植物細(xì)胞工程試驗(yàn)修改版

1、植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基母液的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握培養(yǎng)基母液的配制方法。在配制培養(yǎng)基前，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)、激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。當(dāng)配制培養(yǎng)基時(shí)，只需要按預(yù)先計(jì)算好的量吸取母液即可。二、實(shí)驗(yàn)器材電子天平（稱量為0.0001g）、電子天平（稱量為0.01g）、燒杯（500ml、100ml、50ml）、容量并瓦11000ml、100ml、50ml、25ml）、細(xì)口瓶（1000ml、100ml、50ml、25ml）、藥勺、玻璃棒、電爐。三、實(shí)驗(yàn)藥品NH4NO3、KNO3、CaC122H2O、MgSO47H2O、KH

2、2P。4、KI、H3BO3、MnSO44H2O、ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoC126H2O、FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O、肌醇、煙酸、鹽酸口比哆醇（維生素B6）、鹽酸硫胺素（維生素Bi）、甘氨酸。四、實(shí)驗(yàn)步驟每種母液均配制500ml,各成分的質(zhì)量如下：1、大量元素母液的配制表1MS培養(yǎng)基大量元素母液制備mg/L20稱量（mg）1NH4NO31650165002KNO3190019000蒸儲(chǔ)水定3CaCl22H2O4404400容至4MgSO47H2O3703700500ml5KH2PO41701700各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大20倍

3、，用稱量為0.01g的電子天平稱取，用蒸儲(chǔ)水分別溶解，按順序逐步混合。后用蒸儲(chǔ)水定容到500ml的容量瓶中，即為20倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液50ml。注意：配制大量元素母液時(shí)，某些無(wú)機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的雙蒸水溶解，藥品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量雙蒸水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等離子錯(cuò)開(kāi)混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。CaC122H2O要

4、在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl22H2O時(shí)，蒸儲(chǔ)水需加熱沸騰，除去水中的CO2,以防沉淀。另外，CaC122H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。2、微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是CuS045H20、CoC126H2O。按照表2配方，用稱感量為0.0001g的電子天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取彳量母液5mlo表2MS培養(yǎng)基微量元素母液的配制培養(yǎng)基濃度（mg/L）200(mg)1MnSO44H2O22.322302ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.84845Na2M

5、0042H2O0.25256CuSO45H2O0.0252.57CoCl26H2O0.0252.5注意：使用電子分析天平時(shí)注意不要把藥品撒到稱盤(pán)上，用完以后，用吸耳球?qū)⑻炱絻?nèi)的臟物清理干凈。3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來(lái)方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸儲(chǔ)水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液5ml。表3MS鐵鹽母液的配制培養(yǎng)基濃度mg/L）擴(kuò)大200倍稱量（mg）1Na2-EDTA37.337302FeSO47H2O27

6、.82780注意：在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eS04會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和Na?EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色（約加熱20-30min）,調(diào)pH值至5.5,室溫放置冷卻后，再冷藏。4、有機(jī)母液的配制MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸毗哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸儲(chǔ)水溶解，注意稱量時(shí)用電子天平。注意：由于維生素母液營(yíng)養(yǎng)豐富，因此貯藏時(shí)極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃度降低，并且易給后期培養(yǎng)

7、造成傷害，不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：配制母液時(shí)用無(wú)菌雙蒸儲(chǔ)水溶解維生素，并貯存在棕色無(wú)菌瓶中，或縮短貯藏時(shí)間。表4MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)母液的制備度(mg/L)200稱量(mg)1甘氨酸22002肌醇100100003鹽酸硫胺素（Vbi）0.1104鹽酸比哆素（VB6）0.5505煙酸0.5505、激素母液配制植物組織培養(yǎng)中使用的激素種類及含量需要根據(jù)不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：配制生長(zhǎng)素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA,應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸儲(chǔ)水定容到一定的濃度。

8、細(xì)胞分裂素，例如KT,應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇加34滴1mol/L的鹽酸溶解，再用蒸儲(chǔ)水定容。配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都應(yīng)保存在04C冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。五、思考題：1、配制母液時(shí)為什么要按順序加入各藥品？溶解CaCl22H2O時(shí)，為什么要將蒸儲(chǔ)水加熱？2、根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、pH值，按給出的培養(yǎng)基配方計(jì)算各種母液吸取量，填入下表。培養(yǎng)基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.7%,pH5.8。表5按上述配方計(jì)算各種母液吸取量并填入下表藥品名稱母液濃度1L培養(yǎng)基母液吸取量0.3L培加基母液吸取星

9、大量兀素20倍液微量兀素200倍液鐵鹽200倍液有機(jī)物質(zhì)200倍液6-BA0.5mg/mlKT0.5mg/mlNAA0.5mg/ml蔗糖瓊脂PH值5.8實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。對(duì)植物外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，要依靠培養(yǎng)基提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分。不同材料對(duì)培養(yǎng)基的要求不同，適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)和選用培養(yǎng)基，對(duì)植物組織培養(yǎng)取得成功至關(guān)重要的。另外，對(duì)組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控，次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來(lái)實(shí)現(xiàn)的。培養(yǎng)基的主要成分包括無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機(jī)物質(zhì)、植物生長(zhǎng)物質(zhì)等。二、實(shí)驗(yàn)器材電子天平、燒杯（1000ml）、醫(yī)用搪瓷量杯（

10、1000ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH試紙、吸耳球、線繩、封口膜、石棉網(wǎng)。三、實(shí)驗(yàn)藥品蔗糖、瓊脂、1mol/LNaOH、HCl、各種培養(yǎng)基母液。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、培養(yǎng)基配制（以1LMS培養(yǎng)基為例）1、計(jì)量根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）x1000ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取1000ml瓷杯一只，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷缸中備用。注意：在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重

11、新進(jìn)行配制。用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次。量取母液時(shí)，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯(cuò)；移液管不能混用。3、稱取稱取7g瓊脂，30g蔗糖備用4、融化用搪瓷杯量取600的蒸儲(chǔ)水放在電爐上，煮沸，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加水定容至800ml,加入蔗糖，定容至1000ml,煮沸。注意：加瓊脂的時(shí)候要邊加入邊攪拌，在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過(guò)程中，操作者千萬(wàn)不能離開(kāi)，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒(méi)有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加

12、熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。5、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOHHCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙（5.47.0）測(cè)培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止（在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.20.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過(guò)程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.20.5個(gè)單位左右，所以我們調(diào)PH值時(shí)一般要求培養(yǎng)基常溫PH值在5.8-6.3之間，我們可以適當(dāng)上調(diào)至6.3-6.4，以確保培養(yǎng)基的凝固）。注意：調(diào)配時(shí)要用玻璃棒不停的攪拌，使其充分混合。7、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的

13、培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50ml或100ml）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝2530瓶。8、包扎用封口膜封口，扎好繩子，用記號(hào)筆做好標(biāo)記注意：培養(yǎng)基中的部分成分在高溫滅菌時(shí)易發(fā)生化學(xué)變化，致使培養(yǎng)基pH值降低，從而使瓊脂凝固力下降，發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固，滅菌后不凝固現(xiàn)象。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：調(diào)整培養(yǎng)基pH值，一般不低于5.6,若需酸性較強(qiáng)培養(yǎng)基，可適當(dāng)增加瓊脂用量，。（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中含有大量的有機(jī)物質(zhì)，特別含糖量較高，是各種微生物滋生、繁殖的好場(chǎng)所。而接種材料需要在無(wú)菌條件下培養(yǎng)很長(zhǎng)時(shí)間，如果培養(yǎng)基被污染，則達(dá)

14、不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。因此，培養(yǎng)基的滅菌，是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)節(jié)。常用的滅菌方法是高壓滅菌和過(guò)濾除菌。1、高壓蒸汽滅菌法把分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種器具、蒸儲(chǔ)水等，放入高壓蒸汽滅菌鍋的消毒桶中，外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過(guò)支架高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲，注意上螺絲要對(duì)角線上。加熱后，鍋上壓力表指針開(kāi)始移動(dòng)，當(dāng)指針移至0.5kg/cm2時(shí)，扭開(kāi)放氣閥排除冷空氣，使壓力表指針回復(fù)零位。當(dāng)指針移至1.11.2kg/cm2時(shí)，即121c時(shí)，維持一定的時(shí)間。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所以滅菌的時(shí)間也要適當(dāng)考慮，具體可以參考表1。取出培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1d后再使用。表1培

15、養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時(shí)間容器的體積（ml）在121c下最少滅菌時(shí)間（min）205015751502025050025301000表2飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度溫度C飽和蒸汽壓力C2kg/cm磅/平方英寸2kg/cm磅/平方英寸0.001001.05515121.00.1412103.61.12516122.00.2814106.91.26618124.10.4426109.81.40620126.00.5638112.61.54322127.80.70310115.21.68124129.60.84412117.630134.50.98414119.950147.6150035200

16、040注意：鍋內(nèi)冷空氣必須排盡，否則壓力表指針雖達(dá)到一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在事實(shí)上達(dá)不到應(yīng)有的溫度，因而影響滅菌效果。當(dāng)達(dá)到一定壓力后，注意在保持壓力過(guò)程中，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)基成分，時(shí)間短則達(dá)不到滅菌效果。對(duì)蒸儲(chǔ)水，各種器具滅菌時(shí)，滅菌時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)，壓力也要提高，一般在126c維持一個(gè)小時(shí)。另外三角瓶中的液體不超過(guò)總體積的70%否則當(dāng)溫度超過(guò)100c時(shí),培養(yǎng)基會(huì)噴溢，造成培養(yǎng)瓶壁和封口膜的污染。消毒后的培養(yǎng)基不能立即用于接種，而應(yīng)放置24-72h。放置后如果培養(yǎng)基中沒(méi)有出現(xiàn)菌落，則說(shuō)明培養(yǎng)基是無(wú)菌的，才可以用于接種。另外做好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在

17、1-2周內(nèi)用完，短時(shí)間可存放于室溫條件，如不能盡快用完，應(yīng)放在4c條件下。2、過(guò)濾除菌培養(yǎng)基中某些成分是熱不穩(wěn)定的，在高溫濕熱滅菌中可能會(huì)降解。這類物質(zhì)需要進(jìn)行過(guò)濾滅菌。例如一些生長(zhǎng)因子，如赤霉素（GA）、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過(guò)濾滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其它成分經(jīng)高壓滅菌后置于超凈工作臺(tái)上冷卻至40C,再將過(guò)濾滅菌后的該化合物按計(jì)劃用量依次加入，搖勻，凝固后即可使用。如果是液體培養(yǎng)基，沒(méi)有凝固這個(gè)問(wèn)題，則可在冷卻到室溫后再加入。除菌濾膜其孔徑尺寸一般要小于或等于0.4科處過(guò)濾滅菌的原理，是溶液通過(guò)濾膜時(shí)，細(xì)菌的細(xì)胞和抱子等因大

18、于濾膜孔徑而被阻。濾膜的吸附作用力也不容忽視，往往小于濾膜孔徑的細(xì)菌等亦不能透過(guò)。在需要過(guò)濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置。液量少時(shí)可用注射過(guò)濾器，它由注射器、濾器（可更換）、持著部分和針管等幾部分組成。注射器不必先經(jīng)高壓滅菌，而后面幾部分要預(yù)先用鋁箔或牛皮紙等包扎好，最好放在有螺旋蓋的玻璃罐中，經(jīng)高壓滅菌，濾器滅菌不應(yīng)超過(guò)121C。由于這個(gè)注射過(guò)濾滅菌器”小巧、方便、實(shí)用，在液量多時(shí)多用幾套這種裝置（亦可適當(dāng)重復(fù)使用）也能順利完成液體滅菌操作。在使用前按無(wú)菌操作要求將注射過(guò)濾滅菌器的幾個(gè)部分裝配在一起，把吸有需要過(guò)濾滅菌溶液的注射器插入細(xì)菌過(guò)濾器與之相配合的插接口，推壓注射器活塞桿，將溶液

19、壓過(guò)濾膜，從針管部分滴出的溶液就是無(wú)菌溶液了，但是濾膜不能阻擋病毒粒子通過(guò)。在一般情況下，人工配制的溶液不會(huì)含有使植物致病的病毒。更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)研究中，這一點(diǎn)仍不容忽視。毫無(wú)疑問(wèn)，過(guò)濾滅菌過(guò)的溶液要按無(wú)菌操作要求盡快加入培養(yǎng)基中，以免重新遭到污染。實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)材料滅菌和接種一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義培養(yǎng)材料的滅菌與接種是組織培養(yǎng)過(guò)程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，領(lǐng)會(huì)無(wú)菌培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料消毒，接種的要求，初步掌握培養(yǎng)材料滅菌，接種的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、鐐子、解剖刀、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿。三、實(shí)驗(yàn)藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無(wú)菌水、胡蘿卜塊根、綠豆種子、培養(yǎng)基母液。四、

20、實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備好培養(yǎng)基，無(wú)菌水，培養(yǎng)皿及接種工具。2、將培養(yǎng)基、無(wú)菌水、接種工具置于接種臺(tái)上，打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈開(kāi)關(guān)，同時(shí)打開(kāi)接種室內(nèi)的紫外燈，用紫外燈照射至少25min,然后關(guān)室內(nèi)的紫外燈，開(kāi)通風(fēng)開(kāi)關(guān)，關(guān)閉臺(tái)內(nèi)的紫外燈，通風(fēng)10min后，再開(kāi)日光燈進(jìn)行無(wú)菌操作。3、接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酉精的棉球把手消毒一次。4、將綠豆種子在流水下沖洗干凈。5、將種子放于200ml的廣口瓶中，用75%勺酒精溶?浸泡30s,無(wú)菌水沖洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐溫2滴）浸泡3、5、10min,期間不斷搖動(dòng)溶液，用無(wú)菌水洗滌5次備用。6、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用

21、沾有75%勺酒精棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基整齊排列在接種臺(tái)左側(cè)，然后用75%酉精擦洗接種臺(tái)表面。7、接種用的鐐子使用前插入95%勺乙醇溶液中，使用鐐子時(shí)在酒精燈上燒片刻，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。8、在酒精燈火焰旁揭去封口膜，將瓶口傾斜接近水平方向，用火焰灼燒瓶口，灼燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口（接種時(shí)用左手托住三角瓶，呈斜向上方45度這樣既有利于，將外植體方便的送入培養(yǎng)基中，還能有效防止細(xì)菌落入三角瓶?jī)?nèi)，如果瓶口直立朝上，可能會(huì)導(dǎo)致大量的細(xì)菌落入三角瓶?jī)?nèi)，但如果三角橫放可能會(huì)導(dǎo)致液體培養(yǎng)基流到瓶口，甚至流出，增加染菌幾率。右手握住鐐子，注意鐐子的拿法。用酒精燈外焰灼燒三

22、角瓶瓶口和瓶壁，使瓶口和瓶壁的細(xì)菌灼燒死亡。）左手持瓶，使其靠近火焰，在接種的過(guò)程中瓶口始終不能離酒精燈太遠(yuǎn)，右手將燒過(guò)的鐐子觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻，夾取綠豆種子，將其放在培養(yǎng)基上，用鐐子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。每瓶可放4-6個(gè)外植體。9、轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口灼燒，將封口膜從酒精燈火焰上過(guò)一下，蓋上封口膜，扎好繩子，標(biāo)上接種日期、材料名稱、姓名等。10、將接種材料移到培養(yǎng)室培養(yǎng)。注思(1)從室外取得材料，要用自來(lái)水沖洗數(shù)分鐘，對(duì)表面不光滑或長(zhǎng)有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，沖洗時(shí)間要長(zhǎng)，必要時(shí)要用毛刷刷洗。(2)外植體消毒劑的選擇要綜合考慮消毒效果、不同材料對(duì)滅菌劑的耐受力、滅菌劑的去除等因素，最

23、好選用兩種消毒劑交替浸泡，初次實(shí)驗(yàn)滅菌時(shí)間要設(shè)置一定的時(shí)間梯度來(lái)確定最佳的滅菌時(shí)間。常用的消毒劑見(jiàn)表1。(3)工作臺(tái)接種時(shí)，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動(dòng)作(比如說(shuō)、笑、打噴嚏)，以免影響氣流，造成污染。另外操作過(guò)程中要不時(shí)用75%勺酒精擦拭雙手。(4)接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象，若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時(shí)，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴(yán)或放置培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌類種群密度過(guò)大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。另外培養(yǎng)瓶不潔凈，滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的原因。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：保持環(huán)境潔凈，杜絕使用污染的母液，嚴(yán)格高壓蒸汽滅菌程序，保證滅菌

24、時(shí)間。(5)接種后培養(yǎng)基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻，此種情況主要是接種過(guò)程中發(fā)生的污染所致。可能是接種室不潔凈、菌類池子過(guò)多、鐐子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺(tái)。出現(xiàn)故障等原因引起。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：保持無(wú)菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅菌；在接種前無(wú)菌室用紫外燈滅菌時(shí)間不低于20-30min;用75%酉精噴霧殺菌降塵，超凈工作臺(tái)開(kāi)啟15-20min后方可使用；鐐子等接種工具嚴(yán)格徹底滅菌，且接種時(shí)使用1次滅菌1次；操作過(guò)程中經(jīng)常用75剛精等消毒劑擦洗手部等措施。(6)接種后外植體周?chē)l(fā)生菌類污染可能因外植體表面滅菌不徹底所致。解決方法是外植體用飽和洗滌劑浸泡10

25、-15min,自來(lái)水沖洗0.5-2h后，再選擇適宜的滅菌劑消毒，一般用0.1-0.2%升汞滅菌最好。對(duì)于一些凹凸不平或有茸毛的外植體采用滅菌劑中加“吐溫-80”等濕潤(rùn)劑的辦法，增加其滲透性，以提高殺菌效果。表1植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑使用濃度%火菌時(shí)間(min)乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2較難215最好漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好過(guò)氧化氫1012515好五、思考題1、接種后污染調(diào)查觀察：接種后25天的污染情況，填入下表:觀察日期接種日期接種數(shù)污染數(shù)污染率主要污染菌種污染率（%=（污染的外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)）X100%如果培養(yǎng)材料

26、大部分發(fā)生污染，說(shuō)明消毒劑浸泡的時(shí)間短；若接種材料雖然沒(méi)有污染，但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織被破壞死亡；接種材料若沒(méi)有出現(xiàn)污染，生長(zhǎng)正常，即可以認(rèn)為消毒時(shí)間適宜。2、外植體用消毒劑消毒后，為什么要用無(wú)菌水漂洗？有時(shí)候會(huì)在消毒溶液中加入12滴的表面活性物質(zhì)，例如吐溫-80或吐溫-20,為什么？3、在接種過(guò)程中，通過(guò)哪些措施來(lái)防止細(xì)菌對(duì)接種工具，接種材料的污染？4、對(duì)外植體表面消毒時(shí)為什么常用“兩次消毒法”？實(shí)驗(yàn)四胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)誘導(dǎo)植物外植體形成愈傷組織的方法。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的重要因素，對(duì)有些植物材料而言，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)保

27、持愈傷組織的快速生長(zhǎng)是必要的，特別是兩者結(jié)合使用時(shí)，能更強(qiáng)烈的刺激愈傷組織的形成。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、鐐子、解剖刀、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿三、實(shí)驗(yàn)藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無(wú)菌水、胡蘿卜塊根、培養(yǎng)基母液、2,4-D、水解酪蛋白（CH）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基配置誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織的培養(yǎng)基為：MS+24-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH5.8。愈傷組織增殖培養(yǎng)基：MS+24-D0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH5.8。將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長(zhǎng)細(xì)菌則表明滅菌

28、測(cè)底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，紫外照射30mins以上。2、胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)根的消毒。將胡蘿卜塊根在自來(lái)水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織。將胡蘿卜切段，每段厚約0.5-1cm。把胡蘿卜段用無(wú)菌水漂洗干凈。用75%勺酒精溶液浸泡30so用0.1%氯化汞浸泡2、5、10、12min,在浸泡過(guò)程中用鐐子攪拌，以使消毒充分。這里設(shè)置梯度是為了探究最佳的升汞消毒時(shí)間，我們直接采用的是10mins的消毒時(shí)間。浸泡過(guò)的胡蘿卜段用無(wú)菌水沖洗3-5次，洗去殘留的氯化汞殘留液。3、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%勺酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基處理整齊排列在接種臺(tái)左側(cè)，然后用7

29、5%酉精擦洗接種臺(tái)表面。4、胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)根切片胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)根由外向內(nèi)依次分為皮層、形成層和中軸三部分。在切片消毒之前首先除去皮層的最外層，以減少胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)根的帶菌量。形成層的分生能力最強(qiáng)，是產(chǎn)生愈傷組織的主要部分，因此在切片時(shí)應(yīng)使每一個(gè)切片上都有形成層。具體操作方法和步驟如下：胡蘿卜的截面圖沿圖中豎線切開(kāi)沿圖中豎線切成首先沿橫線把胡蘿卜段切開(kāi)兩邊部分棄去（如圖）切片，每片厚0.5-1mm圖1胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)根切片的制作注意：消毒以后的所有操作過(guò)程，都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，操作所用的鐐子、解剖刀和剪刀使用前插入95叱醇溶液中，使用時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后再切割。5、輕輕打開(kāi)封口膜，將三角瓶口在火焰

30、上方灼熱滅菌，同時(shí)把長(zhǎng)鐐子也放在火焰上方灼燒，將燒過(guò)的鐐子觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后將培養(yǎng)皿打開(kāi)一小縫，用鐐子取出切好的胡蘿卜切片放到培養(yǎng)基表面，用鐐子輕輕向下按一下，使切片部分進(jìn)入培養(yǎng)基。在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)三角瓶一圈使瓶口灼熱滅菌。然后用封口膜封口，同時(shí)在三角瓶上寫(xiě)上培養(yǎng)材料、接種日期、姓名等。注意：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極為重要的因素，研究具體問(wèn)題要設(shè)置一定的濃度梯度，以尋找最佳濃度。五.思考題1、觀察接種的外植體在接種1周后產(chǎn)生愈傷組織的顏色和質(zhì)地，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率（=（形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù)）X100%2、分析影響愈

31、傷組織誘導(dǎo)和分化的主要原因。實(shí)驗(yàn)六植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與同步化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的常規(guī)方法以及同步化的方法。植物離體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)周期短、提取簡(jiǎn)單、易規(guī)?；⒉皇芡饨绛h(huán)境干擾，而且產(chǎn)量高、化學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)特性好等特點(diǎn)，利用植物離體細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行有用次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)一直受到研究者們的重視，也有成功的先例。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞系的種類以及培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對(duì)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大的影響。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、震蕩搖床、各種接種工具、手動(dòng)吸管泵、尼龍網(wǎng)、移液管、吸耳球、漏斗、離心管、離心機(jī)。三、實(shí)驗(yàn)藥品培養(yǎng)基母液、2,

32、4-D、蔗糖、瓊脂。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、誘導(dǎo)愈傷組織形成（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四）。2、制備液體培養(yǎng)基：MS+24-D1mg/L+蔗糖3%將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長(zhǎng)細(xì)菌則表明滅菌測(cè)底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，紫外照射30mins以上。3、在超凈工作臺(tái)上，從形成愈傷組織的培養(yǎng)瓶中，挑取質(zhì)地松弛、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織、放入盛有30ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，用鐐子輕輕捏碎愈傷組織。每瓶接入約2g重的愈傷組織，（或直接挑取蓬松的愈傷組織，用鐐子敲碎，之后加入到30ml的培養(yǎng)基中，再吹打均勻，形成細(xì)胞懸液，再稀釋至培養(yǎng)基中。）置于震蕩搖床固定，在黑暗條件下或弱散射光下10

33、0r/min震蕩培養(yǎng)。4、將胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物搖勻后倒在或滴入孔徑較大的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)漏斗中（孔徑47m,81m或更大）。5、如果網(wǎng)眼被細(xì)胞團(tuán)堵塞，可用吸管反復(fù)吸、吹。6、再用無(wú)菌培養(yǎng)基沖洗殘留在網(wǎng)上的細(xì)胞團(tuán)。7、重復(fù)步驟46次。8、將通過(guò)較大孔徑的細(xì)胞懸浮液，再通過(guò)較細(xì)孔徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾（如31m,26m）,用吸管反復(fù)吸、吹。9、經(jīng)過(guò)分級(jí)過(guò)濾的“同步化”細(xì)胞離心（50g,5min）,收集后加入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)或進(jìn)一步同步化。（同步化，和懸浮繼代培養(yǎng)都沒(méi)做，所以后面幾步不用寫(xiě)。）五、思考題1、研究細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的意義何在？挑選愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)需注意什么問(wèn)題？2、建立細(xì)胞懸浮系的步驟包括哪

34、些？一個(gè)良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系應(yīng)該具有什么樣的特征？實(shí)驗(yàn)七月季組織培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義掌握利用莖段作為外植體進(jìn)行無(wú)性繁殖的方法月季屬薔薇科，在觀賞植物中占有重要地位。根據(jù)其栽培技術(shù)的要求，以往的傳統(tǒng)方法，多采用野薔薇種子播種，在2-3年生的實(shí)生苗上嫁接，此法不僅繁殖系數(shù)小，且成本較高，生長(zhǎng)緩慢，自從組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，使得月季育苗發(fā)展迅速。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、鐐子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實(shí)驗(yàn)藥品MS培養(yǎng)基母液，6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒精、氯化汞。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基的配制增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+瓊脂0

35、.7%生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長(zhǎng)細(xì)菌則表明滅菌測(cè)底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，紫外照射30mins以上。2、外植體的獲得：選用嫩莖為材料，取帶芽的莖段，一般以頂端以下第3-10節(jié)上的芽為好，采回枝條剪去葉柄，再剝?nèi)ジ皆谇o上的皮刺，先用自來(lái)水沖洗枝條表面的塵土，然后把枝條截成2-3cm小段，每段帶1-2個(gè)側(cè)芽，用70%酒精滅菌20s,再用0.1%氯化汞溶液浸泡10min,再用無(wú)菌水沖洗4-5次。3、接種：將滅好菌的材接種到滅好菌的培養(yǎng)基上。（接種過(guò)程中同樣要注意無(wú)菌操作）。（由于是

36、平板接種4、培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度24C-26C,光照時(shí)間8-10h,光照強(qiáng)度12001x。5、分芽繼代：將叢生芽分割繼代。6、生根培養(yǎng)：選取苗長(zhǎng)2cm以上的壯苗作為生根材料，接種到生根培養(yǎng)基上，一般在接種后一周開(kāi)始觀察，約10d后發(fā)現(xiàn)有少量苗生根，20d后即可移栽。7、移栽：將培養(yǎng)有試管苗的三角燒瓶打開(kāi)，在溫室中煉苗2d,然后取出洗去根部瓊脂，移至盛有珍珠巖與細(xì)沙（1:1）的花缽中，每天澆營(yíng)養(yǎng)液，移栽成活率可達(dá)80%以上。五、思考題1 .查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)篩選月季芽增殖體系建立的最佳激素組合。2 .查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解植株的快繁的方法和大致過(guò)程。試驗(yàn)八蘭花的組織培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義：了解蘭花植物組培

37、的過(guò)程，進(jìn)一步熟悉無(wú)菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：二、實(shí)驗(yàn)器材：超凈工作臺(tái)、鐐子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實(shí)驗(yàn)藥品：MS培養(yǎng)基母液，6-BA、NAA、2,4-D、蔗糖、瓊脂、75%酒精、0.1%氯化汞。四、實(shí)驗(yàn)材料：蘭花一盆。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1.培養(yǎng)基的配制：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+3%瓊脂+0.7%蔗糖+NAA5mg/l+6-BA0.5mg/l將配好的培養(yǎng)基，冷卻至50C,時(shí)倒在已滅菌的平板中，蓋好蓋子，并用封口膜封好平板，高溫蒸汽滅菌之后，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長(zhǎng)細(xì)菌則表明滅菌測(cè)底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，紫外照射30mins以上。（由于我們采用的是一次性的塑料平板，

38、所以我們是將滅菌好的了培養(yǎng)基，冷卻至50c時(shí)，轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)，倒平板，封口后，待其冷卻凝固，之后再紫外消毒30mins后接的種。2.外植體獲得，選取一年生的蘭花嫩葉，一般一年生的嫩葉呈黃綠色。并取嫩葉的幼嫩部位，作為外植體。3.外植體洗滌，將采好的葉片至于自來(lái)水系沖洗10mins把葉片上的塵埃洗凈，在用洗滌劑輕輕刷洗葉片，再用無(wú)菌水清洗干凈，噴灑酒精，轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)。4 .外植體消毒，將葉片用75%酒精消毒30s,再用0.1%升汞消毒6mins,用無(wú)菌水清洗3-5次。5 .外植體切取，用酒精棉擦拭刀片和鐐子，并用酒精燈灼燒。再打開(kāi)，用已高溫蒸汽滅菌后的培養(yǎng)皿，將蘭花葉片切成0.5cm大小的小塊，接入培養(yǎng)基中。6、培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度2