Molecularhybridization分子雜交

1、Molecular hybridization （分子雜交） 1.Principle and applicationsMolecular hybridization is based on the feature of denaturation and renaturation of nucleic acidsIt can be used as an approach for qualitative (定性) and quantitative（定量） analysis of DNA or RNA. Hybrid- heterogenous (異源的) Hybridization molecul

2、e Denaturation Hybridization DNA-DNA, DNA-RNA 2. Probe (探針) Notes Probe is a specific DNA or RNA fragment which can bind with the sample DNA or RNA for detection. ATCCGATCG- Source of probe synthesized, cloning genomic DNA or cDNA, as well as RNA. Probe must be labeled(標(biāo)記) before hybridization. radi

3、oactive or32P-dCTP nonradioactive biotin, digoxigenin, fluorescent dye In a single stranded form for hybridization How a DNA probe bind with an unkown sequenceBase pairing indicatesthe gene of interest3. Ways of Molecular Hybridization A. Transfer blotting (轉(zhuǎn)移印跡) Southern blotting Northern blotting

4、Western blotting Eastern blotting? B. Dot blotting & Slot blotting (點印跡, 狹縫印跡) C. In situ hybridization (原位雜交) A. Transfer blotting (轉(zhuǎn)移印跡) Transfer blotting DNA or RNA is transferred and blotted from gel (膠)to membrane （膜）. From gel to membrane Capillary transfer Electrotransfer Gel MembraneSout

5、hern blotting It is first proposed by Dr. Edwin Southern in Edinburgh University in 1975, and term “Southern blotting” is named for him. Major steps: electrophoresis (電泳) transfer blotting （印跡轉(zhuǎn)移） molecular hybridization（分子雜交）DNA 樣品 DNA 探針變性X-ray 片限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移印跡膠 膜兩部分工作兩部分工作標(biāo)記雜交雜交暴光Three kinds o

6、f molecular hybridization Blotting Southern Northern Western Eastern Sample DNA RNA Protein ?Hybridization DNA-DNA RNA-DNA Protein-Protein molecule (Ag-Ab) 免疫印跡 B. Dot/Slot blotting (點印跡/狹縫印跡)Dot/Slot blot hybridization is relatively easy compared with that of transfer blotting. 不經(jīng)電泳不經(jīng)電泳,直接點樣直接點樣The

7、 samples separation are put directly onto the membrane through dot /slot blot apparatus without electrophoresis. The other steps are similar to those of the transfer blotting. Dot blotSlot blot 儀器SampleDot blot-DNA chip (芯片) Development and combination of multiple fields The specific array (陣列)of re

8、lated genes. e.g., Oncogenes (癌基因) Tumor suppressor genes (抑癌基因) thousands,10 thousands of genes onto glass slide or siliconCharacteristics high sensitivity (高靈敏), high through-out(高通量)DNA chip 芯片 Result of analysisDNAs (cDNAs, synthesized oligonucleotides)Fluorescence labeled samples （cDNA）（）基因芯片的基

9、本原理及生物信息學(xué)的作用 基因芯片（gene chip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息。 基因芯片把大量已知序列探針集成在同一個基片上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交,便可根據(jù)堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。 根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。 其中一類是較長的DNA探針（100mer）芯片 這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。 另一類是短的寡核苷酸探針芯片 其探針長度為25 mer左右，一般通過在片（

10、原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。原理原理 - - 通過雜交檢測信息通過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA基因芯片熒光標(biāo)記的樣品 共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析探 針 設(shè) 計雜交（）基因芯片制備 基因芯片的制備主要有兩種基本方法: 一是在片合成法， 在片合成法

11、是基于組合化學(xué)的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。 另一種方法是點樣法。 基因芯片點樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點,并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點。 （）靶基因樣品的制備及芯片雜交 根據(jù)基因芯片的檢測目的不同,可以把樣品制備方法分為 用于表達(dá)譜測量的mRNA樣品制備 用于多態(tài)性(或突變)研究的基因樣品的制備（）雜交信號檢測 對

12、于用熒光素標(biāo)記經(jīng)擴增（也可用其他放大技術(shù)）的序列或樣品，與芯片上的探針進(jìn)行雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。 圖像的采集用落射熒光顯微鏡 或電荷偶聯(lián)裝置照相機 非共聚焦激光掃描儀等進(jìn)行。 、基因芯片對于生物分子信息檢測的作用和意義 在生命科學(xué)領(lǐng)域中，基因芯片為分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究提供了強有力的手段。 利用基因芯片技術(shù)，可研究生命體系中不同部位、不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)，比較不同個體或物種之間的基因表達(dá)，比較正常和疾病狀態(tài)下基因及其表達(dá)的差異。 基因芯片技術(shù)也有助于研究不同層次的多基因協(xié)同作用的生命過程，發(fā)現(xiàn)新的基因功能，研究生物體在進(jìn)化、發(fā)育、遺傳過程中的規(guī)律。C. In situ hyb

13、ridization(原位雜交) nucleic acids of cells and tissue on the slide are detected by specific nucleic acid probes. It supplies the way for analyzing the location and gene expression at cell level. 發(fā)展歷史 熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ Hybridization,FISH)問世于70年代后期,其曾多用于染色 體異常的研究,近年來隨著FISH所應(yīng)用的探針種類的不斷增多,特別是全CO

14、SMID探針及染色體原位抑制雜交技 術(shù)的出現(xiàn),使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面,而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究,如診斷、基因定位等放射性同位素原位雜交技術(shù) 原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點，諸如每次檢驗需重新標(biāo)記 、已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性 、需要較長時間的曝光時間和對環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時，需要較多的分裂相進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤差等。FISH的基本原理 很簡單, 就是標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的DNA(玻片上的標(biāo)本)退火雜交, 通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況. 熒光原位雜交（FI

15、SH） 它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號來判斷結(jié)果。 它可用于標(biāo)記染色體的識別、特異融合基因的檢測、新基因定位，用全染色體涂抹探針識別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)異常。FISH具有其不可比擬的優(yōu)點：1.操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到結(jié)果。3.在同一標(biāo)本上，可同時幾種不同探針。FISH的技術(shù)特點的技術(shù)特點： FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞。間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。 生物素（Biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl f

16、luorene(AAF)均可用于探針標(biāo)記。直接標(biāo)記和間接標(biāo)記 用生物素或地高辛標(biāo)記稱為間接標(biāo)記, 雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號, 因而 步驟較多, 操作麻煩, 其優(yōu)點是在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴大 直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記. 由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號, 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng), 不再需要購買熒光抗 體, 也由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高, 直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標(biāo)本上同時檢測多種異常. 其熒光強度 和信號大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 使FISH過程變得簡

17、便而易于操作. 探針標(biāo)記 在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用Biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于100bp，較小的探針可采用PCR技術(shù)來標(biāo)記。 近年來，VYSIS公司成功的生 產(chǎn)了大片段的DNA探針（100400kb）。由于探針較長，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進(jìn)一步簡化面且雜交信號增強。多色信號采集 常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像， 彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)記探針的應(yīng)用，使用CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲存在計算機內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個復(fù)合的多顏色的圖像。FIS

18、H和G顯帶技術(shù)結(jié)合 對已做過G顯帶的染色體片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨認(rèn)各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近G帶外理過的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。FISH技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合 FISH技術(shù)和RFLP結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形或復(fù)雜片段的性質(zhì)。 FISH和細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以同時用多種顏色反應(yīng)不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個細(xì)胞內(nèi)同時找到基因的位點。轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構(gòu)功能以及表達(dá)產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。多

19、色熒光原位雜交（M-FISH） M-FISH相當(dāng)于在 一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色, 因而很容易就可看到多條染色體間的復(fù)雜易位情況和確定標(biāo)志染 色體的來源. M-FISH是1996年才建立的一種新技術(shù)。使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體上24種特異的熒光色彩以供核型分析。它為人們提供了既豐富又完善的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復(fù)雜的染色體易位 。多色熒光染色體顯帶（Rx-FISH） 能否讓每條區(qū)帶也雜交上不同的顏色呢? 這一想法導(dǎo) 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的誕生. Rx-FISH技術(shù)是采用多種熒光素標(biāo)記與人類D

20、NA有高度同原性猿的DNA作為探針，雜交后使人類的24條染色體上呈現(xiàn)特異的帶型。這樣便可根據(jù)彩色的熒光條帶進(jìn)行核型分析。Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransforme

21、dyeastXWell start by making transformed yeast expressing XFishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorin other words is there a protein Y?To find out we are going to go fishing with the two-hybrid

22、system.We will use X as bait.to try to catch Y.As reference in this description, here is howthe yeast two-hybrid expression system works.(if you are unfamiliar with the yeast two-hybrid system then you should review the slide on this system before going fishing)Fishing with the yeast two-hybrid syst

23、emXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransformedyeastXunknowpredatortissuetotal mRNAreverse transcriptasecDNAyeast plasmid expression vectortrans

24、fectionY?activationdomaintransformedyeastNow well make transformed yeast expressing Y, if Ydoes indeed exist.Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-