第十一章熒光法

1、藥物分析教研室藥物分析教研室2主要內(nèi)容主要內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)3 某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外，某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光發(fā)射出比原來所吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光光致發(fā)光光致發(fā)光（二級(jí)光）。（二級(jí)光）。光致發(fā)光光致發(fā)光熒光熒光 luorescence 磷光磷光phosphorescence 熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置熒光譜線的位置及其及其強(qiáng)度強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的儀器方法。進(jìn)行

2、物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的儀器方法。 概述概述熒光熒光紫外可見紫外可見相同點(diǎn)分子光譜分子光譜不同點(diǎn)本質(zhì)發(fā)射光譜吸收光譜靈敏度10-810-10g/ml10-510-7g/ml選擇性高一般熒光分析法與紫外可見吸收光譜比較熒光分析法與紫外可見吸收光譜比較5（一）分子熒光的產(chǎn)生（一）分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光一、分子熒光 molecular fluorescence1 1、分子的電子能級(jí)與被激發(fā)過程、分子的電子能級(jí)與被激發(fā)過程分子的能級(jí)包括：電子能級(jí)（10ev）、振動(dòng)能級(jí)(0.1ev)及轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)(0.001ev) 10)21(212121MS多重性總自旋量子數(shù)和自旋量子數(shù)分別為兩電子自旋方向相反，1 1、

3、分子的電子能級(jí)與被激發(fā)過程、分子的電子能級(jí)與被激發(fā)過程 單重態(tài)：singlet state (S) 三重態(tài)：triplet state (T)3121212121MS多重性總自旋量子數(shù)和自旋量子數(shù)分別為兩電子自旋方向相同，電子能級(jí)的多重性M:M=2S+1；S為總自旋量子數(shù)6躍遷類型的比較躍遷類型的比較躍遷類型基態(tài)激發(fā)單重態(tài)S*基態(tài)激發(fā)三重態(tài)T*所需能量大小自旋方向不變改變躍遷幾率接近于1106（光學(xué)禁阻）82、熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 4 外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫910激發(fā)態(tài)激

4、發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷輻射躍遷無輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫熒光熒光：10-710-9s，第一激發(fā)第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)磷光磷光：10-410s； 第一激發(fā)第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)（1）振動(dòng)弛豫）振動(dòng)弛豫（vibrational relexation）過程過程：激發(fā)態(tài)分子通過

5、與溶劑分子碰撞而將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子由同一電子能級(jí)激發(fā)態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)回到最低振動(dòng)能級(jí)的過程。特點(diǎn)：特點(diǎn)：發(fā)生在同一個(gè)電子能級(jí)內(nèi)不同振動(dòng)能級(jí)間的躍遷；時(shí)間約10-12秒。或11S2S1S0吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1 振動(dòng)弛豫12（2 2）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internal conversion)過程過程：當(dāng)兩個(gè)電子的能級(jí)非常靠近，以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，電子常常由高電子能級(jí)以非輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)，這種過程稱為內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換特點(diǎn)：特點(diǎn)：發(fā)生在非常靠近的兩個(gè)電子能級(jí)間，他們的振動(dòng)能級(jí)有重疊；時(shí)間約10-110-13秒?；?3S2S1S0吸吸

6、收收內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫處于激發(fā)態(tài)的電子，通過振動(dòng)弛豫和內(nèi)部能量 轉(zhuǎn)換，均回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)過程：過程：振動(dòng)弛豫內(nèi)部能量交換振動(dòng)弛豫注：注：15（3 3）熒光）熒光（fluorescence）過程過程：電子由單重態(tài)的第一激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)而發(fā)射的光量子為熒光特點(diǎn)：特點(diǎn)：發(fā)生在激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)與基態(tài)之間。時(shí)間約為10-710-9 s。注：注： 發(fā)射熒光的能量比吸收的能量小 l1 l0 即發(fā)射波長(zhǎng) 激發(fā)波長(zhǎng) 16S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（4

7、4）外部能量轉(zhuǎn)換外部能量轉(zhuǎn)換（external conversion)過程過程：如果分子在溶液中被激發(fā)，激發(fā)分子之間、分子與溶劑之間會(huì)發(fā)生碰撞而失去能量，這種非輻射躍遷的過程稱為外部能量轉(zhuǎn)換特點(diǎn)：特點(diǎn)：發(fā)生在激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)和基態(tài)之間；所需時(shí)間約為10-710-9秒。結(jié)果：結(jié)果：導(dǎo)致熒光或磷光減弱，甚至熄滅18S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1 外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（5 5）體系間跨越）體系間跨越（intersystem crossing)過程過程：處于激發(fā)態(tài)的電子自旋方向發(fā)生改變，而使電子能級(jí)的多重性發(fā)生變化的過程特點(diǎn)：特點(diǎn)：

8、激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí)，產(chǎn)生體系間的跨越（S1*T1 ）。結(jié)果：結(jié)果：這種跨越會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱，甚至熄滅。20S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 4外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫影響體系間跨越幾率增大的因素：影響體系間跨越幾率增大的因素：含重原子的分子（如碘、溴等），體系間跨越最為常見。在溶液中存在氧分子等，這些順磁性物質(zhì)也能增加體 系間跨越的發(fā)生幾率。原因：原因：高原子序數(shù)的原子中，電子的自旋與軌道運(yùn) 動(dòng)之間的相互作用較大，有利于電子自旋反 轉(zhuǎn)的發(fā)生。22（6 6）磷光）磷光（phosporescence）過程

9、過程：電子由三重態(tài)的第一激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)而發(fā)射的光量子為磷光特點(diǎn)：特點(diǎn)：發(fā)生在激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)與基態(tài)之間。分子在三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上可以存活一段時(shí)間，發(fā)射時(shí)間約為10-410 s。注：注： 發(fā)射磷光的能量比熒光的能量小，l2l1 l0 即磷光波長(zhǎng) 熒光波長(zhǎng) 激發(fā)波長(zhǎng)23S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 4 外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫24熒光與磷光的比較熒光與磷光的比較熒熒 光光磷磷 光光躍遷激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)光電子能量E激發(fā) E熒光E磷光波

10、長(zhǎng)激發(fā) 熒光 磷光發(fā)射時(shí)間10-910-7秒10-410秒25（二）（二） 激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)熒光物質(zhì)分子的兩個(gè)特征光譜熒光物質(zhì)分子的兩個(gè)特征光譜&激發(fā)光譜(excitation spectrum)： F lex &熒光光譜(fluorescence spectrum)： F lem26（二）激發(fā)光譜與熒光光譜（二）激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜激發(fā)光譜：（與吸收光譜類似）表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起：（與吸收光譜類似）表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起 物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光所得的光譜。物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光所得的光譜。 方法：固定發(fā)射光波長(zhǎng)方法：固定發(fā)射光波

11、長(zhǎng)emem，依次改變激發(fā)波長(zhǎng)，依次改變激發(fā)波長(zhǎng)exex，測(cè)，測(cè) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度F F，以，以F-F-exex作圖得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。作圖得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。發(fā)射光譜發(fā)射光譜：（熒光光譜）固定激發(fā)光波長(zhǎng)：（熒光光譜）固定激發(fā)光波長(zhǎng)exex，依次改變發(fā)射，依次改變發(fā)射 波長(zhǎng)波長(zhǎng)emem，測(cè)熒光強(qiáng)度，測(cè)熒光強(qiáng)度F F，以，以F-emF-em作圖得熒光光譜。作圖得熒光光譜。激發(fā)光譜與熒光光譜上的激發(fā)光譜與熒光光譜上的max是定性是定性定量的依據(jù)定量的依據(jù)27熒光光譜的特征熒光光譜的特征（重點(diǎn)）（重點(diǎn)）（1 1）斯托克斯位移：斯托克斯位移：熒光發(fā)射熒光發(fā)射波長(zhǎng)波長(zhǎng)總是大于總是大于激發(fā)激發(fā)波長(zhǎng)。波長(zhǎng)

12、。 原因：無輻射躍遷能量損失，包括振動(dòng)弛豫和內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換等原因：無輻射躍遷能量損失，包括振動(dòng)弛豫和內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換等（2 2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān) 原因：電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)原因：電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn) 生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能 級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。（3 3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一通常熒光發(fā)射光譜與它

13、的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一 樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。 28 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜S0S1*=4=3=2=1=0=4=3=2=1=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E1蒽的能級(jí)躍遷圖鏡像關(guān)系的原因鏡像關(guān)系的原因由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與激發(fā)態(tài)相似，由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常熒光故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。29二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structu

14、re熒光壽命熒光壽命( f)和熒光效率和熒光效率 ( f) 熒光壽命：熒光壽命：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間所需要的時(shí)間熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（ ）：）：吸收的光子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%100%。二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structure 1.分子產(chǎn)

15、生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)）具有合適的結(jié)構(gòu)有強(qiáng)的紫外可見吸收；有強(qiáng)的紫外可見吸收；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）。32（二）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（二）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率 并產(chǎn)生紅移并產(chǎn)生紅移 二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structure332）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降

16、低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。 343）取代基效應(yīng)）取代基效應(yīng)給電子取代基給電子取代基-OH,-CN，-NH2等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光熒光得電子取代基得電子取代基 -C=O, -NO2-COOH，-SH等減弱熒光等減弱熒光重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：芳環(huán)上取代芳環(huán)上取代F、Cl、Br、I之后，系間竄躍加強(qiáng)，之后，系間竄躍加強(qiáng)，熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量取代基的位置：取代基的位置：鄰、對(duì)位

17、熒光鄰、對(duì)位熒光增強(qiáng)，間位抑制增強(qiáng)，間位抑制35（三）熒光試劑（了解）（三）熒光試劑（了解）1) 熒光胺熒光胺本身不顯熒光，能與脂肪族、芳香伯胺形本身不顯熒光，能與脂肪族、芳香伯胺形成熒光衍生物。成熒光衍生物。ex=275、390nm，em=480nm2)鄰苯二甲醛（鄰苯二甲醛（OPA）伯胺，伯胺，-氨基酸氨基酸 ex=340nm ,em=455nm3）丹酰氯）丹酰氯含伯、仲胺及酚基的生物堿含伯、仲胺及酚基的生物堿 丹酰肼丹酰肼可的松的羰基可的松的羰基 ex=365nm ,em=500nm4）無機(jī)離子）無機(jī)離子具有具有電子結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物電子結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物1 1、溫度：、溫度：低溫，低溫，f

18、 f。 原因：溫度原因：溫度TT，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子運(yùn)動(dòng)加快， 磁撞幾率磁撞幾率無輻無輻射躍遷射躍遷2 2、溶劑：、溶劑： 溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)，極性，極性， * * E,E,f f， 溶劑粘度溶劑粘度 ，f 三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure363、pH影響影響 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4、熒光熄滅劑的影響、熒光熄滅劑的影響 熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或熄滅的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)為熒光熄滅劑 常見的熄滅劑有

19、：常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。給電子基團(tuán)3738熄滅熄滅機(jī)理：機(jī)理： a碰撞失去能量碰撞失去能量 b生成不發(fā)光的配合物生成不發(fā)光的配合物 c溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化或氧分子的順磁性溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化或氧分子的順磁性 使激發(fā)單重態(tài)分子轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)使激發(fā)單重態(tài)分子轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài) d濃度較大，自熄滅現(xiàn)象濃度較大，自熄滅現(xiàn)象 5 5、散射光的干擾、散射光的干擾散射光散射光: :當(dāng)一束平行光照射在液體樣品上，大部分光線透過溶液， 小部分光線由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方 向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。瑞利光瑞利光:

20、 :光子和物質(zhì)發(fā)生彈性磁撞時(shí)，不發(fā)生能量交換，僅光子方 向改變，這種散射光稱為瑞利光。其波長(zhǎng)與入射光相同。拉曼光拉曼光: :光子和物質(zhì)發(fā)生非彈性磁撞，光子改變方向同時(shí)，與物質(zhì) 有能量交換，散射光波長(zhǎng)有所改變，增大或減小，這種散 射光為拉曼光。 波長(zhǎng)增大的拉曼光對(duì)熒光測(cè)定有干擾39硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與散射光譜與散射光譜(b)熒光光譜熒光光譜散射光譜散射光譜4041 能用熒光分析法測(cè)定的有機(jī)物包括能用熒光分析法測(cè)定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的、具有芳環(huán)或芳

21、雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的等；藥物中的生物堿類生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；及異喹啉類生物堿等；甾體類甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；如皮質(zhì)激素及雌醇等；抗生素類抗生素類如青如青霉素、四環(huán)素等；霉素、四環(huán)素等；維生素類維生素類如維生素如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗抗壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，中草藥中的許多有效成分中草藥中的許多有效成分，不少，不少是屬于是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析類，都能產(chǎn)生熒光，可用

22、熒光分析法作初步鑒別及含量測(cè)定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，法作初步鑒別及含量測(cè)定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑：進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑：42第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系 當(dāng)一束強(qiáng)度為當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的紫外的紫外/可見光照射一濃度為可見光照射一濃度為c、液層厚度為液層厚度為l的液槽時(shí)，可在溶液的的液槽時(shí)，可

23、在溶液的各個(gè)方向各個(gè)方向觀觀察到熒光，其察到熒光，其 吸收光強(qiáng)度為吸收光強(qiáng)度為Ia透過光強(qiáng)度為透過光強(qiáng)度為It熒光強(qiáng)度為熒光強(qiáng)度為FI0It IaF垂直方向垂直方向（= I0 - It ）熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度IaF = K(I0 It) K K ：取決于熒光效率取決于熒光效率 f f根據(jù)根據(jù)Beer Law=10- clItI0F = K(I0 - I0 10- c l ) = KI0(1- 10- c l ) = KI0(1- e2.303 c l )由于由于 ex =1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!所以所以 e-2.3 c l

24、=1 - 2.3 cl + (-2.3 cl) 2/2!+ (-2.3 cl) 3/3!+e-2.3 c l =1 - 2.3 cl 43e-2.3 cl =1 - 2.3 cl 代入代入 F = KI0(1- e2.303 cl )F = KI0(1- 1+2.3 c l ) =2.3 K I0 l c 當(dāng)熒光效率當(dāng)熒光效率 f f 、入射光強(qiáng)度、入射光強(qiáng)度I0、物質(zhì)的摩爾吸收物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)系數(shù) 、液層厚度、液層厚度l均固定不變時(shí)，均固定不變時(shí)，熒光強(qiáng)度正比于該熒光強(qiáng)度正比于該溶液的濃度溶液的濃度F = K c 熒光定量分熒光定量分析的依據(jù)析的依據(jù)4445二、定量分析方法二、定量分析方法

25、1.1.工作曲線法工作曲線法 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制F-c的標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在準(zhǔn)校正曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣的濃度空白調(diào)空白調(diào)0，標(biāo)品調(diào)，標(biāo)品調(diào)100%或或50%462、比例法：、比例法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度0000ssxxsxxsFFcFFccFFcFF3、多組分樣品的熒光分析、多組分樣品的熒光分析 a無相互干擾，分別測(cè)定 b有干擾，同紫外可見吸收光譜定量方法 解聯(lián)立方程組法 等吸收雙波長(zhǎng)消去法47第三節(jié)第三節(jié)

26、 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)四個(gè)部分四個(gè)部分激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器特殊點(diǎn)特殊點(diǎn)有有兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成，光源與檢測(cè)器通常成直角直角48第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)單色器單色器：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)的第一單色器和選擇發(fā)射光射光( (測(cè)量測(cè)量) )波長(zhǎng)的第二波長(zhǎng)的第二單色器單色器光源光源：氙燈氙燈 ( (可見與紫可見與紫外區(qū)外區(qū)) )檢測(cè)器檢測(cè)器：光電倍增管光電倍增管492.儀器的校正儀器的校正（1）靈敏度校正：）靈敏度校正：最低信號(hào)、最低信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度最低信號(hào)、最低信噪比所對(duì)應(yīng)的濃