分子熒光及磷光光譜分析法

1、University of Science and Technology of China分子熒光與磷光光譜分析法University of Science and Technology of China第一節(jié) 基本原理一、熒光、磷光產(chǎn)生的機理1、熒光、磷光的產(chǎn)生 當物質(zhì)分子吸收入射光子的能量之后，發(fā)生了價電子從較低的能級到較高能級的躍遷，這時分子被激發(fā)而處于激發(fā)態(tài)，稱為電子激發(fā)態(tài)分子。這一電子躍遷過程經(jīng)歷的時間約為10-15 s。 躍遷所涉及的兩個能級間的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可見光區(qū)的光子能量較高，足以引起價電子發(fā)生電子能級間的躍遷。 激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，它可能通過輻射躍遷輻射

2、躍遷和非非輻射躍遷輻射躍遷的衰變過程而返回基態(tài)。 輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生熒光或磷光熒光或磷光。 非輻射躍遷：振動弛豫（VR） 內(nèi)轉(zhuǎn)化（ic） 系間竄越（isc） 這些衰變過程導致激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能熱能傳遞給介質(zhì)。振動弛豫：分子將多余的振動能量傳遞給介質(zhì)而 衰變到同一電子能級的最低振動能級 的過程。內(nèi)轉(zhuǎn)化：相同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍 遷過程。系間竄越：不同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射 躍遷過程。例如： S1 S0 T2 T1 例如： S1 T1 T1S0 S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外

3、轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫 假如分子被激發(fā)到S2以上的某個電子激發(fā)單重態(tài)的不同振動能級上，處于這種激發(fā)態(tài)的分子，很快（約10-12 10-14s）發(fā)生振動弛豫而衰減到該電子態(tài)的最低振動能級，然后又經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)化及振動弛豫而衰變到S1態(tài)的最低振動能級。接著，有以下幾種衰變到基態(tài)的途徑：S1 S0 輻射躍遷 熒光S1 S0 內(nèi)轉(zhuǎn)化S1 T1 系間竄越 T1 S0 輻射躍遷 磷光 T1 S0 系間竄越 內(nèi)轉(zhuǎn)化速率很快（k為1011 1013s-1 ）， S2以上的激發(fā)單重態(tài)的壽命很短（ 10-1 10-13s ），因而除極少數(shù)例外，通常在發(fā)生輻射躍遷之前便發(fā)生了非輻射躍遷而衰變到S1態(tài)。所以所觀察

4、到的熒光壽命通常是來自S1態(tài)的最低振動能級的輻射躍遷。 系間竄越是自旋禁阻的，因而其速率常數(shù)小得 多（ 102 106s-1 ）。 熒光是來自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。發(fā)光過程的速率常數(shù)大，激發(fā)態(tài)的壽命短。 磷光是來自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過程的速率常數(shù)小，激發(fā)態(tài)的壽命相對較長。2、熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命f ：熒光分子處于S1激發(fā)態(tài)的平均壽命)(1Kkff：熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)：各種分子的非輻射衰變過程的速率常 數(shù)的總和。fkKi典型的 在10-8 10-10s 磷光壽命p ：磷光分子處于T1激發(fā)態(tài)的平均壽命。T1 S0 自旋禁阻的

5、躍遷fp達到毫秒級p/lnln0tIIt0ItI：t=0 熒光強度：t=t 光強度 熒光（或磷光）強度的衰變pkfk 熒光量子產(chǎn)率（ ）定義為熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。)(Kkkfff 熒光量子產(chǎn)率的大小取決于熒光發(fā)射與非輻射躍遷過程的競爭結(jié)果。 F苯其激發(fā)態(tài)常由環(huán)外的羥基或氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生的，它們的n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道平行，從而共享共軛電子結(jié)構(gòu)。 吸電子取代基使熒光減弱 醛基、羰基、羧基、硝基例如： 苯 熒光 硝基苯 無熒光 Cl、Br、I等重原子取代基，通常導致熒光減弱、磷光增強。 雖也含有n電子，但n電子的電子云并不與

6、芳環(huán)上的電子云共平面，其 n *的躍遷為禁阻躍遷，且 S1 T1系間竄越的概率大，故而熒光減弱。 *：自旋許可的躍遷 摩爾吸光系數(shù)大， 104 激發(fā)態(tài)壽命短 S1 T1系間竄越概率較小 4、 最低電子激發(fā)單重態(tài)的性質(zhì) n *：自旋禁阻的躍遷 摩爾吸光系數(shù)小，102 激發(fā)態(tài)壽命長 S1 T1系間竄越的幾率大熒光： * n *磷光： n * 有利不含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài) S1（、*） 含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài) S1（n、*） 三、影響分子發(fā)光的環(huán)境因素1、溶劑的影響（1）溶劑極性的影響 熒光體的偶極與溶劑分子的偶極之間存在著 靜電作用，溶劑分子圍繞

7、在熒光分子的周圍組成 了溶劑籠。 許多共軛芳族化合物，激發(fā)時發(fā)生了 * 躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑 極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降得更多，結(jié) 果熒光光譜向長波長方向移動。 熒光體的基態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光物質(zhì)的吸收光譜、熒光光譜都受影響，熒光體的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光光譜受影響。（2）熒光體與溶劑間的特殊化學作用（氫鍵） n *躍遷、某些分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷 涉及非鍵的孤對電子 隨溶劑形成氫鍵能力增大 熒光光譜向短波方向移動 某些芳族羰基化合物和氮雜環(huán)化合物非極性、疏質(zhì)子溶劑中 激發(fā)單重態(tài)（n、*） 熒光弱或無 高極性的氫鍵溶劑中 激發(fā)單重態(tài)（

8、 、*） 熒光強例如: 異喹啉 在環(huán)己烷中 無熒光 發(fā)磷光 在水中 發(fā)熒光如果熒光物質(zhì)是一種有機弱酸或弱堿，它們的分子及其相應的離子，可視為兩種具有不同熒光特性的型體，介質(zhì)的酸堿性變化將使兩種不同型體的比例發(fā)生變化，從而對熒光光譜的形狀和強度產(chǎn)生很大的影響。2 、介質(zhì)酸堿性的影響例如： 水楊醛 不發(fā)熒光，強磷光 堿性溶液中 酚基解離 強熒光 濃無機酸溶液中 羰基質(zhì)子化 強熒光 （ 、*） （n、*）3 、介質(zhì)的溫度和黏度的影響4、有序介質(zhì)的影響 表面活性劑或環(huán)糊精溶液屬于有序介質(zhì)，對發(fā)光分子的發(fā)光特性有著顯著的影響。T VR ic F p黏度 VR ic F p 四溶液熒光、磷光的熄滅四溶液熒

9、光、磷光的熄滅 熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強度熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強度降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強度降低的現(xiàn)象，這些會引起熒光的熄滅的物質(zhì)光強度降低的現(xiàn)象，這些會引起熒光的熄滅的物質(zhì)稱為稱為熄滅劑熄滅劑 。 狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分子的子的熒光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮熒

10、光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮短短，從而導致熒光強度的降低。，從而導致熒光強度的降低。 淬滅劑淬滅劑動態(tài)淬滅動態(tài)淬滅淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子發(fā)生相互作用靜態(tài)淬滅靜態(tài)淬滅淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)基態(tài)分子發(fā)生相互作用著名的熄滅劑著名的熄滅劑: 鹵素離子鹵素離子 重金屬離子重金屬離子 氧分子氧分子 硝基化合物硝基化合物 鹵素離子對于奎寧的熒光有顯著的熄滅鹵素離子對于奎寧的熒光有顯著的熄滅作用，但對某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作作用，但對某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互是有選擇性的?；ナ怯羞x擇性的。 熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低

11、待熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待測物質(zhì)的熒光強度的不良作用，但另一方面，測物質(zhì)的熒光強度的不良作用，但另一方面，我們可以利用某一物質(zhì)對某一熒光物質(zhì)的熄我們可以利用某一物質(zhì)對某一熒光物質(zhì)的熄滅作用建立對該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測。該滅作用建立對該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測。該法常具有更高的選擇性。法常具有更高的選擇性。 1.碰撞熄滅碰撞熄滅 溶液中熒光物質(zhì)分子溶液中熒光物質(zhì)分子M和熄滅劑和熄滅劑Q相碰撞相碰撞 而引起熒光熄滅。而引起熒光熄滅。 比較速率比較速率 M Mh hMM* *( (吸光吸光) 1) 1 M M* * M Mh h ( (發(fā)生熒光發(fā)生熒光) k) k1 1 M M* * M M*

12、 * +Q M+Q+ +Q M+Q+熱熱 k k2 2 M M* * QQ 1k 2kStern-VolmerStern-Volmer方程式方程式 k k：熄滅常數(shù)：熄滅常數(shù) QQ：熄滅劑濃度：熄滅劑濃度(M)(M) F F0 0,F,F分別是熄滅劑分別是熄滅劑Q Q不存在時及存在時的不存在時及存在時的溶液的熒光強度溶液的熒光強度)(1072321RDRDPRktt 10QkFF 2. 組成化合物的熄滅組成化合物的熄滅 某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之后，溶液的熒光強度顯著降低后，溶液的熒光強度顯著降低; 隨著溫度的升隨著溫度的升高，熒光強度而增強。高，熒光

13、強度而增強。 上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子M與熄滅劑分子與熄滅劑分子Q作用而生成了絡(luò)合物作用而生成了絡(luò)合物MQ，如，如絡(luò)合物絡(luò)合物MQ的形成是由于微弱的范德華引力的的形成是由于微弱的范德華引力的作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且對對solusolu的吸收并不發(fā)生任何影響。的吸收并不發(fā)生任何影響。能能量量降降低低 hMMMhMhMQMQQ M1k* 發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為M M* *分子，品種并沒有改分子，品種并沒有改變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，至于變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，

14、至于solusolu溫度升高熒光強度之所以增強，可能是由于溫度升高熒光強度之所以增強，可能是由于溫度升高時該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為溫度升高時該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為M M和和Q Q分子的緣故。這一點可以作為這一類型熄滅分子的緣故。這一點可以作為這一類型熄滅不同于碰撞熄滅的標志。不同于碰撞熄滅的標志。 如果絡(luò)合物如果絡(luò)合物MQMQ的形成是由于強大的力，則絡(luò)的形成是由于強大的力，則絡(luò)合物合物MQMQ將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光譜也將發(fā)生改變。譜也將發(fā)生改變。3. 轉(zhuǎn)入三重線級的熄滅轉(zhuǎn)入三重線級的熄滅 E C位位 E 能能 * * G D A

15、BCBD處于單線態(tài)的基態(tài)處于單線態(tài)的基態(tài)EGF為第一激發(fā)單線態(tài)為第一激發(fā)單線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài)當由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時，多余的振動當由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時，多余的振動能在碰撞中損失掉，能在碰撞中損失掉，solu中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入三重中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入三重線級的分子在一般溫度下是不會發(fā)光的，它線級的分子在一般溫度下是不會發(fā)光的，它們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰撞之中，撞之中，因因而引起熒光的熄滅而引起熒光的熄滅。 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線態(tài)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線態(tài)重新返回到基態(tài)，在這一過程中將放出波長重新返回到基態(tài)，在這一過

16、程中將放出波長較長的磷光。較長的磷光。 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些雜環(huán)化合物基及某些雜環(huán)化合物容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變系有系有強烈磁場的誘導作用強烈磁場的誘導作用所引起的，在原所引起的，在原子核附近，尤其是在子核附近，尤其是在Br或或I這樣重的原子這樣重的原子核附近，存在著強烈的磁場，所以含溴、核附近，存在著強烈的磁場，所以含溴、碘的化合物容易使溶液熒光熄滅碘的化合物容易使溶液熒光熄滅。 幾乎所有會發(fā)生熒光的有機化合物都會幾乎所有會發(fā)生熒光的有機化合物都會被溶解在溶液中

17、的氧分子熄滅劑熄滅到不同被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同的程度。的程度。 三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞 4.4. 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應的熄滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應的熄滅 某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時，某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應，即氧化還原反應，即引發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應，即氧化還原反應，即引起熒光的熄滅。起熒光的熄滅。 例：甲基藍熒光溶液被例：甲基藍熒光溶液被FeFe2+2+離子熄滅離子熄滅 D + + h D* D* D +

18、+ h D*+Fe2+ D+Fe3+ D+HDH（半醌）（半醌）2DHD+DH2（無色染料）（無色染料）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應的熄滅劑并不限于金發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應的熄滅劑并不限于金屬離子，屬離子，I，Br，CNS，S2O32等易于等易于給出電子的陰離子對奎寧，羅丹明及熒光素給出電子的陰離子對奎寧，羅丹明及熒光素鈉等有機熒光物質(zhì)也會發(fā)生熄滅作用。鈉等有機熒光物質(zhì)也會發(fā)生熄滅作用。5.熒光物質(zhì)的自熄滅熒光物質(zhì)的自熄滅當當C1M時，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。時，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。自熄滅的原因是多樣的：自熄滅的原因是多樣的：（1）M*M例：例：F熄滅熄滅苯和蒽苯和蒽（2）多聚體的形成）多聚體的形成多聚體與單體具有不同

19、的吸收光譜，但不多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不會發(fā)生熒光或熒光強度很弱。會發(fā)生熒光或熒光強度很弱。 消除：消除：（1）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃度增大而加大，因此若對度增大而加大，因此若對solu稀釋可消稀釋可消除或減低熒光的熄滅作用；除或減低熒光的熄滅作用；（2）溶解氧的除去，通入氮氣。）溶解氧的除去，通入氮氣。五五 熒光（磷光）強度與溶液濃度的關(guān)系熒光（磷光）強度與溶液濃度的關(guān)系 A =-lgT =bc T = F ( ) F =f 若用級數(shù)展開，略去高次項，得若用級數(shù)展開，略去高次項，得F = 2.303f kC k = bf稱為熒光的量子產(chǎn)率稱為熒

20、光的量子產(chǎn)率，f 0IIttII 0)1( 303.20bceI 0I吸吸收收的的量量子子數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)出出的的量量子子數(shù)數(shù) 濃度效應1. 內(nèi)濾效應2. 發(fā)光分子形成基態(tài)或激發(fā)態(tài)的聚合物3. 發(fā)光的再吸收第二節(jié)第二節(jié) 儀器儀器 與與UV-Vis的區(qū)別：的區(qū)別：1.檢測方向與入射方檢測方向與入射方向垂直，以便使被散向垂直，以便使被散射的入射光的直接檢射的入射光的直接檢出減至出減至最少最少2.兩個單色器兩個單色器3.檢測池四面透明檢測池四面透明4.激發(fā)光譜激發(fā)光譜5.發(fā)射光譜發(fā)射光譜LM1SM2DRUniversity of Science and Technology of China第三節(jié) 熒光的測定方法一、直接測定法 只要分析物本身發(fā)熒光，便可通過測定其熒光強度而測定其濃