第二十一章DNA重組及重組DNA技術(shù)

1、整理ppt整理ppt DNA重組和重組重組和重組DNA技術(shù)技術(shù)DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章第二十一章整理pptnDNA重組重組（DNA recombination）是指不）是指不同同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段片段的交換并重新組合形成新的交換并重新組合形成新DNA分子的過(guò)程。分子的過(guò)程。n重組重組DNA技術(shù)技術(shù)（recombinant DNA technology）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以上上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新

2、形成新DNA分子的過(guò)程。分子的過(guò)程。 整理ppt第一節(jié)第一節(jié)自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移重組和基因轉(zhuǎn)移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature整理pptDNA重組重組同源重組同源重組 (homologous recombination)位點(diǎn)特異的重組位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)整理ppt

3、 發(fā)生在同源序列間的重組稱為發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組(homologous recombination)，又稱又稱基本重組基本重組（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。段的交換。 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的的Holliday模型模型一、同源重組是最基本的一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式整理pptnHolliday模型的模型

4、的4個(gè)關(guān)鍵步驟：個(gè)關(guān)鍵步驟： 兩個(gè)同源染色體兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；排列整齊；片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 一個(gè)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；中間體； 通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA； Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體重組體DNA，分別為：，分別為：整理ppt 片段重組體片段重組體 切開的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來(lái)斷

5、裂的是同一條鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本本DNA。 拼接重組體拼接重組體 切開的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙切開的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。 整理pptn參與細(xì)菌參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是關(guān)鍵的是RecA蛋白蛋白、RecBCD復(fù)合物復(fù)合物和和RuvC蛋蛋白白。nRecBCD復(fù)合物復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以

6、及需要酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。 nRecA蛋白蛋白可結(jié)合單鏈可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。復(fù)合物。 nRuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識(shí)別有內(nèi)切酶活性，能專一性識(shí)別Holliday連連接點(diǎn)，并有選擇地切開同源重組體的中間體。接點(diǎn)，并有選擇地切開同源重組體的中間體。 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_侵?jǐn)_(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3

7、5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶拼接拼接重組體重組體片段片段重組體重組體整理ppt二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的間的DNA整合整合 位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specific

8、recombination) 是由整合酶催化，在兩個(gè)是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。位點(diǎn)間發(fā)生的整合。整理ppt噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的的長(zhǎng)末端重復(fù)序列長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合整理ppt（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變

9、。片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。整理ppt hix為反向重復(fù)序列，它們之間的為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段片段可在可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)，其一驅(qū)動(dòng)hin基基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和和rH1基因基因表達(dá)，反向表達(dá)，反向(倒位倒位)時(shí)時(shí)H2和和rH1不表達(dá)。不表達(dá)。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。整理ppt H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉(zhuǎn)位片段轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列啟動(dòng)序列沙門氏

10、菌沙門氏菌H H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變整理ppt（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重鏈和兩條重鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈其中兩個(gè)編碼輕鏈( 和和 )，一個(gè)編碼重鏈。，一個(gè)編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 整理ppt 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基因的因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在重排均發(fā)生在

11、特異位點(diǎn)上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側(cè)片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列均存在保守的重組信號(hào)序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基。此重排的重組酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號(hào)序列重組信號(hào)序列基因片段基因片段整理ppt免疫球蛋白基因重排過(guò)程免疫球蛋白基因重排過(guò)程整理ppt三、轉(zhuǎn)座重組三、轉(zhuǎn)座

12、重組可使基因移位可使基因移位 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。 大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。列和轉(zhuǎn)座子。 整理ppt 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座 二個(gè)分離的反向重復(fù)二個(gè)分離的反向重復(fù)(i

13、nverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重復(fù)序列特有的正向重復(fù)序列 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因整理ppt插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)整理ppt插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座整理ppt 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個(gè)染色體可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposase Gene

14、有用基因有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因整理ppt 細(xì)菌的可流動(dòng)性元件細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L整理ppt由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座整理p

15、pt四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)移稱為接接合作用合作用(conjugation)。整理ppt 可接合質(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。 質(zhì)粒質(zhì)粒整理ppt（二）轉(zhuǎn)化作用（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外通過(guò)

16、自動(dòng)獲取或人為地供給外源源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。整理ppt例：例：溶菌時(shí)，裂解的溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。片段被另一細(xì)菌攝取。整理ppt（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移及基因重組即為及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。整理ppt噬菌

17、體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑溶菌生長(zhǎng)途徑 (lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑溶源菌生長(zhǎng)途徑 (lysogenic pathway)整理ppt第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)Recombinant DNA Technology整理ppt重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。分子。1977年年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國(guó)

18、南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。藥物。1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年年 英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。整理ppt重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。貝的集合。 獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。即無(wú)性繁殖。 DNA克隆克隆整理p

19、pt 技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克?。?細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）整理ppt其主要過(guò)程包括：在體外將目的其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。分子的大量拷貝。重組重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。夹g(shù)，又稱分子克?。╩olecular cloning）或）或DNA克?。寺。―N

20、A cloning）或基因工）或基因工程（程（genetic engineering）技術(shù)）技術(shù)整理ppt 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）整理ppt一、重組一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特

21、異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接；分子或片段連接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探針；活探針； DNA序列分析；序列分析；填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無(wú)外切活性，而無(wú)53 外切活性。常用于外切活性。常

22、用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基整理ppt限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuc

23、lease, RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈?zhǔn)且活惡怂醿?nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子分子內(nèi)部的特異序列內(nèi)部的特異序列, 并裂解磷酸二酯鍵。并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定義：定義：整理ppt與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNA。、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型） 分類：分類： 作用：作用：整理ppt第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該

24、細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶整理ppt類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口整理pptBam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口整理ppt有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全

25、有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶整理ppt來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCT

26、AGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：名稱名稱 識(shí)別序列及切割位點(diǎn)識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn

27、 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶整理ppt 二、重組二、重組DNADNA技術(shù)中常用的載體技術(shù)中常用的載體 定義定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。 載體按功能分為載體按功

28、能分為 克隆載體克隆載體(cloning vector) 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 整理ppt克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。整理ppt（一）克隆載體（一）克隆載體至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主

29、復(fù)制自主復(fù)制，并能使克隆的外源并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增；片段得到同步擴(kuò)增；至少有至少有一個(gè)選擇標(biāo)志一個(gè)選擇標(biāo)志（selection marker）：選擇標(biāo)志是）：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基因、因、-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）、營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等。）、營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的有適宜的RE的單一切點(diǎn)的單一切點(diǎn)：載體中一般都構(gòu)建有一段特異：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)RE的單一切點(diǎn)，的單一切點(diǎn)，可供外源基因插入時(shí)選擇，

30、叫多克隆位點(diǎn)（可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）。）。1. 1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn)克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn) 整理ppt（1 1）質(zhì)粒）質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn)特點(diǎn): : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 2. 常用的克隆載體常用的克隆載體 細(xì)菌染色體外的小型細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。pUC18質(zhì)粒載體圖譜質(zhì)粒載體圖譜 整理ppt 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型

31、，適用系列（插入型，適用cDNA克隆）克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克?。? 2）噬菌體）噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列整理ppt柯斯質(zhì)粒柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）載體（又稱黏粒載體） 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺

32、病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體）其他克隆載體整理ppt（二）表達(dá)載體（二）表達(dá)載體表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。的載體。根據(jù)宿主細(xì)胞分為：根據(jù)宿主細(xì)胞分為：原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體整理ppt1. 1. 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 原核表達(dá)載體的基本組成原核表達(dá)載體的基本組成 R R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列；P P：?jiǎn)?dòng)子；：?jiǎn)?dòng)子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列整理ppt2. 2. 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體

33、的基本組成真核表達(dá)載體的基本組成 OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。整理ppt第三節(jié)第三節(jié)重組重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理和操作步驟和操作步驟整理ppt 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過(guò)過(guò) 程程整理ppt（一）目的基因的分離獲?。ㄒ唬┠康幕虻姆蛛x獲取分分n化學(xué)合成法化學(xué)

34、合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列其產(chǎn)物的氨基酸序列 。nPCRPCR法法n從基因組從基因組DNADNA文庫(kù)中獲取目的文庫(kù)中獲取目的DNADNAn從從cDNAcDNA文庫(kù)中獲取目的文庫(kù)中獲取目的DNADNA整理ppt化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。序列。整理ppt5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA2 2、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 整理pptCyc

35、le 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。整理pptPCR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 整理pptn PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C整理ppt 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分整理ppt利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相

36、結(jié)合，直或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因?；?。 PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺≌韕pt利用利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板技術(shù)高度

37、敏感，對(duì)模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變整理ppt將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性因突變檢測(cè)的敏感性 。（四）（四）DNA序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突

38、變分析（五）基因突變分析整理pptn逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。nRT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)幾種重要的幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)整理pptn原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的

39、上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。n原位原位PCR方法彌補(bǔ)了方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)整理ppt（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)

40、定量分析的干擾，亦被稱為定量對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 整理pptn實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355整理pptn實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR分類：分類：實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PRC非探針類非探針類探針類探針類1. TaqMan1. TaqMan探針?lè)ㄌ结樂(lè)?2. 2. 分子信標(biāo)探針?lè)ǚ肿有艠?biāo)探針?lè)?3. FRET3. FRET探針?lè)ㄌ结樂(lè)?整理ppt圖20-3 TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)PCR原理示意圖組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌

41、限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合從基因組從基因組DNA文文庫(kù)獲取目的基因庫(kù)獲取目的基因限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb

42、 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫(kù)基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)片段構(gòu)建基因文庫(kù) mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫(kù)文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫(kù)獲取目的基因文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T整理ppt（二）載體的選擇與構(gòu)建（二）載體的選擇與構(gòu)建選選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。體的選擇和改

43、建方法也不同。 目的：目的： 獲得某一目的基因或獲得某一目的基因或DNA片段片段 獲得目的獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)片段所編碼的蛋白質(zhì)整理ppt載體載體插入插入DNA片段片段宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞質(zhì)粒質(zhì)粒510kb細(xì)菌，酵母細(xì)菌，酵母噬菌體載體噬菌體載體20kb細(xì)菌細(xì)菌黏粒黏粒50 kb細(xì)菌細(xì)菌BAC400kb細(xì)菌細(xì)菌YAC3 Mb酵母酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞 整理ppt（三）目的（三）目的DNA與載體連接與載體連接接接方式：（方式：（1）單一相同黏端連接單一相同黏端連接 （2 2）不同黏端連接不同黏端連接 （3）通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接通過(guò)其他

44、措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接 黏端連接黏端連接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連單一相同黏端連接單一相同黏端連接不同

45、黏端連接（定向克?。┎煌ざ诉B接（定向克隆）GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體整理ppt由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭人工接頭(linker)連接

46、連接通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接整理ppt人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R整理ppt在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。 同聚物加尾連接同聚物加尾連接整理ppt5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(

47、T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 整理pptPCR法針對(duì)目的針對(duì)目的DNADNA的的5 5 - -和和3 3 - -端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在每條引物的在每條引物的5 5 - -端分別加上不同的端分別加上不同的RERE位點(diǎn)，然位點(diǎn)，然后以目的后以目的DNADNA為模板，經(jīng)為模板，經(jīng)PCR PCR 擴(kuò)增便可得到帶擴(kuò)增便可得到帶有引物序列

48、的目的有引物序列的目的DNADNA，再用相應(yīng)，再用相應(yīng)RERE切割切割PCRPCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。線性化載體進(jìn)行有效連接。整理ppt 平端連接平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：適用于：目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連整理ppt3. 3. 粘粘- -平末端連接平末端連接n黏黏- -平末端連接是指目的平末端

49、連接是指目的DNADNA和載體之間通過(guò)和載體之間通過(guò)一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。 n屬于定向克隆屬于定向克隆整理ppt受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重組（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)整理ppt1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選利用抗生素抗性

50、標(biāo)志篩選(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表達(dá)插入表達(dá) 特性篩選特性篩選(3) 利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選（五）重組體的篩選與鑒定（五）重組體的篩選與鑒定篩篩整理ppt2. 序列特異性篩選序列特異性篩選 (1) RERE酶切法酶切法(2) PCR法法 (3) 核酸雜交法核酸雜交法(4) DNA測(cè)序法測(cè)序法 3. 親和篩選法親和篩選法插入失活篩選帶有重組載體的克隆插入失活篩選帶有重組載體的克隆 互補(bǔ)篩選（藍(lán)互補(bǔ)篩選（藍(lán)- -白篩選）白篩選） 菌落或噬斑原位雜交篩選重組體菌落或噬斑原位雜交篩選重組體 整理ppt重組重組DNADNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為： 小結(jié)小結(jié)分分分離獲取目的基因分離獲取目的基因 選選載體的選擇與構(gòu)建載體的選擇與構(gòu)建接接目的目的DNADNA與載體連接與載體連接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組重組DNADNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定整理ppt重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基因目的基因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包