基因工程與基因體外表達(dá)培訓(xùn)課件

1、Genetic Engineering and gene expression in vitro第第1313章章重組重組DNA技術(shù)的開展史技術(shù)的開展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。分子。1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。藥物。

2、1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。英國羅林研究所成功的克隆了多莉。一、重組一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。即無性繁殖。一一 DNA克隆克隆 技術(shù)水平：分子克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) 即即DNA 克隆克隆 細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個(gè)體克隆動(dòng)物或植物個(gè)體克隆動(dòng)物或植

3、物應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA與載體與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆 生物技

4、術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等。工程、細(xì)胞工程等。 目的：目的： 別離獲得某一感興趣的基因或別離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì) 基因工程基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因?qū)崿F(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組又稱重組DNA工藝學(xué)。工藝學(xué)。重組重組DNA技術(shù)根本原理技術(shù)根本原理 根本原理根本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選

5、擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 第一節(jié)第一節(jié)基因克隆是利用工具酶基因克隆是利用工具酶進(jìn)行操作進(jìn)行操作工具酶工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)別是識(shí)別DNA的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈周圍切

6、割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定義：定義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNA。、基因工程技術(shù)中常用基因工程技術(shù)中常用型型 分類：分類： 作用：作用：第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名：命名：Hin d 屬屬

7、 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口II型限制性核酸內(nèi)切酶：型限制性核酸內(nèi)切酶： 能識(shí)別能識(shí)別DNA分子內(nèi)部的特異性位點(diǎn)和切割雙鏈分子內(nèi)部的特異性位點(diǎn)和切割雙鏈DNA， 其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口來源不同的限制酶，但

8、能識(shí)別和切割來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶：同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATC

9、TAG GATCT A 同尾酶同尾酶名稱名稱 識(shí)別序列及切割位點(diǎn)識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5

10、GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5磷酸基和磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯羥基末端之

11、間形成磷酸二酯鍵，使鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第第二鏈合成，雙鏈二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填

12、補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第二節(jié)第二節(jié)基因克隆需要特定的載體基因克隆需要特定的載體 基因載體基因載體 定義定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。 常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vec

13、tor)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。n載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)： 能自主復(fù)制；能自主復(fù)制； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)外源有克隆位點(diǎn)外源DNA插入點(diǎn)，常具有多插入點(diǎn)，常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克

14、隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn)特點(diǎn): : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 polylinker 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列插入型，適用系列插入型，適用cDNA克隆克隆 EMBL系列置換型，適用基因組克隆系列置換型，適用基因組克隆2.2.噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)含改造系統(tǒng)含lacZ基因基因 M13mp系列系列 pUC系列系列DNAProtein

15、 coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phage12bp 替換型載體取代型載體替換型載體取代型載體 外源外源DNADNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段的感染和復(fù)制非必要的片段 ( 20 kb) ( 20 kb) 高感染效率高感染效率 (10 (109 9 轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)化株/ug /ug 載體載體 DNA, DNA, 比質(zhì)比質(zhì)粒高粒高100-100-倍倍) )e.g. EMBL3, DASH凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體既有

16、插入型；又有替換型既有插入型；又有替換型在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛承受外源承受外源DNADNA的能力：幾個(gè)的能力：幾個(gè)kbkb到到23kb23kb3. 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid):適合克隆大的適合克隆大的DNA片段片段 柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1.具有具有噬菌體的特性；噬菌體的特性；2.具有質(zhì)粒載體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；3.具有較高容量的克隆能力；具有較高容量的克隆能力；4.具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒pHC79pHC79系由質(zhì)系由質(zhì)粒粒pBR322pBR322和噬和噬菌體菌體

17、的的coscos位位點(diǎn)的一段點(diǎn)的一段DNADNA構(gòu)成全長構(gòu)成全長4.3kb4.3kb整合型整合型integratedintegrated載體：即外源基因通過這種病毒載體載體：即外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。這類載體的代表是制而擴(kuò)增。這類載體的代表是 SV40 SV40PSVPSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLPGHLpLPGHL、pMSV pMSV 等。等。游離型游離型(transient)(transient)或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外

18、或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。4. 病毒載體病毒載體病毒載體病毒載體優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高； 2 2、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成；、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成； 3 3、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)、不同的病毒載體具有不同的表

19、達(dá)特點(diǎn)。存在的問題：存在的問題：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性染色體毒性染色體毒性免疫毒性免疫毒性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)效率轉(zhuǎn)導(dǎo)效率靶向性靶向性基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間表達(dá)的可調(diào)控性表達(dá)的可調(diào)控性病病 毒毒 載載 體體生生 物物 學(xué)學(xué) 特特 性性適適 用用 范范 圍圍反反 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 病病 毒毒 載載 體體 單單 鏈鏈R N A病病 毒毒 8 1 0 k b可可 感感 染染 分分 裂裂 細(xì)細(xì) 胞胞 ；整整 合合 到到 染染 色色 體體 中中 ；表表 達(dá)達(dá) 時(shí)時(shí) 間間 較較 長長 ；有有 致致 癌癌 的

20、的 危危 險(xiǎn)險(xiǎn) ；E x v i v o基基 因因 治治 療療 ；腫腫 瘤瘤 基基 因因 治治 療療 。腺腺 病病 毒毒 載載 體體 雙雙 鏈鏈D N A病病 毒毒 3 6 k b可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 細(xì)細(xì) 胞胞 ；不不 整整 合合 到到 染染 色色 體體 中中 ；外外 源源 基基 因因 表表 達(dá)達(dá) 水水 平平 高高 ；表表 達(dá)達(dá) 時(shí)時(shí) 間間 較較 短短 ；免免 疫疫 原原 性性 強(qiáng)強(qiáng) ；I n v i v o基基 因因 治治 療療 ；腫腫 瘤瘤 基基 因因 治治 療療 ；疫疫 苗苗 。A A V病病 毒毒 載載 體體 單單 鏈鏈D N A病病 毒毒 5 k b

21、可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 細(xì)細(xì) 胞胞 ；整整 合合 到到 染染 色色 體體 中中 ；無無 致致 病病 性性 ； 免免 疫疫 原原 性性 弱弱 ；可可 長長 期期 表表 達(dá)達(dá) 外外 源源 基基 因因 ；在在骨骨骼骼肌肌、心心肌肌、肝肝臟臟、視視網(wǎng)網(wǎng) 膜膜 等等 組組 織織 中中 表表 達(dá)達(dá) 較較 高高 ；I n v i v o 基基因因治治療療 ；E x v i v o基基 因因 治治 療療 ；遺遺 傳傳 病病 基基 因因 治治 療療 ；獲獲得得性性慢慢性性疾疾病病的的基基 因因 治治 療療 。H S V病病 毒毒 載載 體體 雙雙 鏈鏈D N A病病 毒毒 1 5

22、2 k b具具有有嗜嗜神神經(jīng)經(jīng)性性；可可逆逆軸軸突突傳傳遞遞 ；可可 潛潛 伏伏 感感 染染 ；容容 量量 大大 ；可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 細(xì)細(xì) 胞胞 ；神神經(jīng)經(jīng)系系統(tǒng)統(tǒng)疾疾病病的的基基因因 治治 療療 ；腫腫 瘤瘤 的的 基基 因因 治治 療療 。常用的病毒載體的特點(diǎn)：常用的病毒載體的特點(diǎn)： 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體 如腺病毒，腺病毒相關(guān)病

23、毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒1.5. 其他其他表達(dá)載體表達(dá)載體 指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體稱為體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。表達(dá)載體除具有克隆載。表達(dá)載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)外，還帶有體所具備的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的必需的DNADNA序列序列。根據(jù)受體細(xì)胞不同，表達(dá)。根據(jù)受體細(xì)胞不同，表達(dá)載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真核表載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。達(dá)載體。原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 在原核表達(dá)載體中除含有復(fù)制起始點(diǎn)、抗性基在原核表達(dá)載體中除含有復(fù)制起始點(diǎn)、抗性基因、多克隆位點(diǎn)等與克隆載體一

24、樣之處外，還必需因、多克隆位點(diǎn)等與克隆載體一樣之處外，還必需含有含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列等表等表達(dá)元件。達(dá)元件。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有：原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有：Lac(乳糖啟動(dòng)子乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雙啟動(dòng)子乳糖和色氨酸的雙啟動(dòng)子) 、 P PL L( 噬菌體的左向啟動(dòng)子噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。噬菌體啟動(dòng)子等。真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：原核質(zhì)粒的序列原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序包括在大

25、腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組的重組DNADNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動(dòng)包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-Apoly-A信號(hào)序列、信號(hào)序列、mRNAmRNA剪接信號(hào)剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿

26、主細(xì)胞序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。酶識(shí)別位點(diǎn)等。選用質(zhì)粒最常用做載體的選用質(zhì)粒最常用做載體的4點(diǎn)要求：點(diǎn)要求：選分子量小的質(zhì)粒，即小載體選分子量小的質(zhì)粒，即小載體11.5kb不易損不易損 壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多也有大載體；壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多也有大載體；一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般一般10 個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒10個(gè)。個(gè)。必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地

27、；必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指不特指 多位多位Ampr。第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的過程基因克隆的過程1、制備目的基因和相關(guān)載體、制備目的基因和相關(guān)載體2、將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接、將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接3、將重組本、將重組本DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞4、DNA重組體的篩選和鑒定重組體的篩選和鑒定5、DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程1.化學(xué)合成法化學(xué)合成法2.要求：目的基因的核苷酸

28、序列或其產(chǎn)物的氨基要求：目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列酸序列 。3.基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)4.cDNA文庫文庫(cDNA library)5.聚合酶鏈反響聚合酶鏈反響(polymerase chain reaction, PCR)一、目的基因序列的來源和別離一、目的基因序列的來源和別離化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由氨基酸序列推測(cè)可能的由氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。序列。人工化學(xué)合成法使用于：人工化學(xué)合成法使用于：組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化

29、菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos L

30、R cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫用隨機(jī)切割的真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫片段構(gòu)建基因文庫 cDNA文庫文庫 將將某一時(shí)間某一種類細(xì)胞某一時(shí)間某一種類細(xì)胞中所有的中所有的cDNA的的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA，將所有重組，將所有重組DNA分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體稱為克隆的混合體稱為cDNA文庫。文庫。mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 c

31、DNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T聚合酶鏈?zhǔn)椒错懢酆厦告準(zhǔn)椒错慞CR TA克隆系統(tǒng)由克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司公司San Diego，CA開展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于開展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。和測(cè)序。 其原理是利用其原理是利用Taq酶能夠在酶能夠在PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3末端末端加上一個(gè)非模板依賴的加上一個(gè)非模板依賴的A，而，而T載體是一種帶有載體是

32、一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)隆位點(diǎn)MCS中中 。二、載體的選擇與制備二、載體的選擇與制備 噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫，pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cDNA文庫和克隆一些較小的DNA片段，M13噬菌體那么用于克隆一些待測(cè)序的DNA片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有適宜的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，那么要選擇適宜的表達(dá)載體。三、重組體的連接三、重組體的連接1 1、粘性末端的連接、粘性末端的連接2

33、2、利用人工接頭連接、利用人工接頭連接3 3、參加同聚物尾連接、參加同聚物尾連接4 4、平端連接、平端連接方式：方式： (1) (1)同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2) (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接配伍末端連接 非配伍末端連接非配伍末端連接1. 粘性末端連接粘性末端連接Bam H切割反響切割反響 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割G

34、CCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)非配伍末端的連接不同限制酶切位點(diǎn)非配伍末端的連接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Ec

35、o R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連限制酶切位點(diǎn)連接相似。接相似。2. 平端連接平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：適用于：目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，

36、在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 由平端加上新的酶切

37、位點(diǎn)，再用限制由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件：受體菌條件：平安宿主菌平安宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection) 四、重組四、重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌將重組體將重組體

38、DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化 指將質(zhì)?；蚱渌庠粗笇①|(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。并使其獲得新的表型的過程。2、感染、感染 以以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增?；蚴删w顆粒，才能感染適當(dāng)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。3、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染 指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而片段而獲得新的表型的過程。獲得

39、新的表型的過程。50-100mmol/LCaCl2 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等五、重組體的篩選五、重組體的篩選1 1、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組DNADNA(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇目目 錄錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷

40、型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成促進(jìn)組氨酸合成DNADNA重組體重組體標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救目目 錄錄假設(shè)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補(bǔ),那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選,這就是標(biāo)志補(bǔ)救. 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測(cè)測(cè)目目 錄錄2、免疫學(xué)方法、免疫學(xué)方法利用特異性抗體檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物利用特異性抗體檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物3 3、核酸雜交法篩選特定、核酸雜交法篩選特定DNADNA雞的雞的肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測(cè)方法肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測(cè)方法目目 錄錄原原位位雜雜交交目目 錄錄Southern印跡印跡目目 錄錄4 4、PCR

41、PCR技術(shù)對(duì)特定技術(shù)對(duì)特定DNADNA進(jìn)行直接鑒定進(jìn)行直接鑒定5 5、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定DNADNA hMLCK重組質(zhì)粒酶切圖譜分析1未酶切質(zhì)粒 2. EcoR酶切 3. Hind 酶切 4EcoR/Hind 雙酶切 5. 250bpDNA Ladder重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)小結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒

42、噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交第四節(jié)第四節(jié) 真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染u磷酸鈣共沉淀法u電穿孔法uDEAE-葡聚糖法u脂質(zhì)體法u顯微注射法1、利用、利用TK-細(xì)胞突變株進(jìn)行篩選細(xì)胞突變株進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞利用抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞利用抗性標(biāo)記篩選TK-細(xì)胞TK+細(xì)胞HAT培養(yǎng)液不能存活能存

43、活A(yù)：氨基蝶呤是核苷酸從頭合成的抑制物，H：次黃嘌呤可以作為補(bǔ)救合成dATP、dCTP 的底物T：胸苷它必需在TK胸苷激酶作用下生成胸苷一磷酸。2、藥物篩選：新霉素抗性基因、藥物篩選：新霉素抗性基因 G418是一種氨基糖苷類抗生素是一種氨基糖苷類抗生素 ,它的結(jié)構(gòu)它的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它干擾和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素細(xì)胞產(chǎn)生毒素 。當(dāng)。當(dāng)neo基因新霉素抗性基因基因新霉素抗性基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后后 , 獲得抗性產(chǎn)物氨基獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)

44、移酶糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有使細(xì)胞獲得抗性而能在含有418的選擇性培養(yǎng)基中生長。的選擇性培養(yǎng)基中生長。第五節(jié)第五節(jié) 利用重組利用重組DNADNA技術(shù)可對(duì)技術(shù)可對(duì) 基因進(jìn)行改造基因進(jìn)行改造基因定點(diǎn)誘變基因定點(diǎn)誘變 指將基因的某一個(gè)或某些位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除的過程,稱為基因定點(diǎn)誘變基因定點(diǎn)誘變. 1、 通過基因定點(diǎn)誘變可以改變蛋白質(zhì)編碼序列的個(gè)別密碼子，可以改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能； 2、 通過改變具有調(diào)控功能的序列，可以確定DNA特定的功能區(qū)域； 3、 構(gòu)建新的載體或嵌合基因。一、帶突變位點(diǎn)的寡核苷酸可介導(dǎo)定點(diǎn)誘變一、帶突變位點(diǎn)的寡核苷酸可介導(dǎo)定點(diǎn)誘變二、二、KunkelKunk

45、el法法三、三、PCRPCR技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點(diǎn)誘變技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點(diǎn)誘變55335533abcd5335變性、退火5533加klenow DNA聚合酶5353加入引物a、d5353353利用基因定點(diǎn)誘變可改變基因工程蛋白的特性利用基因定點(diǎn)誘變可改變基因工程蛋白的特性 自然界的蛋白質(zhì)常具有一定的可塑性，當(dāng)某種蛋白自然界的蛋白質(zhì)常具有一定的可塑性，當(dāng)某種蛋白質(zhì)中的一些氨基酸被改變或刪除后，其理化性質(zhì)發(fā)生了質(zhì)中的一些氨基酸被改變或刪除后，其理化性質(zhì)發(fā)生了改變，但仍能保存其原有生物活性。同時(shí)一些蛋白質(zhì)相改變，但仍能保存其原有生物活性。同時(shí)一些蛋白質(zhì)相互融合后仍保持各自成分的活性?；ト诤虾笕员３?/p>

46、各自成分的活性。因此，通過因此，通過基因突變基因突變而引起而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變是可行的。是可行的。、定點(diǎn)誘變可制備長效胰島素、定點(diǎn)誘變可制備長效胰島素將人胰島素鏈將人胰島素鏈27位的位的Thr改為改為Arg，將鏈羧基端氨基化和將鏈羧基端氨基化和鏈位鏈位Asn改為改為Gly后，后，其胰島素的等電點(diǎn)從其胰島素的等電點(diǎn)從5.4移至移至6.8，在生理，在生理pH條件下結(jié)晶，條件下結(jié)晶，從而延遲吸收其在血漿中的半衰期可延長至從而延遲吸收其在血漿中的半衰期可延長至35.3小時(shí)小時(shí)、定點(diǎn)誘變可制備快速吸收的胰島素、定點(diǎn)誘變可制備快速吸收的胰島素 胰島素在治療糖尿病時(shí)，吸收非常慢

47、，在注射后胰島素在治療糖尿病時(shí)，吸收非常慢，在注射后1.5至至2小時(shí)，小時(shí)，體內(nèi)胰島素還未到達(dá)頂峰，而且在體內(nèi)胰島素還未到達(dá)頂峰，而且在3-5小時(shí)后，其水平仍繼續(xù)上升。小時(shí)后，其水平仍繼續(xù)上升。 決定胰島素在注射部位吸收速度決定于胰島素結(jié)合狀態(tài)。胰決定胰島素在注射部位吸收速度決定于胰島素結(jié)合狀態(tài)。胰島素在體內(nèi)吸收是以單體形式吸收的。而普通的胰島素在中性情況島素在體內(nèi)吸收是以單體形式吸收的。而普通的胰島素在中性情況下多數(shù)是與鋅結(jié)合成六聚體，單體形式非常少。下多數(shù)是與鋅結(jié)合成六聚體，單體形式非常少。 研究發(fā)現(xiàn)多聚體之間形成與其研究發(fā)現(xiàn)多聚體之間形成與其B鏈的鏈的B8、9、12、13、16、23-2

48、8位殘基有關(guān)，因此通過基因突變改變上述位置的氨基酸殘基，位殘基有關(guān)，因此通過基因突變改變上述位置的氨基酸殘基，可減少多聚體形成，提高吸收率?？蓽p少多聚體形成，提高吸收率。3 3、通過基因誘變能增加胰島素與受體的親和力、通過基因誘變能增加胰島素與受體的親和力 通過對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)模型分析，發(fā)現(xiàn)胰島素與受體的結(jié)通過對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)模型分析，發(fā)現(xiàn)胰島素與受體的結(jié)合是有特定空間結(jié)構(gòu)的，因此通過基因誘變，改變一些氨合是有特定空間結(jié)構(gòu)的，因此通過基因誘變，改變一些氨基酸殘基的組成，會(huì)基酸殘基的組成，會(huì)增加其與受體的親和力增加其與受體的親和力。第六節(jié)第六節(jié) 克隆基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)克隆基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一

49、、在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一、在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一、在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因需要一些根本要素一、在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因需要一些根本要素 1、來自真核細(xì)胞目的基因需要改造、來自真核細(xì)胞目的基因需要改造 2、必須選擇用大腸桿菌載體、必須選擇用大腸桿菌載體 3、注意目的基因連接在起始密碼子之后：表達(dá)產(chǎn)物有融合蛋白、注意目的基因連接在起始密碼子之后：表達(dá)產(chǎn)物有融合蛋白 和非融合蛋白兩種和非融合蛋白兩種Nde：CATATG；Nco：CCATGG 4、選擇適當(dāng)?shù)氖荏w菌株和誘導(dǎo)條件、選擇適當(dāng)?shù)氖荏w菌株和誘導(dǎo)條件o1、融合蛋白較穩(wěn)定；o2、如果載體攜帶的一段編碼信號(hào)肽的基因片段，可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物；o、可利用融

50、合蛋白中原核蛋白制備的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化；o、可利用融合蛋白中原核局部與表達(dá)蛋白之間參加的蛋白酶切位點(diǎn)，可切除原核局部。表達(dá)融合蛋白優(yōu)點(diǎn)表達(dá)融合蛋白優(yōu)點(diǎn)：二、提高外源基因表達(dá)水平二、提高外源基因表達(dá)水平1、提高外源基因表達(dá)水平：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)；調(diào)整、提高外源基因表達(dá)水平：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)；調(diào)整SD序列序列 與與ATG之間距離；用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基；增加之間距離；用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基；增加mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性2、將細(xì)菌生長與外源基因的表達(dá)在時(shí)間上分開：減輕、將細(xì)菌生長與外源基因的表達(dá)在時(shí)間上分開：減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷細(xì)胞的代謝負(fù)荷 3、采用不同措施提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性：表達(dá)融合蛋、采

51、用不同措施提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性：表達(dá)融合蛋白；采用某種突變菌株；表達(dá)分泌蛋白；白；采用某種突變菌株；表達(dá)分泌蛋白；二、真核表達(dá)系統(tǒng)二、真核表達(dá)系統(tǒng)利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是： 真核細(xì)胞能夠識(shí)別和除去外源基因中的內(nèi)含子，剪真核細(xì)胞能夠識(shí)別和除去外源基因中的內(nèi)含子，剪接加工形成成熟的接加工形成成熟的mRNAmRNA。 真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白是沒有糖基化的，糖基化對(duì)某些表達(dá)蛋白的免疫蛋白是沒有糖基化的，糖基化對(duì)某些表達(dá)蛋白的免疫原性影響很大。原性影響很大。真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下

52、幾個(gè)問題：真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問題： 選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個(gè)；選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個(gè)； 轉(zhuǎn)化效率低，一般只有轉(zhuǎn)化效率低，一般只有10-610-610-410-4； 外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞染色體外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞染色體DNADNA上帶有一定的自上帶有一定的自發(fā)性和盲目性，整合的拷貝數(shù)和位置都還不能控制；發(fā)性和盲目性，整合的拷貝數(shù)和位置都還不能控制； 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞的挑選要求比較高，手續(xù)繁瑣費(fèi)時(shí)。此細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞的挑選要求比較高，手續(xù)繁瑣費(fèi)時(shí)。此外，細(xì)胞大量培養(yǎng)還有不少問題，而且本錢較高，利用培外，細(xì)胞大量培養(yǎng)還有不少問題，而且本錢較高，利用培養(yǎng)細(xì)胞方式大量

53、生產(chǎn)某些表達(dá)蛋白，從工藝到本錢都要很養(yǎng)細(xì)胞方式大量生產(chǎn)某些表達(dá)蛋白，從工藝到本錢都要很好地考慮。好地考慮。受體菌條件：受體菌條件：平安宿主菌平安宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)四重組四重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡2. 免疫學(xué)方

54、法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等五重組體的篩選五重組體的篩選( (插入失活法插入失活法) ) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇 互補(bǔ)互補(bǔ)利用利用互補(bǔ)原理篩選重組體互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 原位雜交原位雜交 Southern印跡印跡雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法 重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)小結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術(shù)操

55、作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交表達(dá)體系的建立：表達(dá)體系的建立： 表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的別離純化表達(dá)產(chǎn)物的別離純化六克隆基因的表達(dá)六克隆基因的表達(dá) 標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯

56、調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)多接頭克隆位點(diǎn) E.coli表達(dá)體系的缺乏：表達(dá)體系的缺乏：不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 (E.coli表達(dá)體系最為常用表達(dá)體系最為常用)大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌的表達(dá)和分泌 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)

57、物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2.2.真核表達(dá)體系酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)體系酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜表達(dá)載體表達(dá)載體YEpI PT的物理圖譜的物理圖譜第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNA Recombination

58、Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。 疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)典型例子疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)典型例子: 脆性脆性X綜合征綜合征Kallmann綜合征綜合征二、生二、生物制藥物制藥 利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為有望成為212

59、1世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。 美國美國Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重組年首先利用重組DNADNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng)，標(biāo)志著技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng)，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開始。迄今為止，已有生物工程藥物時(shí)代的開始。迄今為止，已有5050多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血

60、液因子VIII促進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化刺激細(xì)胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療導(dǎo)向