能力。3. 利用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 親和層析柱和 Superdex 200 10/300 GL 凝膠柱對(duì) C. bolteae DPEase 酶進(jìn)行分離純化,其亞基分子量約為 34 kDa,酶蛋白分子量為139 kDa,證實(shí)來源于 C. bolteae 的 DPEase 酶為四聚體酶。C. bolteae

22、 DPEase 酶是金屬蛋白酶,Mn2+和 Co2+可顯著增強(qiáng)酶活。當(dāng) Co2+濃度為 0.4 mmol/L 時(shí),C. bolteae DPEase酶獲得最大酶活。4. C. bolteae DPEase 酶的最適反應(yīng) pH為7.0,在 pH6.57.5 之間其相對(duì)酶活較高,表現(xiàn)出良好的活性。最適反應(yīng)溫度為 55,在 45 以下,該酶較穩(wěn)定,當(dāng)溫度大于 50 時(shí),酶的熱穩(wěn)定性較差。在 Co2+存在的情況下,酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。55 時(shí),Co2+的添加可使酶的半衰期延長(zhǎng)至原來的 3.6 倍。5. 研究C. bolteae DPEase酶的底物特異性,發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)D-阿洛酮糖的底物特異性最高,D-

23、果糖次之,其次為D-塔格糖,而對(duì)磷酸化的糖基本沒有作用。并測(cè)定該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù),當(dāng)以D-阿洛酮糖作為底物時(shí),其Km、kcat和kcat/Km分別為27.4 mM、2935 min-1和107.1 min-1mM-1。該酶對(duì)D-阿洛酮糖的Km值遠(yuǎn)小于其他底物,催化效率kcat/Km較其他底物更大,其說明其對(duì)D-阿洛酮糖的親和性更高,其最適底物是D-阿洛酮糖。因此該酶被鑒定為D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶。6. 利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用 SWISS-MODEL 對(duì) C.bolteae DPEase 酶單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬,利用 Discovery studio 軟件對(duì) C.bolteae DPEase 酶和 D-果糖進(jìn)行對(duì)接,獲得位于活性中心的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為 Glu158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68 和 G109。突變結(jié)果表明,Glu152 和 Glu246 為催化活性中心關(guān)鍵氨基酸,Glu158,His188 和 Arg217 與底物結(jié)合有關(guān),