細(xì)胞試驗的基本操作

1、細(xì)胞實驗的根本操作【細(xì)胞培養(yǎng)】一、細(xì)胞的復(fù)蘇：非原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般凍存于液氮之中,需要培養(yǎng)時要先從液氮中取出使之復(fù)蘇.細(xì)胞復(fù)蘇的原那么一一快速融化：必須將凍存在-196c液氮中的細(xì)胞快速融化至37C,使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化,預(yù)防冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對細(xì)胞造成損害.具體操作如下：1、實驗前準(zhǔn)備：1.1、 將水浴鍋預(yù)熱至37C,并將含10%FBS勺培養(yǎng)液置于其中預(yù)熱；.1.2、 用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面.1.3、 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等.2、取出凍存管及迅速解凍：2.1、 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號.

2、2.2、 從液氮罐中取出細(xì)胞盒,取出所需的細(xì)胞,同時核對管外的編號.2.3、 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動,使管中的液體迅速融化,約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內(nèi).3、平衡離心將細(xì)胞懸液吸到離心管中,10001500rpm離心3分鐘；4、制備細(xì)胞懸液吸去上清液,參加10ml培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打均勻,使細(xì)胞懸?。?、細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞濃度以5X105/ml為宜.6、培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶放入37C和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)略微擰松培養(yǎng)瓶蓋,換液的時間由細(xì)胞情況而定.通常,除少數(shù)特別

3、注明對DMSGK感的細(xì)胞外,絕大局部細(xì)胞株包括懸浮性細(xì)胞,在解凍之后,可直接放入含有10-15ml510倍新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSCW可,如此可預(yù)防大局部解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題.二、細(xì)胞的傳代：培養(yǎng)的細(xì)胞生長至一定密度之后,由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累可見到培養(yǎng)液變黃,而且細(xì)胞的生長空間也受到限制,就會影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存.這時就需要別離出一局部細(xì)胞和更新培養(yǎng)液,這一過程就叫做傳代.1、貼壁細(xì)胞的傳代具體操作如下：1.1、 傳代前準(zhǔn)備：1.1.1、 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把裝有培養(yǎng)液、PBSffi胰蛋白酶白瓶子放入37c水浴鍋內(nèi)預(yù)熱.1.1.2、

4、用75%酒精擦拭雙手和經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺1.1.3、 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染.1.1.4、 點燃酒精燈：注意火焰不能太小.1.1.5、 準(zhǔn)備好將要使用的已滅菌的空培養(yǎng)瓶.1.1.6、 取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好前方能放入超凈臺內(nèi).1.1.7、 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞,注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在鏡下觀察細(xì)胞,并做好記錄.1.1.8、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶經(jīng)用75%酒精擦拭后,再放入超凈臺.1.2、 胰蛋白酶消化:1.2.1、 將瓶蓋過酒精燈火焰消毒后,翻開瓶蓋,靠近酒精燈,小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBSW洗23次,

5、沿壁無細(xì)胞的一面緩緩參加適量消化液胰蛋白酶液,輕輕搖晃.注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好,最佳消化溫度是37Co1.2.2、 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,假設(shè)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞之間不再連接成片,說明此時細(xì)胞消化適度.1.3、 吹打分散細(xì)胞：1.3.1、 棄去大局部消化液僅留少量在瓶內(nèi),并輕輕拍打培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞分散,然后參加新鮮的培養(yǎng)液,再用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液盡可能不要出現(xiàn)泡沫,否那么對細(xì)胞有損傷1.4、 分裝稀釋細(xì)胞1.4.1、 將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中,參加適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋.1.4.2、 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量,必要時計數(shù).注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長,傳代細(xì)胞

6、的密度應(yīng)該不低于5X105/ml.最后在瓶上做好標(biāo)記,如細(xì)胞代數(shù)、日期及姓名等.1.5、 繼續(xù)培養(yǎng)：1.5.1、 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當(dāng)旋松瓶蓋,放入CO縮養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上.當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時為一個+,占50%為+,占75%時為+.2、懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉,只留下少量,然后參加新鮮培養(yǎng)液即可.當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多,感覺到比擬臟時,可以將懸液移到離心管內(nèi),10001500rpm離心3分鐘,棄上清,參加約2ml培養(yǎng)液,吹打至均勻,滴加2-3滴至已參加新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中.然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擰松

7、培養(yǎng)瓶蓋.三、細(xì)胞的凍存細(xì)胞凍存的原那么是要逐步緩慢降溫,以預(yù)防細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶對細(xì)胞造成傷害.1、具體操作如下：1.1、 從增值期到形成致密單層以前的細(xì)胞都可以用于凍存,但最好選擇對數(shù)增長期細(xì)胞,已長滿的細(xì)胞凍存復(fù)蘇后生存率低.在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液.1.2、 貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、離心10001500rpm,5min收集,懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集；1.3、 大約106個細(xì)胞參加1ml凍存液10%DMSO+90%青,用吸管吹打,使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；1.4、 參加到凍存管中,每個凍存管加11.5ml的細(xì)胞懸液；密封；1.5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期；1.6、 將凍存管直立放置于塑料盒或

8、紙盒內(nèi),管置于4c半小時,然后置于-20C兩小時,再置于-70C兩小時,然后置于液氮上方過夜；第二天將細(xì)胞置于液氮中；1.7、 記下凍存管存放的位置,作好凍存記錄凍存的細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等.2、考前須知：2.1、 使用DMSOT,不需要進(jìn)行高壓滅菌,它本身就有滅菌的作用.高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu),以至于降低冷凍保護(hù)效果.在常溫下,DMS財人體有害,故在配制時最好戴上手套操作.2.2、 不宜將凍存細(xì)胞放置在0c-60C這一溫度范圍內(nèi)過久,低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),是“危險溫區(qū).2.3、 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,及時添加.2.4、 細(xì)胞在液氮中貯存的時間理論上是無限的.但為妥

9、善起見,特別是很多未被凍存過的細(xì)胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇一次,觀察細(xì)胞對凍存的適應(yīng)性.已建系的細(xì)胞最好也每年取一支復(fù)蘇一次后,再繼續(xù)凍存.四、細(xì)胞計數(shù)實驗原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目.具體操作如下：1、準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞,按上述二的傳代方法繁殖細(xì)胞,待長成單層后以使用.2、細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS®洗滌后,參加培養(yǎng)液或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液,吹打制成待測單細(xì)胞懸液.3、細(xì)胞計數(shù)：2.1、 蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板,將特制的蓋玻片

10、蓋在血球計數(shù)梢上.2.2、 制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液如5滴到一離心管中,參加等體積臺盼藍(lán)染液0.4%或苯胺黑,活細(xì)胞不會被染色,參加染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞.假設(shè)僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),不考慮細(xì)胞的活力,那么可省略臺盼藍(lán)染色步驟.2.3、 、將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊梢中.2.4、 統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后,數(shù)出四角的四個大格每個大格含有16個中銘中沒有被染液染上色的細(xì)胞

11、數(shù)目.2.5、 計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：根據(jù)下面公式計算細(xì)胞密度：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml=四個大格子細(xì)胞數(shù)/4X2X104說明：公式中除以4由于計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù).公式中乘以2由于細(xì)胞懸液于染液是1:1稀釋.公式中乘以104由于計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm長x1.0mm寬x0.1mm高=0.1mm3;而1ml=1000mm3細(xì)胞計數(shù)要點：進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)時,要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否那么影響計數(shù)準(zhǔn)確性.取樣計數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其時屢次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻,以求計數(shù)準(zhǔn)確

12、；數(shù)細(xì)胞的原那么是只數(shù)完整的細(xì)胞,假設(shè)細(xì)胞聚集成團(tuán)時,只根據(jù)一個細(xì)胞計算.如果細(xì)胞壓在格線上時,那么只計上線,不計下線,只計右線,不計左線.操作時,注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊梢中,否那么要重新計數(shù).注：4%臺盼藍(lán)母液的配制：100毫升,用濾紙過濾,4c稱取4克臺盼藍(lán),參加少量蒸儲水研磨,加雙蒸水至保存.使用時,用PBSW釋至0.4%.五、細(xì)胞活力的測定1 .染料排斥試驗：其原理是細(xì)胞損傷或死亡時,某些染料可穿透細(xì)胞膜,與解體的DNA吉合,使其著色.而活細(xì)胞那么能阻止該染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).借此可鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞.常用的染料有臺盼藍(lán)、伊紅Y和苯胺黑等.以臺盼藍(lán)染色為例.步驟同上述細(xì)胞

13、計數(shù)的操作步驟.注意以下幾點：計數(shù)：在310min內(nèi),用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色,活細(xì)胞那么拒染.臺盼藍(lán)染色時,時間不宜太長,否那么活細(xì)胞也會著色,從而干擾計數(shù).活細(xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/活細(xì)胞總數(shù)十死細(xì)胞總數(shù)X100%2、MTF匕色實驗：可測定測藥物或病毒的IC50原理：活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮噪鹽MTT,復(fù)原成紫色不溶性結(jié)晶物,沉積于細(xì)胞中.用酸性異丙醇或DMS溶解后,于酶標(biāo)儀上測定光吸收值.紫色不溶性結(jié)晶物形成的多少與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)相關(guān).1.1、 將細(xì)胞接種于96孔板上,密度為大約105個/ml,每孔接種100屋；1.2、 培養(yǎng)至對數(shù)生長期參加待

14、測樣品；1.3、 作用一定的時間之后,參加三蒸水配制的5g/ml的MTT容液,每孔20l；1.4、 37c溫育4小時；1.5、 取出培養(yǎng)板,小心吸去上清,注意不要吸掉底部的藍(lán)紫色沉淀；如果是懸浮細(xì)胞那么用板離心機(jī)離心后除去上清；1.6、 每孔參加100的DMS.搖床上搖動30分鐘以使沉淀溶解；1.7、 用酶聯(lián)免疫檢測儀DNAExpert在595nm或490nm波長處檢測96孔平板中每孔細(xì)胞的光密度值OD直,按以下公式計算藥物或病毒對細(xì)胞生長的抑制率:細(xì)胞存活率=治療組OD1/對照組OD直X100%1.8、 求出各藥物或病毒濃度下的OD直占又t照OD直的百分比,用此百分比對藥物或病毒濃度作圖；在

15、所得的曲線上,百分比值為50時所對應(yīng)的濃度就是IC50值.或根據(jù)各濃度下細(xì)胞的存活率,采用Logit法計算IC50O六、細(xì)胞的運輸裝運細(xì)胞的方法有兩種：1、冷凍貯存運輸即利用特殊內(nèi)內(nèi)盛液氮或干冰凍存,保存效果較好,但較麻煩,且不能長時間運輸,多需空運.2、充液法2.1、 選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,去掉培養(yǎng)液,充滿新培養(yǎng)液,液量要到達(dá)培養(yǎng)瓶頸部,擰緊螺帽或塞以膠塞,保存微量空氣.假設(shè)空氣留量過多,運輸時大氣泡往返流動對細(xì)胞有干擾作用.2.2、 妥善包裝、運輸.一般在四五天內(nèi)到達(dá)目的地,對細(xì)胞活力無多大影響,時間過長那么細(xì)胞活力下降.2.3、 到達(dá)目的地后,倒出大局部培養(yǎng)液,保存維持細(xì)胞生長所需的液量

16、,置37C培養(yǎng),次日傳代.注：從其他研究室所取細(xì)胞時,應(yīng)注意了解細(xì)胞的性狀、培養(yǎng)液、培養(yǎng)時的考前須知等【細(xì)胞轉(zhuǎn)染】一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofetmiane20001、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的處理以24孔板培養(yǎng)為例：貼壁細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染前一天,在24孔板內(nèi)鋪上0.5X105細(xì)胞,500ul無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)一天,到轉(zhuǎn)染時使細(xì)胞到達(dá)80%90%的集合率.懸浮細(xì)胞：在制備混合物前,將48X105細(xì)胞用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)鋪鋪于24孔板內(nèi).2、轉(zhuǎn)染方法以質(zhì)粒DNA專染為例2.1、 將DNA質(zhì)粒7容于50ul無血清的OptiMEMIReducedSerumMedium中混合均勻.2.2、 將適量Lipofectamine2

17、000溶于50ul無血清的OptiMEMI中,混合均勻.在室溫下孵育5分鐘在25分鐘內(nèi)進(jìn)行步驟c.2.3、 孵育5分鐘后,將上述兩種混合物混合總體積100ul.輕輕混合均勻在室溫下孵育25分鐘可能出現(xiàn)霧狀沉淀.復(fù)合無在室溫下六小時內(nèi)穩(wěn)定.2.4、 在24孔板中每孔參加100ul的復(fù)合物以及適量培養(yǎng)基.十字法混合均勻.2.5、 細(xì)胞在37.CCO縮養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48個小時后,測量轉(zhuǎn)染效率.在加完復(fù)合物4-6小時候可更換培養(yǎng)基.3、轉(zhuǎn)染考前須知3.1、 轉(zhuǎn)染嚴(yán)格來說,每種細(xì)胞的條件是不一樣的,如果實驗時,不能確定最正確轉(zhuǎn)染條件,請在細(xì)胞實驗組共享文件夾查找類似細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法；3.2、 轉(zhuǎn)染結(jié)果的

18、好壞,與DN頗量密切相關(guān),務(wù)必在實驗之前對去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA勺質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格鑒定,至少采用以下兩種方法：瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測,如果有條件,可對質(zhì)粒DN祛內(nèi)毒素質(zhì)量的進(jìn)行檢測.細(xì)胞相關(guān)實驗操作方法【小量細(xì)胞樣品TotalRNA的提取方法】一、實驗步驟以細(xì)胞為例1.1、 細(xì)胞樣品1.0X107個去上清之后,參加1mlTRIzol溶液反復(fù)吹打至溶液清亮,轉(zhuǎn)移入1.5mlTube中室溫下放置10min,如不能立即提取那么放于-80C保存可保存一個月,提取時取出放于室溫融化；也可根據(jù)正常凍存方法保存1X107個細(xì)胞,提取時37c迅速融化,5000rpm離心3min去除上清液后迅速參加1mlTR

19、Izol溶液反復(fù)吹打至溶液清亮,室溫下放置10min;1.2、 參加200ul氯仿1/5TRIzol體積,先用槍混勻10-15下,再充分顛倒混勻2min,使兩相充分混合,室溫靜置3min;1.3、 4C、10000g12000rpm離心15min;1.4、 小心吸取上清中間有厚厚的蛋白層至一新的1.5mlTube中可取干凈,參加0.5ml異丙醇1/2TRIzol體積先用槍混勻10-15下,再充分顛倒混勻2min,室溫放置10min;1.5、 4C、10000g12000rpm離心10min;1.6、 小心吸去上清液注意不要吸起白色沉淀,參加1ml70%乙酉I-20C預(yù)冷旋轉(zhuǎn)漂洗RNAt淀；1.

20、7、 4C、10000g12000rpm離心5min;1.8、 小心吸去上清液,空氣中枯燥2-3min,參加84ulDEPC水充分溶解RNA如溶解困難,4c放置過夜；將RNAffi釋5倍,電泳,假設(shè)是對RNA勺質(zhì)量要求不高,做到這一步即可,以下是純化的步驟依次參加2ulRNaseInhibitor<40U/ul>,10ul10xDNaseIBuffer,4ulDNaseI<RNaseFree<5U/ul>,充分混勻后37c反響60min;1.9、 補(bǔ)力口200ulDEPC水至總體積300ul,再力口入300ulPCIDEPCk飽和,充分混勻5min,室溫10000

21、g12000rpm離心10min;1.10、 小心取上清幾乎看不見中間層,取的較干凈于一新的1.5mlTube中,再參加300ulCI,充分混勻5min,室溫10000g12000rpm離心10min;1.11、 小心取出上清液幾乎看不見中間層,取的較干凈于一新的1.5mlTube中,參加30ul3MCH3COONa；分混勻1min后參加750ul無水乙醇-20C預(yù)冷,充分混勻2min,-20C放置40min;1.12、 4C、10000g(12000rpm)離心15min,小心取出上清(可用槍取干凈)；1.13、 參加1ml70%乙酉|(DEPCK配制)(-20C預(yù)冷),旋轉(zhuǎn)振蕩清洗RNM淀

22、,4C、10000g(12000rpm)離心10min;1.14、 小心吸去上清液,室溫枯燥2-3min,參加80ulDEPC水溶解；1.15、 分別取2ulRNA溶液溶于10ulDEPC水中,混勻后各取出5ul進(jìn)行1淘脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳結(jié)果判定RN渥否有降解；1.16、 根據(jù)電泳結(jié)果估計RNA度,按比例使用TEBuffer(PH8.0)稀釋到0.3至0.5OD吸光度范圍內(nèi)；二、實驗考前須知1.1、 整個實驗過程中應(yīng)該使用橡膠手套和口罩,實驗前,使用70濃醇擦拭雙手和工作臺以及實驗用品；1.2、 實驗用試劑必須保證質(zhì)量,對pH值有要求的必須以滅菌后的測量值為準(zhǔn)；1.3、 貴重的樣品,抽完之

23、后,必須取出一定量作為實驗室保存；1.4、 必要時,可以將槍頭剪掉一局部使用,以免RN從量斷裂.【PBS容液的配制使用以及保存方法】一、試劑用途實驗中主要用來溶解稀釋固體試劑,形成含有緩沖體系的鹽離子溶液二、配制,使用和保存方法1、溶液配制按1L的標(biāo)準(zhǔn)量配制稱取以下藥品：NaCl8.0gNa2HPO41.15gKCl0.2gKH2PO40.2g溶解、定容,使用實驗室用超純水；2、除菌實驗室采用過濾滅菌,使用0.22止m的除菌膜；4c保存.3、使用使用過程中應(yīng)該保證嚴(yán)格的無菌操作,為了預(yù)防污染,可用50ml無菌離心管對dPBS進(jìn)行分裝.【抗生素配制使用以及保存方法】一、原核細(xì)胞用抗生素細(xì)胞培養(yǎng)相

24、關(guān)實驗中,為了預(yù)防培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細(xì)菌污染,需要在培養(yǎng)基中添加雙抗,即青霉素和鏈霉素.1、藥物使用濃度根據(jù)細(xì)胞種類的不同,一般P/S的終濃度保持在100U/ml,具體的實驗過程中,可以根據(jù)細(xì)胞對抗生素的敏感程度減少或增加雙抗用量,原那么來說,抗生素的使用范圍為：50U/ml-200U/ml.2、藥物配制方法干粉狀的抗生素2.1、 藥物溶解使用少量的dPBS容液溶解干粉狀的抗生素,?§解過程中,應(yīng)盡量減少dPBS的用量,使藥物保持在較高濃度；2.2、 溶液除菌使用0.22wm的除菌膜過濾,然后分裝,-20C保存.2.3、 日常使用按實驗要求的終濃度將抗生素溶液添加到培養(yǎng)基當(dāng)中,注意無菌操

25、作.2.4、 考前須知總的原那么是現(xiàn)用現(xiàn)配,盡量減少溶液反復(fù)凍融次數(shù),預(yù)防抗生素失效；培養(yǎng)基最好是現(xiàn)用現(xiàn)配,在含有血清的完全培養(yǎng)基中,添加抗生素,應(yīng)4c保存且有效使用期不能超過1個月.抗生素并非越多越好,在實驗細(xì)胞條件不明確之前,應(yīng)該先從最小使用量開始.二、真核細(xì)胞用抗生素本實驗室現(xiàn)在常用的真核用篩選標(biāo)記物主要有兩種：neomycin(G41和Puromycin,實驗中主要用來篩選細(xì)胞穩(wěn)定株或者陽性細(xì)胞群落.1、藥物配制和保存方法如下：藥品保存溶液配制G418Preparedinahighlybufferedsolution(e.g.100mMHEPES,pH7.3,orcellculture

26、medium).本實驗室使用dPBSpH7.3固體保存：SHELF(+20C).Thisproductisstablefor2years液體保存：Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22mmor0.45mmmporesizefilter,aliquotandfreeze(-20C)forlongtermstorageorrefrigerate(+4C)forshort-termstorage.assupplied.Sterilestocksolutionsarestableforatleast1yearat+4C.Hyg

27、romycinBSterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticinPBS;Sterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticin50mMHEPES,PH7.2.本實驗室使用dPBSpH7.3固體保存：Storageat4C,isstablefor2-3yearsassupplied.PuromycinSolubleinH2O(50mg/ml)ormethanol(20mg/ml)本實驗室使用dPBSpH7.3固體保存：Freezer(-20C).Protectfrommoisture.Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22umpore-sizefilter,aliquotandfreeze(-20C).Thisproductisatablefor2yearsass