CRISPRCas9基因組編輯技術、

1、CRISPR/Cas9基因組編輯技術與基因組編輯技術與植物基因功能研究植物基因功能研究尹翠翠、田正書、李德富、高虎虎尹翠翠、田正書、李德富、高虎虎CRISPR/Cas9clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9規(guī)律間隔的短回文重復序列相關核酸酶9系統(tǒng)1987 年，Ishino 等研究大腸桿菌 iap 基因的序列和功能時發(fā)現(xiàn)，在該基因的 3 端非翻譯區(qū)存在 5 個 高度保守的長為 29 nt 的重復序列，這些重復序列被長度為 32 nt 的非重復序列間隔開2007 年，Barrango

2、u 等3首次利用實驗證明了嗜熱鏈球菌的 CRISPR 系統(tǒng)直接參與細菌對噬菌體的適應性免疫反應2012 年，Jinek 等對細菌的 II 型 CRISPR 系統(tǒng)進行改造和優(yōu)化，成功地在體外定點切割了環(huán)狀質粒 DNA 和線性寡聚核苷酸片段CISP-Cas 系統(tǒng)與細菌抵抗外源遺傳物質入侵的免疫系統(tǒng)有關細菌和古細菌破壞噬菌體和外源質粒的免疫保護CISP-Cas 系統(tǒng)可識別并降解外源入侵的 DNA 序列CRISPR/Cas9CISP 基因簇由 CISP 序列與 Cas 蛋白的編碼基因組成CISP 序列為一系列由不同的間隔序列( spacers) 間隔的同向重復序列間隔序列來源于外源基因片段即原間隔序列

3、Cas 蛋白的編碼基因將表達為核酸酶、解旋酶與聚合酶等；CISP 序列則轉錄加工為短的 CISP NAs( crNAs) ，指導 Cas 蛋白與外源入侵片段的識別與降 解。CISP-Cas 系統(tǒng)介導的基因組編輯技術的基本原理，通常將 crNA 與 tracrNA 序列融合為一條引導 NA 序列( single gNA，sgNA)CISP-Cas9基因組編輯技術NA介導的靶向內切酶 CISP-Cas9 基因組編輯技術通過一段短的引導 NA( guideNA) 來引導CAS 9蛋白識別特定的 DNA 序列基因組編輯技術4 種用于基因組編輯的的人工核酸內切酶種用于基因組編輯的的人工核酸內切酶巨核酶技

4、術( Meganucleases鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)(Urnov等2010)轉錄因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)基因組基因組編輯技術編輯技術成本較高，操作較為繁瑣，脫靶風險較高。規(guī)律間隔的短回文重復序列相關核酸酶9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CAS9) (Mali等2013)ADVANTAGE利用多個引導 NA 序

5、列可同時進行基因組上多個不同位點的編輯; 將其DNA 結合域與不同轉錄調控蛋白相融合，可實現(xiàn)對特定基因的轉錄激活或抑制; 將對特定序列的調控蛋白模塊與基因組或表觀基因組的修飾酶相融合，則可實現(xiàn)對基因組的動態(tài)控制Application of CRISPR/CasTechnology引導 gNA 的選擇靶 DNA 序列的設計Cas9 與 gNA 的表達與定位提高打靶特異性的策略降低 sgNA 與Cas9 的濃度，但這一方法的效果還有待討論。有研究表明該方法可顯著降低脫靶突變/打靶突變的比例，但也有研究稱該方法將同時降低脫靶突變與打靶突變的發(fā)生。利用 Cas9 的切口酶突變體( D10A 突變體或 H840A 突變體) 產生 DNA 單鏈斷裂。sgNA 的截短與修飾，如截短其 3端相當于 tracrNA 的序列、在其 5端增加兩個額外的 GG 以及在截短互補識別序列中 5端的2 個或 3 個堿基均可提高 Cas9 的特異性。目前，C