第4章DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)

1、DNA的復(fù)制、的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)突變、損傷和修復(fù)第第4章章第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)本章內(nèi)容 第一節(jié) DNA復(fù)制 第二節(jié) 基因突變 第三節(jié) DNA的修復(fù)系統(tǒng) 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第一節(jié)第一節(jié) DNA復(fù)制復(fù)制一、DNA復(fù)制的一般特征二、原核生物DNA的復(fù)制三、真核生物DNA的復(fù)制四、線粒體DNA的復(fù)制五、噬菌體和病毒的DNA的復(fù)制六、DNA復(fù)制忠實(shí)性的保證機(jī)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)由于DNA是遺傳信息的載體，所以生命的遺傳實(shí)際上就是染色體DNA的自我復(fù)制。而染色體DNA的自我復(fù)制主要是通過半保留復(fù)制來實(shí)現(xiàn)的，是一個(gè)以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過

2、程。 一、一、DNA復(fù)制的一般特征復(fù)制的一般特征1 DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制的復(fù)制是半保留復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)就對(duì)DNA的復(fù)制過程進(jìn)行了探討。 全保留復(fù)制？全保留復(fù)制？半保留復(fù)制？半保留復(fù)制？分散復(fù)制分散復(fù)制 ?第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)Which one is correct ?分散復(fù)制分散復(fù)制 ?全保留復(fù)制？全保留復(fù)制？半保留復(fù)制？半保留復(fù)制？第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)Watson和Crick推測(cè)，DNA在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋并被分開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。這

3、樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來DNA分子的堿基順序完全一樣。因此，每個(gè)子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)1958年，Meselson 和 Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記3個(gè)世代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA的半保留復(fù)制。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌長期在以15N作氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到15N-DNA。用 含1

4、4N的氮源培養(yǎng)15N標(biāo)記的大腸桿菌，一代后所有DNA的密度都在14N-DNA和15N-DNA之間。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)兩代后出現(xiàn)等量的14N分子和15N-14N雜合分子。 若再繼續(xù)培養(yǎng)，可以看到14N-DNA分子增多，說明DNA分子在復(fù)制時(shí)均可被分成兩個(gè)亞單位，分別構(gòu)成子代分子的一半，這些亞單位經(jīng)過許多代復(fù)制仍然保持著完整性。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，原核生物和真核生物的DNA都是以半保留復(fù)制方式半保留復(fù)制方式遺傳的。半保留復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性代謝上的穩(wěn)定性，經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA多核苷酸鏈仍可完整地存在于后代而不被分解，這種穩(wěn)定性與DNA的遺傳

5、功能相符。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)2 復(fù)制的起點(diǎn)復(fù)制的起點(diǎn)復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進(jìn)行。這個(gè)復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉復(fù)制叉(replication fork)。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，DNA的復(fù)制有一個(gè)固定的起點(diǎn)。DNA復(fù)制時(shí)每次復(fù)制的DNA片段稱為一個(gè)復(fù)制單位復(fù)制單位，又叫復(fù)制子復(fù)制子(replicon)。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，但不一定有復(fù)制終點(diǎn)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)通常，細(xì)菌、病毒和線粒體的DNA分子只含有一個(gè)復(fù)制子，真核生物基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，即基因組包含有多個(gè)復(fù)制子。 第4章 DNA的復(fù)

6、制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)許多生物復(fù)制起點(diǎn)的DNA序列已經(jīng)被鑒定并測(cè)定，他們比較保守，含有較多的反向反向重復(fù)序列重復(fù)序列和短的成簇的保守序列短的成簇的保守序列,可以和蛋白質(zhì)結(jié)合。大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)處的重復(fù)保守序列大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)處的重復(fù)保守序列第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，無論是原核生物還是真核生物，DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速復(fù)制方式雙向等速復(fù)制方式進(jìn)行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定序列為起點(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長前進(jìn)。3 復(fù)制的方向復(fù)制的方向第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA的雙的雙向復(fù)制向復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)其

7、他不同的形式復(fù)制其他不同的形式復(fù)制等速復(fù)制，等速復(fù)制，不等速復(fù)制不等速復(fù)制單向復(fù)制，單向復(fù)制，雙向復(fù)制雙向復(fù)制多起點(diǎn)復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制，單起點(diǎn)復(fù)制單起點(diǎn)復(fù)制直線雙向單起點(diǎn)直線雙向單起點(diǎn)直線雙向多起點(diǎn)直線雙向多起點(diǎn)眼型復(fù)制眼型復(fù)制滾動(dòng)環(huán)復(fù)制滾動(dòng)環(huán)復(fù)制D- 環(huán)環(huán) 復(fù)制復(fù)制2D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)單一起點(diǎn)的單向復(fù)制單一起點(diǎn)的單向復(fù)制(如腺病毒)單一起點(diǎn)的雙向復(fù)制單一起點(diǎn)的雙向復(fù)制(如T7噬菌體) 多個(gè)起始點(diǎn)的雙向復(fù)制多個(gè)起始點(diǎn)的雙向復(fù)制（如染色體）多個(gè)起始點(diǎn)的單向復(fù)制多個(gè)起始點(diǎn)的單向復(fù)制線性線性DNA雙鏈的復(fù)制雙鏈的復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)雙向復(fù)制雙向復(fù)制第

8、4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)型復(fù)型復(fù)制制 大腸桿菌基因組的復(fù)制形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌環(huán)形DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的復(fù)制眼（泡）結(jié)構(gòu), 單一起點(diǎn)，雙向復(fù)制，第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)型復(fù)制滾環(huán)型復(fù)制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA：如噬菌體X174DNA雙鏈雙鏈DNA：噬菌體復(fù)制的后期、非洲爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞中rRNA基因的擴(kuò)增等。是一種單向復(fù)制的特殊形式。某些單鏈環(huán)狀DNA和雙鏈DNA均可以采用這種方式復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)噬菌體X174DNA的復(fù)制過程：（1）首先形成共價(jià)閉環(huán)的雙鏈分子

9、(復(fù)制型)；（2）正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個(gè)3OH末端，A蛋白連在5-磷酸基末端；（3）在DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負(fù)鏈為模板，從正鏈的3-OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動(dòng)而合成出新的正鏈。（4）合成一圈后，露出切口序列，A蛋白再次將其切開，并連在切出的5-磷酸基末端，游離出單位長度噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)型復(fù)制滾環(huán)型復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)D-環(huán)型復(fù)制環(huán)型復(fù)制這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體

10、DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)(纖毛蟲的線粒體DNA為線性分子，其復(fù)制方式與此不同)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)(即D-環(huán))。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)D-環(huán)型復(fù)制環(huán)型復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)原來，一條鏈復(fù)制到一定程度后，另一鏈的復(fù)制起點(diǎn)才暴露出來，另一條鏈才能開始復(fù)制。這說明DNA兩條鏈的起點(diǎn)并不總在同一點(diǎn)上，當(dāng)兩條鏈的起點(diǎn)分開一定距離時(shí)就產(chǎn)生D-環(huán)復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)葉綠體DNA的復(fù)制也采取D-環(huán)的方式，雙鏈環(huán)兩條鏈的起點(diǎn)不在同一位置，但同時(shí)在起點(diǎn)處解開雙鏈，進(jìn)行D-環(huán)復(fù)制

11、，故稱為2D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)枯草桿菌(Bacillus subtilis)染色體DNA的復(fù)制雖是雙向的，但是兩個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)的距離不同。一個(gè)復(fù)制叉僅在染色體上移動(dòng)五分之一距離，然后停下采等待另一復(fù)制叉完成五分之四距離。雙向不對(duì)稱復(fù)制雙向不對(duì)稱復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)質(zhì)粒R6K兩個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)也是不對(duì)稱的，第1個(gè)復(fù)制叉到達(dá)1/5距離即停下，從反方向開始形成第2個(gè)復(fù)制叉并完成其余部分的復(fù)制。質(zhì)粒ColEI的復(fù)制完全是單向的，復(fù)制叉只向一個(gè)方向移動(dòng)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4 復(fù)制的速度復(fù)制的速度利用放射自顯影的方法測(cè)定，細(xì)菌DNA的復(fù)制叉移動(dòng)

12、速度大約每分鐘50000bp。大腸桿菌染色體完成復(fù)制需要40min。但是在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌每20min即可分裂一次。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制叉前進(jìn)的速度是比較恒定的，復(fù)制速度實(shí)際取決于起始頻率。在豐富培養(yǎng)基中，大腸桿菌染色體一輪復(fù)制尚未完成，起點(diǎn)已開始第二輪的復(fù)制，因此一個(gè)染色體可以不只2個(gè)生長點(diǎn)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核生物染色體DNA的復(fù)制叉移動(dòng)速度比原核生物慢得多，這是由于染色體具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，復(fù)制時(shí)需解開核小體，復(fù)制后又需重新形成核小體。它們的復(fù)制叉移動(dòng)速度大約為1 000-3000bpmin。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)高等真核生物一般復(fù)制

13、單位長度是100-200kb，低等真核生物要小一些，每一復(fù)制單位在30-60min內(nèi)復(fù)制完畢。由于各復(fù)制子發(fā)動(dòng)復(fù)制的時(shí)間有先后，一個(gè)細(xì)胞通常完成染色體復(fù)制的時(shí)間要用6-8 h。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)5 復(fù)制的終點(diǎn)復(fù)制的終點(diǎn)環(huán)狀環(huán)狀DNA復(fù)制的終點(diǎn)復(fù)制的終點(diǎn)例如大腸桿菌，具有特殊的終止序列和終止蛋白的協(xié)助而終止復(fù)制；噬菌體則只是通過復(fù)制叉的相遇碰撞而終止復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)線形線形DNA的末端復(fù)制問題的末端復(fù)制問題高等生物的染色體是利用端粒酶來解決末端復(fù)制問題；T7噬菌體則是利用形成串聯(lián)體的方式解決。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)6 復(fù)制所需的主要酶和蛋白復(fù)制

14、所需的主要酶和蛋白DNA 聚合酶聚合酶 DNA 連接酶連接酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 解旋酶解旋酶引物合成酶引物合成酶 SSB蛋白蛋白第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA 聚合酶聚合酶1956 年最早從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)。目前發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中至少有5種DNA聚合酶，真核細(xì)胞中更多。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶催化的反應(yīng)聚合酶催化的反應(yīng)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶聚合酶催化的反應(yīng)催化的反應(yīng)*第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶的基本特點(diǎn)：聚合酶的基本特點(diǎn)：要有DNA為模板才能合成新的DNA；需要Mg2+為輔助離子.以dNTP 為原料合成與模板DNA序列完

15、全一致的DNA, 焦磷酸PPi 釋放出來.合成新的DNA鏈的方向是從5 到3,模板鏈要求是從3到5。不能從頭合成DNA，dNTP 只能加到已有核苷酸的3-OH上。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶III是一個(gè)復(fù)合物是一個(gè)復(fù)合物第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)引物合成酶引物合成酶由于DNA聚合酶合成DNA時(shí)必須有引物存在，引物合成酶就負(fù)責(zé)合成引物。在體內(nèi)引物合成酶合成的引物是一段RNA。原核和真核細(xì)胞內(nèi)的引物合成酶是由不同的蛋白質(zhì)擔(dān)任的。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA 連接酶連接酶第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶

16、拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA復(fù)制過程中負(fù)責(zé)DNA構(gòu)象的變化，與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開雙鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶II：A2B2，向DNA中引入負(fù)超螺旋，主要與復(fù)制有關(guān)，又叫旋轉(zhuǎn)酶。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)2種不同的拓?fù)洚悩?gòu)酶種不同的拓?fù)洚悩?gòu)酶第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA解鏈酶解鏈酶 (DNA helicase) 解鏈酶（helicase）：利用ATP，水解雙鏈堿基之間的氫鍵，打開雙鏈，每解開一對(duì)堿基需要2 ATP。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA解鏈酶解鏈酶 (DNA helicase) DNA的解鏈過程，首先在拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用下解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)

17、處解開雙鏈。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(SSB蛋白蛋白) SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以SSB蛋白只起保持單鏈的作用。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)7 半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制由于DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此在?fù)制叉附近解開的DNA鏈一條是53方向，另一條是3-5方向，兩個(gè)模板極性不同。所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5-3而不是3-5，那么如何解釋DNA的兩條鏈能夠同時(shí)進(jìn)行復(fù)制的呢？第4章 DNA的復(fù)制突變損

18、傷和修復(fù)日本學(xué)者岡崎日本學(xué)者岡崎(Okazaki)等提出了等提出了DNA的半不連的半不連續(xù)復(fù)制續(xù)復(fù)制(semidiscontinuous replication)模型。模型。 他用3H-脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標(biāo)記的、被后人稱為岡崎片段的小片斷DNA。延長標(biāo)記時(shí)間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復(fù)制過程的中間產(chǎn)物。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)用DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段累積，說明DNA復(fù)制過程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA。 第4

19、章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)進(jìn)一步的試驗(yàn)證明，不連續(xù)的DNA合成只發(fā)生在一條鏈上（滯后鏈，lagging strand）。另一條鏈的復(fù)制是連續(xù)的（前導(dǎo)鏈,leading strand）。進(jìn)一步研究還證明，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為DNA的半不連的半不連續(xù)復(fù)制。續(xù)復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)一般來說，大腸桿菌中的岡崎片段長度為10002000bp，相當(dāng)于一個(gè)基因的大?。徽婧松锏膶槠未笮?00200bp，相當(dāng)于一個(gè)核小體DNA的大小。事實(shí)上，前導(dǎo)鏈的復(fù)制也不是完全

20、連續(xù)的，許多因素如模板鏈的損傷，復(fù)制因子和底物的供應(yīng)不足等，都會(huì)導(dǎo)致前導(dǎo)鏈復(fù)制中斷并重新從另一點(diǎn)開始DNA的復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(1) 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶二、原核生物二、原核生物DNA的復(fù)制的復(fù)制1956 年最早由Arthur Kornberg 在E. coli 中發(fā)現(xiàn)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌中至少有大腸桿菌中至少有5種不同的種不同的DNA聚合酶聚合酶第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶I由1條多肽鏈組成，主要負(fù)責(zé)引物的去除和空隙的填補(bǔ)，在DNA的損傷修復(fù)中也起到重要的作用。每個(gè)細(xì)胞的分子數(shù)為400左右。DNA聚合酶II由7

21、個(gè)亞基組成，也與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)，每個(gè)細(xì)胞的分子數(shù)為100左右。DNA聚合酶IV和V也與DNA的修復(fù)有關(guān)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶III是DNA復(fù)制過程中的主要酶，負(fù)責(zé)催化鏈的延長。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶III是DNA復(fù)制酶的主要原因：(1) 催化效率高，細(xì)胞內(nèi)存在的分子數(shù)少；(2) 大腸桿菌的這個(gè)酶突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而聚合酶I和II突變細(xì)胞不會(huì)死亡；(3) 持續(xù)合成DNA的能力強(qiáng)。(4) 其他結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶是以二聚體的形式發(fā)揮作用的第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶的亞基很容易解離，在

22、分離酶的過程中常常得到不同的組分，對(duì)每一組分的作用不十分的了解。所以要區(qū)分酶的組成和輔助因子不太容易。 現(xiàn)認(rèn)為DNA聚合酶的全酶(holoenzyme)由 等10種亞基所組成，含有鋅原子。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為132000，具有5到3方向合成DNA的催化活性。 亞基具有3到5核酸外切酶活性，起校對(duì)作用，可提高聚合酶復(fù)制DNA的保真性。 三種亞基組成全酶的核心酶(core enzyme)。亞基可能起組建的作用。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶為異二聚體，它使DNA解開的雙鏈可以同時(shí)進(jìn)行復(fù)制.但二聚化的兩個(gè)聚合酶亞基種類并不完全相同，在這里亞基起著

23、促使核心酶二聚化的作用。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)亞基的功能猶如夾子、兩個(gè)亞基夾住DNA分子并可向前滑動(dòng)使聚合酶在完成復(fù)制前不再脫離DNA，從而提高了酶的持續(xù)合成能力。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)亞基是一種依賴DNA的ATP酶，兩個(gè)亞基與另4個(gè)亞基(2 )構(gòu)成復(fù)合物.主要功能是幫助亞基夾住DNA，故稱夾子裝置器。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)各亞基的功能相互協(xié)調(diào),DNA聚合酶的復(fù)雜亞基結(jié)構(gòu)使其具有更高的忠實(shí)性(fidelity)、協(xié)同性(cooperativity)和持續(xù)性(processivity)。如無校對(duì)功能，DNA聚合酶的核苷酸摻人錯(cuò)誤率為7X106，具有核對(duì)功能

24、后降低至5X 109。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)組成組成DNA聚合酶聚合酶III的各亞基特點(diǎn)和功能的各亞基特點(diǎn)和功能第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝1第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝2第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶聚合酶III的組裝的組裝3第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶引起的缺刻轉(zhuǎn)移聚合酶引起的缺刻轉(zhuǎn)移1第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶引起的缺刻轉(zhuǎn)移聚合酶引起的缺刻轉(zhuǎn)移2第4章 DNA的復(fù)制突變損傷

25、和修復(fù)DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶的校對(duì)功能1第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶的校對(duì)功能2第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶的校對(duì)功能3 *第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(2) 大腸桿菌的復(fù)制起始大腸桿菌的復(fù)制起始大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)叫做oriC,長度為245bp，其序列特征和控制元件在大腸桿菌中十分保守。關(guān)鍵在于2組短的重復(fù)序列：3個(gè)13bp和4個(gè)9 bp的序列。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4個(gè)9bp的重復(fù)序列是與DnaA蛋白結(jié)合的地方，大約2040個(gè)DnaA蛋白結(jié)合在此，聚集在一起，DNA纏繞其上，形成起始復(fù)合物。HU蛋白是

26、細(xì)胞內(nèi)的類組蛋白，與DNA結(jié)合，使DNA鏈彎曲。導(dǎo)致附近的3個(gè)富含AT的13bp序列變性，稱為開鏈復(fù)開鏈復(fù)合物。合物。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)解旋酶DnaB六聚體在DnaC協(xié)助下，結(jié)合在解鏈區(qū)， DnaB借助ATP能量，沿著鏈的5向3方向移動(dòng)，解開DNA的雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物前引發(fā)復(fù)合物(prepriming complex)此外，還需要DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶II）和單鏈結(jié)合蛋白SSB。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌復(fù)大腸桿菌復(fù)制起始模型制起始模型4個(gè)個(gè)9bp的重復(fù)序的重復(fù)序列是與列是與DnaA蛋白蛋白結(jié)合的地方結(jié)合的地方第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)導(dǎo)致附近的導(dǎo)

27、致附近的3個(gè)富含個(gè)富含AT的的13bp序列變性，序列變性，稱為開鏈復(fù)合物稱為開鏈復(fù)合物HU蛋白是細(xì)胞內(nèi)的蛋白是細(xì)胞內(nèi)的類組蛋白，與類組蛋白，與DNA結(jié)結(jié)合，使合，使DNA鏈彎曲。鏈彎曲。解旋酶解旋酶DnaB六聚體在六聚體在DnaC協(xié)助下，結(jié)合在解鏈區(qū)協(xié)助下，結(jié)合在解鏈區(qū)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌復(fù)制起始需要的蛋白質(zhì)大腸桿菌復(fù)制起始需要的蛋白質(zhì)DnaA, DnaB,DnaC,HU,Primase,SSB,RNA polymerase, DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II，Dam甲基化酶甲基化酶第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌上與復(fù)制有關(guān)的位點(diǎn)大腸桿菌上與復(fù)制有關(guān)的位點(diǎn)第4章

28、 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌復(fù)制叉上的蛋白質(zhì)大腸桿菌復(fù)制叉上的蛋白質(zhì)*第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(3) 大腸桿菌的復(fù)制過程大腸桿菌的復(fù)制過程當(dāng)引物合成酶在適當(dāng)位置合成出RNA引物后，兩個(gè)亞基(夾子)即在復(fù)合物幫助下將引物與模板的雙鏈夾住。亞基的二聚體形成一個(gè)環(huán)，套在雙鏈分子上，并可在其上滑動(dòng)。 將夾子安裝在引物與模板雙鏈上需要能量，亞基具有ATP酶活性，可分解ATP以提供能量。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)夾子的功能在于將DNA聚合酶III的核心酶束縛在DNA模板上，使其持續(xù)合成DNA。它與復(fù)合物的亞基以及核心酶的亞基都有高的親和力，二者的結(jié)合位點(diǎn)也相同。第4章 DNA的

29、復(fù)制突變損傷和修復(fù)但隨著夾子狀態(tài)的改變，親和力大小也發(fā)生改變。當(dāng)夾子在溶液中時(shí)，它趨向于和復(fù)合物結(jié)合；及至在復(fù)合物幫助下夾住引物與模板雙鏈，它發(fā)生構(gòu)象變化從而使其轉(zhuǎn)移到核心酶上；一旦岡崎片段合成結(jié)束，它又轉(zhuǎn)移回復(fù)合物，并在其幫助下脫落。如此使夾子得以反復(fù)循環(huán)使用（夾子循環(huán)）。（夾子循環(huán)）。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DnaB有兩個(gè)功能，一是解螺旋酶，以解開DNA的雙螺旋；另一是活化引物合成酶，促使其合成RNA引物。由DnaB解螺旋酶和DnaG引物合成酶構(gòu)成了復(fù)制體的一個(gè)基本功能單位，稱為引發(fā)體(primosome)。 在某些噬菌體DNA的復(fù)制過程中，引發(fā)體還包括一些輔助蛋白質(zhì)，例如X1

30、74，它含有6個(gè)前引發(fā)蛋白 。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)引發(fā)體能依賴ATP沿復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)方向在DNA鏈上移動(dòng)，并合成岡崎片段的RNA引物。引物的合成方向與復(fù)制叉前進(jìn)的方向正好相反。 DNA聚合酶III在模板鏈上合成岡崎片段，遇到上一個(gè)岡崎片時(shí)即停止合成，亞基離開DNA鏈。可能正是此停頓成為合成RNA引物的信號(hào)，由引物合成酶沿反方向合成引物，并被夾子帶到核心酶上，開始又一個(gè)岡崎片段的合成。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制的引發(fā)復(fù)制的引發(fā)1第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制的引發(fā)復(fù)制的引發(fā)2第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制的引發(fā)復(fù)制的引發(fā)3第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)

31、制的引發(fā)復(fù)制的引發(fā)4第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA復(fù)制過程中一個(gè)重要的問題就是兩條鏈的協(xié)調(diào)問題：如何使用同一個(gè)酶來合成2條走向相反的DNA鏈？ANIMATION兩條鏈兩條鏈的協(xié)調(diào)的協(xié)調(diào)*第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制過程復(fù)制過程1第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制過程復(fù)制過程2第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制過程復(fù)制過程3第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制過程復(fù)制過程4第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制過程復(fù)制過程5第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滯后鏈的復(fù)制滯后鏈的復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滯后鏈的復(fù)制滯后鏈的復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷

32、和修復(fù)滯后鏈最后一步，DNA聚合酶I將RNA引物除去，空隙填補(bǔ)。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉向前推移，最后在終止區(qū)(terminus region)相遇并停止復(fù)制，該區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)位點(diǎn)。大腸桿菌有6個(gè)終止子位點(diǎn)，分別稱為terA-terF。 與ter位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)稱為Tus(terminus utilization substance)。 (4) 大腸桿菌的復(fù)制的終止大腸桿菌的復(fù)制的終止第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制終止蛋白復(fù)制終止蛋白tus第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)Tus

33、-ter復(fù)合物只能夠阻止一個(gè)方向的復(fù)制叉前移，即不讓對(duì)側(cè)復(fù)制叉超過中點(diǎn)后過量復(fù)制。 在正常情況下，兩個(gè)復(fù)制叉前移的速度是相等的，到達(dá)終止區(qū)后就都停止復(fù)制。然而如果其中一個(gè)復(fù)制叉前移受阻，另一個(gè)復(fù)制叉復(fù)制過半后，就受到對(duì)側(cè)tus-ter復(fù)合物的阻擋，以便等待前一復(fù)制叉的會(huì)合。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌上有若干與復(fù)制終止有關(guān)的序列大腸桿菌上有若干與復(fù)制終止有關(guān)的序列第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)兩個(gè)復(fù)制叉在終止區(qū)相遇而停止復(fù)制，復(fù)制體解體，其間大約仍有50-100 bp未被復(fù)制。其后兩條親代鏈解開，通過修復(fù)方式填補(bǔ)空缺。 此時(shí)兩環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體(catenane

34、)。此連鎖體在細(xì)胞分裂前必須解開，否則將導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗，細(xì)胞可能因此死亡。大腸桿菌分開連鎖環(huán)需要拓?fù)洚悩?gòu)酶(屬于類型拓?fù)洚悩?gòu)酶)參與作用。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)拓?fù)洚悩?gòu)酶II在復(fù)制后將大腸桿菌的2個(gè)子代細(xì)胞分開第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)該酶兩個(gè)亞基分別由基因parC和parE編碼。每次作用可以使DNA兩鏈斷開和再連接，因而使兩個(gè)連鎖的閉環(huán)雙鏈DNA彼此解開。其他環(huán)狀染色體，包括某些真核生物病毒，其復(fù)制的終止相可能以類似的方式進(jìn)行。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)大腸桿菌復(fù)制大腸桿菌復(fù)制的終止的終止第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DN

35、A的復(fù)制1 2 3 DNA的雙向復(fù)制*大腸桿菌DNA的復(fù)制*第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4.1.3 真核生物真核生物DNA的復(fù)制的復(fù)制(1) 真核細(xì)胞的真核細(xì)胞的DNA聚合酶聚合酶目前至少在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)9種DNA聚合酶，分別在DNA復(fù)制（染色體或線粒體復(fù)制）和DNA修復(fù)中起作用。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)3種核種核DNA聚合酶的功能不同（聚合酶的功能不同（From GeneVIII）：）： DNA聚合酶聚合酶起始新鏈的合成（引物合成酶）起始新鏈的合成（引物合成酶） DNA聚合酶聚合酶合成前導(dǎo)鏈。合成前導(dǎo)鏈。 D

36、NA聚合酶聚合酶可能合成滯后鏈及其他功能可能合成滯后鏈及其他功能第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核細(xì)胞幾種真核細(xì)胞幾種DNA聚合酶性質(zhì)比聚合酶性質(zhì)比較較第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶為多亞基酶，無校正功能，它的功能只是合成引物，但它在合成一小段RNA鏈后還可聚合45個(gè)寡聚脫氧核糖核苷酸。 DNA聚合酶既有持續(xù)合成DNA鏈的能力，又有校正功能，由它完成DNA復(fù)制。推測(cè)在復(fù)制叉上有一個(gè)DNA聚合酶，以合成引物；兩個(gè)DNA聚合酶，分別合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶與一種稱為增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear

37、antigen，PCNA)的復(fù)制因子相結(jié)合，該因子相對(duì)分子質(zhì)量為29 000。PCNA相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶的亞基，它能形成環(huán)狀?yuàn)A子，極大增加聚合酶的持續(xù)合成能力。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶可能負(fù)責(zé)合成滯后鏈。同時(shí)是一種修復(fù)酶，參與DNA的修補(bǔ)合成，RNA引物被RNaseH和MF-1核酸酶水解，然后由DNA聚合酶填補(bǔ)缺口，DNA連接酶I將岡崎片段相連接。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)DNA聚合酶是修復(fù)酶。DNA聚合酶是線粒體的DNA合成酶。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)在真核生物的DNA復(fù)制中，另有兩個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物參與作用。RP-A是真核生物的單鏈DNA結(jié)合蛋

38、白，相當(dāng)于大腸桿菌的SSB蛋白。RF-C是夾子裝置器，相當(dāng)于大腸桿菌的復(fù)合物，幫助PCNA因子安裝到雙鏈上以及拆下來，它還促進(jìn)復(fù)制體的裝配。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)原核核真核復(fù)制體的比較原核核真核復(fù)制體的比較第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù) (1) 真核生物的DNA合成酶有的沒有3到 5的外切酶活性，錯(cuò)配堿基的矯正由其他蛋白完成(2)真核生物中 DNA聚合酶相當(dāng)與原核生物中的DNA聚合酶III。(3)真核生物中 DNA聚合酶具有RNA 引物合成的功能。(4)真核生物中 DNA復(fù)制由聚合酶/ /共同完成。 與原核生物的與原核生物的DNA聚合酶相比：聚合酶相比：第4章 DNA的復(fù)制突變

39、損傷和修復(fù) 真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。酵母的復(fù)制起點(diǎn)已被克隆。它們稱為自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequence，ARS)，或復(fù)制基因(replicator)。酵母的ARS元件大約為150bp，含有幾個(gè)基本的保守序列。(2) 真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制的特點(diǎn)真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)單倍體酵母有17個(gè)染色體，基因組約有400個(gè)復(fù)制基因。有一由6個(gè)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，相對(duì)分子質(zhì)量約為400 000，可結(jié)合其上，稱為起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物(origin recognition complex

40、，ORC), 它的結(jié)合要求ATP。一些蛋白質(zhì)與ORC作用，并調(diào)節(jié)其功能，從而影響著細(xì)胞周期。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)酵母的復(fù)制酵母的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)起點(diǎn)結(jié)構(gòu)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核細(xì)胞復(fù)制是多復(fù)制子復(fù)制真核細(xì)胞復(fù)制是多復(fù)制子復(fù)制真核細(xì)胞染色體的復(fù)制是多起點(diǎn)的雙向復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)哺乳動(dòng)物的復(fù)制子大多在100-200 kb之間。人的細(xì)胞有23對(duì)染色體，單倍體基因組大約有3x109bp，平均每個(gè)染色體有1 000個(gè)復(fù)制子。果蠅或酵母的復(fù)制子比較小，平均為40kb。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)基因組比原核生物大，然而真核生物染色體DNA上有許多復(fù)制起點(diǎn)

41、，它們可以分段進(jìn)行復(fù)制。例如，細(xì)菌DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度為50000bpmin，哺乳類動(dòng)物復(fù)制又移動(dòng)速度實(shí)際僅1 000-3 000bpmin，相差約2050倍，然而哺乳類動(dòng)物的復(fù)制子只有細(xì)菌的幾十分之一，所以從每個(gè)復(fù)制單位而言，復(fù)制所需時(shí)間在同一數(shù)量級(jí)。 真核生物真核生物DNA的復(fù)制速度比原核生物慢的復(fù)制速度比原核生物慢第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核生物與原核生物染色體DNA復(fù)制還有一個(gè)明顯的區(qū)別是：真核生物染真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前起點(diǎn)不再從色體在全部復(fù)制完成之前起點(diǎn)不再從新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。物中，起點(diǎn)

42、可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物在快速生長時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)黑腹果蠅的早期胚胎細(xì)胞中相鄰兩復(fù)制起點(diǎn)的平均距離為7.9 kb，培養(yǎng)的成體細(xì)胞中復(fù)制起點(diǎn)的平均距離為40kb，說明成體細(xì)胞只利用一部分復(fù)制起點(diǎn)。幼年細(xì)胞生長較快，DNA復(fù)制也必須較快，在復(fù)制速度不變的情況下利用更多復(fù)制起點(diǎn)便可以加速復(fù)制的進(jìn)行。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核生物復(fù)制真核生物復(fù)制叉上的組成叉上的組成第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)原核生物的染色體是環(huán)狀的，其5最末端岡崎片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸來填補(bǔ)。但是真核生物線性染色體在復(fù)制后，不能像原核生

43、物那樣填補(bǔ)5末端的空缺，從而會(huì)使5末端序列因此而縮短。真核生物通過形成端粒結(jié)構(gòu)來解決這個(gè)問題。 (3) 真核細(xì)胞線形染色體的末端復(fù)制問題真核細(xì)胞線形染色體的末端復(fù)制問題第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)真核生物線性染色體的兩個(gè)末端具有特殊的結(jié)構(gòu)，稱為端粒(telomere)，它是由許多成串短的重復(fù)序列所組成。該重復(fù)序列通常一條鏈上富含G(G-rich)，而其互補(bǔ)鏈上富含C(C-rich)。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)例如，原生動(dòng)物四膜蟲端粒的重復(fù)單位為TTGGGG(僅列一條鏈的序列)；人的端粒為TTAGGG。TG鏈常比AC鏈更長些，形成3單鏈末端。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)線

44、性線性DNA染色體的末段復(fù)制問題染色體的末段復(fù)制問題第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)端粒的功能為穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5末端在消除RNA引物后造成的空缺。 復(fù)制使端粒5末端縮短，而端粒酶(telomerase)可外加重復(fù)單位到5末端上，結(jié)果維持端粒一定長度。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)端粒酶端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，它以所含RNA為模板來合成DNA端粒結(jié)構(gòu)。通常端粒酶含有約150個(gè)堿基的RNA鏈，其中含1個(gè)半拷貝的端粒重復(fù)單位的模板。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)如四膜蟲端粒酶的RNA為159個(gè)堿基的分子，含有CAACCCCAA序列。端

45、粒酶可結(jié)合到端粒的3末端上，RNA模板的5末端識(shí)別DNA的3末端堿基并相互配對(duì)，以RNA鏈為模板使DNA鏈延伸，合成一個(gè)重復(fù)單位后酶再向前移動(dòng)一個(gè)單位。端粒的3單鏈末端又可回折作為引物，合成其互補(bǔ)鏈。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)在動(dòng)物的生殖細(xì)胞中，由于端粒酶的存在，端粒一直保持著一定的長度。體細(xì)胞隨著分化而失去端粒酶活性，主要是因?yàn)榫幋a該催化亞基的基因表達(dá)受到了阻遏。在缺乏端粒酶活性時(shí)，細(xì)胞連續(xù)分裂將使端粒不斷縮短，短到一定程序即引起細(xì)胞生長停止或凋亡。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)組織培養(yǎng)的細(xì)胞證明，端粒在決定細(xì)胞的壽命中起重要作用，經(jīng)過多代培養(yǎng)

46、老化的細(xì)胞端粒變短，染色體也變得不穩(wěn)定。 然而，主要的腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)存在端粒酶活性，因此設(shè)想端粒酶可作為抗癌治療的靶位點(diǎn)。端粒酶端粒酶 端粒端粒 染色體的末端復(fù)制染色體的末端復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)端粒酶活性丟失引起過早衰老（端粒酶活性丟失引起過早衰老（progeria）Progeria，又叫Hutchinson-Gilford 綜合癥，嚴(yán)重的從出生起就開始衰老出現(xiàn)皺紋，禿頂?shù)?。一?0多歲死亡。比較輕一些的，叫Werner 綜合癥，從10多歲開始衰老，一般在40歲之前死亡。這些個(gè)體細(xì)胞中的端粒都較短，細(xì)胞的分裂能力下降。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)ProgeriaDo

47、you know how old they are ？Hutchinson-Gilford syndrome第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(4) 真核細(xì)胞核小體的復(fù)制問題真核細(xì)胞核小體的復(fù)制問題第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)但是有的實(shí)驗(yàn)表明，組蛋白是以“全保留”的方式復(fù)制的，即老的組蛋白保留在前導(dǎo)鏈中，滯后鏈中的組蛋白是新合成的。真核細(xì)胞染色體的復(fù)制真核細(xì)胞染色體的復(fù)制*第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4.1.4 DNA復(fù)制調(diào)控復(fù)制調(diào)控原核細(xì)胞的生長和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長、增殖速度不同的細(xì)胞中DNA鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)

48、量不同。迅速分裂的細(xì)胞具較多復(fù)制叉，而分裂緩慢的細(xì)胞復(fù)制叉較少并出現(xiàn)復(fù)制的間隙。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和RNA。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(1) 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)發(fā)生在起始階段，一旦開始復(fù)制，如無意外受組，就能一直進(jìn)行到完成。 現(xiàn)在知道，DNA復(fù)制的發(fā)動(dòng)與DNA甲基化以及與細(xì)菌質(zhì)膜的相互作用有關(guān)。在245bp的oriC位點(diǎn)中總共有11個(gè)4bp回文序列GATC， 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)Dam甲基化酶可使該序

49、列中腺嘌呤第6位N上甲基化。當(dāng)DNA完成復(fù)制后，oriC的親代鏈保持甲基化，新合成的鏈則未甲基化，因此是半甲基化的DNA。 半甲基化的起點(diǎn)不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到Dam甲基化酶使起點(diǎn)全甲基化。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)但起點(diǎn)處GATC位點(diǎn)在復(fù)制后一直保持半甲基化狀態(tài)，約經(jīng)過13min才再甲基化。而基因組其余部位的GATC在復(fù)制后通常很快(小于1.5min)就能再甲基化。只有與oriC靠近的dnaA基因啟動(dòng)子的再甲基化需要同樣的延遲期。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)當(dāng)dnaA啟動(dòng)子處于半甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄被阻遏從而降低了Dna A蛋白的水平。此時(shí)起點(diǎn)本身是無活性的，并且關(guān)鍵性起始蛋白

50、DnaA的產(chǎn)生也受到阻遏。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)只有甲基化的復(fù)制起點(diǎn)才有活性只有甲基化的復(fù)制起點(diǎn)才有活性第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)為什么為什么oriC和和dna A位點(diǎn)再甲基化會(huì)延遲位點(diǎn)再甲基化會(huì)延遲? 實(shí)驗(yàn)表明，半甲基化的oriC DNA (dnaA基因位于起點(diǎn)附近)可與細(xì)胞膜結(jié)合，但全甲基化就不能結(jié)合。推測(cè)有可能因oriC與膜結(jié)合而阻礙了Dam甲基化酶對(duì)其GATC位點(diǎn)的甲基化，也抑制了Dna A蛋白與起點(diǎn)的結(jié)合。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)這種結(jié)合使得正在復(fù)制中的DNA可隨著細(xì)胞膜的生長而被移向細(xì)胞的兩半部分。只在此過程完成后，

51、DNA的起點(diǎn)才從膜上脫落下來，并被甲基化，于是又開始新一輪的復(fù)制起始。在延遲期內(nèi)細(xì)胞得以完成有關(guān)的功能。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)復(fù)制起始的調(diào)節(jié)還涉及Dna A蛋白活性的循環(huán)變化；它與ATP結(jié)合為活性形式，隨之結(jié)合到起點(diǎn)上，ATP被緩慢水解；它與ADP結(jié)為無活性的形式。膜磷脂可以促進(jìn)Dna A的ADP被ATP置換。調(diào)節(jié)的許多細(xì)節(jié)還不清楚，但上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了解調(diào)節(jié)機(jī)制提供了線索。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)ColEl質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控的復(fù)制調(diào)控 ColE1是一個(gè)6646bp的小質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)為20-30。ColE1DNA復(fù)制不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿

52、主DNA聚合酶。質(zhì)粒DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA(RNAi)，它們控制了起始DNA復(fù)制所必需的引物合成。質(zhì)粒ColE1的復(fù)制完全是單向的。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)引物RNA前體的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起點(diǎn)上游555個(gè)核苷酸處，需經(jīng)RNaseH加工后產(chǎn)生有555個(gè)核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)RNAi的編碼區(qū)在引物RNA編碼區(qū)的5末端，轉(zhuǎn)錄方向與引物RNA相反，因此與引物RNA的5末端互補(bǔ)。RNAi通過氫鍵配對(duì)與引物RNA前體相互作用，阻止了RNaseH加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物而對(duì)復(fù)制起負(fù)調(diào)

53、控作用。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)RNAi不僅控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)而且也決定了質(zhì)粒的不相容性。RNAi與引物RNA分子的相互作用是可逆的，因此細(xì)胞內(nèi)RNAi的濃度決定了ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起始頻率。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)另一個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白能提高RNAi與引物前體的相互作用，從而加強(qiáng)了RNAi的負(fù)調(diào)控作用。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)(2) 真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控真核細(xì)胞的生活周期可分為4個(gè)時(shí)期：G1、S、G2和M期。G1是復(fù)制預(yù)備期，S為復(fù)制期，G2為有絲分裂準(zhǔn)備期，M為有絲分裂期。DNA復(fù)制只發(fā)生在S期。真核細(xì)胞中DNA復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控

54、：第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)也稱為限制點(diǎn)調(diào)控，即決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期。許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制點(diǎn)調(diào)控。促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可誘發(fā)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。一些細(xì)胞質(zhì)因子如四磷酸二腺苷和聚ADP核糖也可誘導(dǎo)DNA的復(fù)制。 (a)細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在S期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制的機(jī)理還不清楚。 (b)染色體水平調(diào)控第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)決定復(fù)制的起始與否，這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。 (c)復(fù)制子水平調(diào)控第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)此外，真核

55、生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄活化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段，許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類似。 第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4.1.5 線粒體線粒體DNA的復(fù)制的復(fù)制線粒體的DNA復(fù)制是D-環(huán)方式復(fù)制。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)這是一種單向復(fù)制的特殊方式。復(fù)制時(shí)雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)(即D-環(huán))。 發(fā)生這種情況的原因是由于兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不在一起，而是隔了一段距離。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)兩條鏈的起點(diǎn)并不總在同一點(diǎn)上，當(dāng)兩條鏈的起點(diǎn)分開一定距離時(shí)就產(chǎn)生D-環(huán)復(fù)制。第

56、4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)線粒體線粒體DNA復(fù)制過程分為四個(gè)階段復(fù)制過程分為四個(gè)階段在復(fù)制起點(diǎn)處以L鏈為模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一個(gè)500-600bp長的H鏈片段。該片段與L鏈以氫鍵結(jié)合，將親代的H鏈置換出來，產(chǎn)生D環(huán)復(fù)制中間物。Step 1 H鏈?zhǔn)紫群铣涉準(zhǔn)紫群铣傻?章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)這個(gè)新的H鏈DNA片段由于分子3端終止的位置不定而長短不一;也有一些3端位置是固定的，而由于5端被降解而使整個(gè)DNA片段長短不一。合成這樣500-600bp長的DNA片段不會(huì)引起線粒體DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的明顯改變。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)上述產(chǎn)生的H鏈片段由于太

57、短而很容易被擠出去恢復(fù)線粒體DNA完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)。但有時(shí)這個(gè)片段會(huì)繼續(xù)合成，這需要依靠拓?fù)洚悩?gòu)酶和螺旋酶的作用將雙鏈打開。Step 2 H鏈片段的繼續(xù)合成鏈片段的繼續(xù)合成第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)以被置換下來的親代H鏈為模板，離H鏈合成起點(diǎn)60%基因組的位置開始合成L鏈DNA，合成需要RNA引物。Step 3 L鏈合成開始鏈合成開始第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)H鏈的合成提前完成，L鏈的合成隨后結(jié)束。線粒體DNA合成速度相當(dāng)緩慢，約每秒10個(gè)核苷酸，整個(gè)復(fù)制過程需要1個(gè)小時(shí)。剛剛合成的線粒體DNA是松弛型的，需要40分鐘將其變成超螺旋型。Step 4 復(fù)制的完成復(fù)制的完成第4章

58、DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)葉綠體葉綠體DNA的復(fù)制也采取的復(fù)制也采取D-環(huán)的方式，雙鏈環(huán)的方式，雙鏈環(huán)兩條鏈的起點(diǎn)不在同一位置，但同時(shí)在起點(diǎn)環(huán)兩條鏈的起點(diǎn)不在同一位置，但同時(shí)在起點(diǎn)處解開雙鏈進(jìn)行處解開雙鏈進(jìn)行D-環(huán)復(fù)制，故稱為環(huán)復(fù)制，故稱為2D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)4.1.6 某些病毒的某些病毒的DNA復(fù)制方式復(fù)制方式一些病毒的DNA復(fù)制方式比較特殊。常見的類型有滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA復(fù)制復(fù)制單鏈置換單鏈置換290噬菌體和噬菌體和腺病毒腺病毒DNA等的復(fù)制等的復(fù)制串聯(lián)體復(fù)制串聯(lián)體復(fù)制T4 T7噬菌體的復(fù)制噬菌體的復(fù)制模板轉(zhuǎn)換模板轉(zhuǎn)換逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制逆轉(zhuǎn)

59、錄病毒的復(fù)制第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA復(fù)制復(fù)制噬菌體X174DNA的復(fù)制過程：（1）首先形成共價(jià)閉環(huán)的雙鏈分子(復(fù)制型)；（2）正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個(gè)3OH末端，A蛋白連在5-磷酸基末端；第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)（3）在DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負(fù)鏈為模板，從正鏈的3-OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動(dòng)而合成出新的正鏈。（4）合成一圈后，露出切口序列，A蛋白再次將其切開，并連在切出的5-磷酸基末端，游離出單位長度噬菌體環(huán)狀單鏈DNA分子。第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)型復(fù)制示意圖滾環(huán)型復(fù)制示意圖第4章

60、DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)型復(fù)制示意圖滾環(huán)型復(fù)制示意圖第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)滾環(huán)型復(fù)制示意圖滾環(huán)型復(fù)制示意圖第4章 DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)串聯(lián)體復(fù)制串聯(lián)體復(fù)制T4 T7噬菌體的復(fù)制噬菌體的復(fù)制T7噬菌體含有雙鏈線狀噬菌體含有雙鏈線狀DNA，線性DNA復(fù)制中RNA引物被切除后，留下5端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡并性使不同鏈的3端因互補(bǔ)而結(jié)合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體或多聯(lián)體。再由限制性內(nèi)切酶切割成單拷貝。 第4章