二章基因工程及其在食品科學(xué)中的應(yīng)用ppt課件

1、制備目的基因制備目的基因構(gòu)建重組構(gòu)建重組DNA 獲得轉(zhuǎn)化體獲得轉(zhuǎn)化體 挑選出重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆挑選出重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆 篩目的基因在受體生物篩目的基因在受體生物細(xì)胞中高效表達(dá)隆細(xì)胞中高效表達(dá)隆 大鼠生長(zhǎng)激素基因大鼠生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠轉(zhuǎn)入小鼠(2) 限制酶的分類限制酶的分類 根據(jù)酶的性質(zhì)，可將限制酶分為三個(gè)類型根據(jù)酶的性質(zhì)，可將限制酶分為三個(gè)類型: I型型: 三種不同亞基組成；輔助因子為三種不同亞基組成；輔助因子為ATP、Mg2+及及S-腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸 其切割位點(diǎn)距其識(shí)別位點(diǎn)至少其切割位點(diǎn)距其識(shí)別位點(diǎn)至少1000bp；且切割作用是；且切割作用是隨機(jī)的隨機(jī)的 型型: 兩個(gè)一樣亞基組成；

2、輔助因子僅為兩個(gè)一樣亞基組成；輔助因子僅為Mg2+；其識(shí)別位；其識(shí)別位點(diǎn)常具旋轉(zhuǎn)點(diǎn)常具旋轉(zhuǎn) 對(duì)稱性；其切割位點(diǎn)與其識(shí)別位點(diǎn)重疊或在其附近；對(duì)稱性；其切割位點(diǎn)與其識(shí)別位點(diǎn)重疊或在其附近；且切割作且切割作 用特異性強(qiáng)用特異性強(qiáng) 型型: 兩種不同亞基組成；輔助因子為兩種不同亞基組成；輔助因子為ATP和和Mg2+，也受，也受S-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位點(diǎn)普通在距其識(shí)氨酸激活，但并非必需；其切割位點(diǎn)普通在距其識(shí)別位點(diǎn)別位點(diǎn)3端端 2426bp處處 PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 限制性內(nèi)切酶的

3、旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性限制性內(nèi)切酶的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性 需求指出的是，I型和型限制性內(nèi)切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而對(duì)型限制性內(nèi)切核酸酶而言，其只具限制酶活性，與其相應(yīng)的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性內(nèi)切核酸酶及其相應(yīng)的DNA甲基化酶對(duì)DNA有一樣的識(shí)別序列。 (3)型限制性內(nèi)切核酸酶的根本特性 識(shí)別序列與切割位點(diǎn) 型限制性內(nèi)切核酸酶可識(shí)別長(zhǎng)度為47bp的雙鏈DNA特定序列，該識(shí)別序列(識(shí)別位點(diǎn))常呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性 切割方式 平齊末端 、5磷酸端25個(gè)核苷酸突出單鏈黏性末端 、3-羥基端25個(gè)核苷酸突出單鏈黏性末端 5 33 5 5 33 55突出突出3突出突出 平端平端5 33 5型限制性內(nèi)切

4、核酸酶切割方式型限制性內(nèi)切核酸酶切割方式 同裂酶與同尾酶同裂酶與同尾酶isoschizomer ：在：在型限制性內(nèi)切核酸酶中，來源不同而識(shí)別型限制性內(nèi)切核酸酶中，來源不同而識(shí)別序列和切割方式均一樣者序列和切割方式均一樣者 如：如：Hpa和和Msp I兩者的識(shí)別序列都是兩者的識(shí)別序列都是CCGG，切割方式，切割方式也一樣，因此二者為同裂酶也一樣，因此二者為同裂酶 isocaudamer ：來源及識(shí)別序列不同，但：來源及識(shí)別序列不同，但DNA經(jīng)其切割后能構(gòu)經(jīng)其切割后能構(gòu)成一樣黏性末端者成一樣黏性末端者 如：如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及及Xho切割切割DNA后都

5、構(gòu)成一樣的后都構(gòu)成一樣的GATC四核苷酸突出單鏈黏性末端，因此四核苷酸突出單鏈黏性末端，因此其為一組同尾酶其為一組同尾酶 需求指出的是，由同尾酶切割需求指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以所得到的黏性末端可以彼此銜接起來，但是不能重新切開，即原來同尾酶的識(shí)別序列彼此銜接起來，但是不能重新切開，即原來同尾酶的識(shí)別序列都已不再存在。都已不再存在。 假設(shè)構(gòu)成某DNA分子的堿基對(duì)總數(shù)目(B)及某限制酶識(shí)別位點(diǎn)核苷酸序列均為知，那么該限制酶在該DNA分子上的實(shí)際切割位點(diǎn)數(shù)目(N)為： N=BF 假定在某DNA分子中四種核苷酸殘基數(shù)量相等，那么識(shí)別序列為四個(gè)堿基對(duì)的限制酶在該DNA分子中切割位

6、點(diǎn)出現(xiàn)頻率為(14)4，即1256，也即平均256個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)1個(gè)切割位點(diǎn)。 同樣，識(shí)別序列為六個(gè)堿基對(duì)的限制酶在該DNA分子中切割位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為(14)6，即14096，也即平均4096個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)1個(gè)切割位點(diǎn)。 需求指出的是：實(shí)踐情況與實(shí)際不相符 (4) 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的主要要素及優(yōu)化戰(zhàn)略 底物DNA制備物的純度：蛋白質(zhì)、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會(huì)抑制限制酶的活性。 底物DNA的甲基化程度：大腸桿菌的絕大多數(shù)菌株含有兩種DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底物DNA的構(gòu)造構(gòu)型：環(huán)狀雙螺旋DNA較線性DNA穩(wěn)定。因此，在用限制

7、性酶酶解同樣分子量的DNA時(shí)，環(huán)狀雙螺旋DNA所需酶量為線性DNA的1020倍。 酶反響緩沖液的組成： 酶反響的最適溫度： 為了提高限制酶對(duì)底物為了提高限制酶對(duì)底物DNA低純度制備物的反響效率，普通低純度制備物的反響效率，普通采用如下方法：采用如下方法：a 添加限制酶的用量添加限制酶的用量(平均每平均每g底物底物DNA可用可用10IU甚至更多甚至更多些些)；b 延伸酶催化反響的保溫時(shí)間，使酶解更完全；延伸酶催化反響的保溫時(shí)間，使酶解更完全；c 擴(kuò)展酶催化反響的體積，使?jié)撛诘囊种埔乇幌♂專詼p擴(kuò)展酶催化反響的體積，使?jié)撛诘囊种埔乇幌♂專詼p弱其抑制造用；弱其抑制造用；d 在反響液中參與適量亞

8、精胺在反響液中參與適量亞精胺(普通運(yùn)用濃度為普通運(yùn)用濃度為12.5mmolL)，以利限制酶對(duì)基因組，以利限制酶對(duì)基因組DNA的酶解作用。的酶解作用。(5) 限制性內(nèi)切核酸酶酶解反響的操作步驟及留意要點(diǎn)限制性內(nèi)切核酸酶酶解反響的操作步驟及留意要點(diǎn) (二二) DNA聚合酶聚合酶 最常用的依賴于最常用的依賴于DNA的的DNA聚合酶有大腸桿菌聚合酶有大腸桿菌DNA聚聚合酶合酶I(全酶全酶)、大腸桿菌、大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(Klenow片段片段)、T4噬菌體編碼的噬菌體編碼的DNA聚合酶、耐熱的聚合酶、耐熱的DNA聚合酶聚合酶(TaqDNA聚合酶聚合酶)等等 依賴于依賴于RNA的的D