基因工程的基本技術(shù)

1、基因工程的基本技術(shù) 第1頁/共59頁主要內(nèi)容主要內(nèi)容 核酸提取技術(shù)核酸提取技術(shù) 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù) PCR PCR技術(shù)技術(shù) DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù) 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù) 基因文庫構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因工程技術(shù) 重組子克重組子克隆隆第2頁/共59頁基因工程的基本技術(shù)基因工程的基本技術(shù)之一之一第一節(jié)第一節(jié)第3頁/共59頁一、核酸提取技術(shù)一、核酸提取技術(shù) 核酸包括脫氧核糖核酸（ DNA ）和核糖核酸（RNA）; 脫氧核糖核酸（ DNA ）包括線狀基因組DNA和環(huán)狀DNA（質(zhì)粒DNA）。第4頁/共59頁1、植物組織中基因組DNA的提取思考：思考：DNA如何從細胞中取出？如何從細胞中取出？

2、第5頁/共59頁植物組織中基因組DNA的提取原理： 用機械研磨使組織和細胞破碎，然后加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，使細胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并與蛋白質(zhì)形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性劑的作用下使蛋白變性，再經(jīng)離心除去組織和變性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第6頁/共59頁再思考：1、研磨破碎組織必 須在低溫下進行。-為什么？2、幼嫩組織DNA 的得率高還是低？防止防止DNA降解降解。得率高！第7頁/共59頁 提取DNA的質(zhì)量鑒定： DNA的相對完整性：凝膠電泳 DNA的純度：測OD值吸收峰： DNA 紫外光260nm 蛋白質(zhì) 紫外光280nm比值： OD260/2

3、80 = 1.8-2.0 較純 OD260/280 解螺旋2、電場：直流電場 電壓高則快 電壓太高則結(jié)果不準確 常用35V/CM第19頁/共59頁操作簡單；分辨范圍：100bp-60kb； 有效范圍：200bp-50kb； 分辨率：100bp左右3、支持物介質(zhì)低熔點瓊脂糖：用于DNA的回收（65）A 種類：瓊脂糖（agarose）凝膠：第20頁/共59頁常用于微衛(wèi)星、測序分析；分辨范圍：5-500bp； 分辨率：1bp聚丙烯酰胺凝膠：注意：有神經(jīng)毒性！第21頁/共59頁 凝膠分辨DNA的能力： 瓊脂糖 聚丙烯酰胺凝膠 濃度 分辨范圍(kb) 濃度 分辨范圍(bp) 0.3% 5-60 3.5

4、1000-2000 0.6% 1-20 5 90-500 0.7% 0.8-10 8.0 60-400 0.9% 0.5-7 12 40-200 1.2% 0.4-6 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100B 凝膠濃度凝膠濃度: 濃度濃度大大，篩孔小，適合，篩孔小，適合小小分子電泳；分子電泳； 濃度濃度小小，篩孔大，適合，篩孔大，適合大大分子電泳分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測的凝膠濃度的選擇：取決于待檢測的DNA的大小的大小原來如此！第22頁/共59頁4 、電泳緩沖液 pH值：偏堿性，帶負電荷 離子濃度：離子濃度高 電流大 發(fā)熱快膠溶解 種類：TAE （Tris+ED

5、TA+醋酸）:電流大，易產(chǎn)生離子富集TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:緩沖能力最強TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:緩沖能力低TNE （Tris+ EDTA+醋酸鈉）第23頁/共59頁電泳緩沖液的選擇TBE緩沖力大于TAE；高分子量的DNA選用TAE，否則選用TBE；基因組DNA酶切電泳選用TAE； 實驗技巧：問題：電泳緩沖液使用一定時間后由于離子的富集離子的富集作用作用，DNA在凝膠中出現(xiàn)跑不動現(xiàn)象。解決辦法：一是更換成新配置的電泳緩沖液；二是把電泳槽中倒出混勻后重新使用。WHY?大家注意了！第24頁/共59頁（二）、電泳指示劑和DNA染色劑、類型：溴酚蘭，二甲苯青、作用：(1)

6、 預(yù)知電泳的速率及方向；(2) 使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；(3) 與一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度。 電泳指示劑第25頁/共59頁 DNA染色劑 熒光染色劑,溴化已錠：（ EB, Ethidium bromid）吸收300360nm UV（紫外光）放出590nm可見光（橙紅色） 硝酸銀：常用0.1% Goldview染料染料吸收紫外光，放出綠光（雙鏈DNA）或橙紅色光（單鏈DNA）第26頁/共59頁（三）凝膠電泳過程1、制膠：稱取一定量的瓊脂糖用電泳緩沖液融解后倒入制膠槽配制；2、放膠：膠放入電泳槽，加入電泳緩沖液至沒過膠23mm,3、點樣：把DNA樣品加入上樣緩沖液混勻上樣4、電泳

7、：接通電源，調(diào)好電壓5、看結(jié)果：紫外光觀察。第27頁/共59頁1、單向電泳、單向電泳2、脈沖電場電泳（、脈沖電場電泳（CHEF）3、反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)電場電泳（電場電泳（FIGE）（四）、電泳種類（四）、電泳種類第28頁/共59頁 中文名稱：聚合酶鏈式反應(yīng) 1、PCR原理： 變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補的新鏈，實現(xiàn)DNA的擴增。技術(shù)3： PCR技術(shù)(polymerase chain reaction)

8、第29頁/共59頁PCRPCR操作流程操作流程949450 50 72 72 第30頁/共59頁 2、 PCR反應(yīng)過程：變性：變性：DNADNA雙鏈變?yōu)閱捂?；雙鏈變?yōu)閱捂?；退火：引物與模板結(jié)合；退火：引物與模板結(jié)合；延伸：合成互補鏈；延伸：合成互補鏈；上述過程通過上述過程通過PCRPCR儀的儀的程序設(shè)計及自動運作完程序設(shè)計及自動運作完成。成。第31頁/共59頁 3、 PCR反應(yīng)體系：體系成分：模板模板DNADNA、引物、引物、TaqTaq酶酶( (熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定性性) )、 dNTPdNTP、反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)緩沖液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.cl ） 。第32頁

9、/共59頁1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對出現(xiàn)，長度為15-30個核苷酸； 使用濃度： 0.1-0.5uM，高達1uM； 引物設(shè)計原則： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特異性； 4、引物擴增跨度； 5、是否形成引物二聚體第33頁/共59頁2）、模板DNA： 基因組DNA、質(zhì)粒DNA、其它DNA片段； 質(zhì)量要求：不高3）、Taq酶(熱穩(wěn)定性)： 常規(guī)酶 高保真酶：ExTaq La Taq酶4）、反應(yīng)緩沖液成分： BSA、Tween20、DTT、明膠-保護酶作用 Tris.cl提供緩沖作用第34頁/共59頁(2)、 dNTP的濃度： 常用100-200mol/L，不能

10、低于20mol/L，特異性、保真性； 4、影響影響PCR 產(chǎn)量、質(zhì)量的因素：產(chǎn)量、質(zhì)量的因素：(1)、 Taq酶：常用酶：常用1U/25L 濃度低，擴增產(chǎn)物不夠；濃度低，擴增產(chǎn)物不夠； 濃度高，非特異性擴增增加；濃度高，非特異性擴增增加； 酶的活性；酶的活性；第35頁/共59頁(3)、模板：主要考慮模板：主要考慮純度及使用量 對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個ng到100ng.(4)、引物濃度：引物濃度： 0.1-0.5mol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體引物二聚體；(5)、 Mg2+濃度：濃度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影響：酶的活性、引物

11、-模板退火、特異性第36頁/共59頁 (6)、 PCR反應(yīng)程序設(shè)定：反應(yīng)程序設(shè)定：(1)、變性溫度和時間、變性溫度和時間： 要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期：92.5 （2小時）95 （40min）97 （5min）94變性比較徹底，酶的半衰期也不短。(2)、引物退火溫度、引物退火溫度Tm與時間；與時間； Tm值由引物ATGC數(shù)決定每A、T計為2， G、C計為4，時間一般為40秒到60秒(3)、 引物延伸溫度與時間引物延伸溫度與時間： 72最佳，30-100nt/s，也有用68 如La Taq(4)、循環(huán)數(shù)：、循環(huán)數(shù)： 25-35 cycles 之間，過多則非特異擴增增加；平臺效應(yīng)；第37頁/

12、共59頁以普通以普通PCR 50 l reaction solution 為例為例)10 PCR buffer25mM MgCl2dNTP Mixture (10mM each)primer 1 （10 M)primer 2 (10 M)Taq polymerase (5U/ l)DNA template (0.1 g/ l)ddH2O total5 l (1 )4 l (2mM)1 l(0.1mM)1 l(0.2 M)1 l(0.2 M)0.6 l(2U/50 l)1 l36.5 l50 l5、PCR例子（例子（Example of reaction solution）反應(yīng)體系配置：反應(yīng)體系

13、配置：第38頁/共59頁 PCR thermal program94 C94 CTm72 C72 C4 C1min30sec30sec1min5 Cendless30 cycles 循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)Heat denaturationHeat denaturePrimers annealingExtensionLast extensionEnding reactionTa: annealing temperature設(shè)計的反應(yīng)程序設(shè)計的反應(yīng)程序相應(yīng)作用相應(yīng)作用第39頁/共59頁6、PCR的種類RT-PCR特異特異PCR錨定錨定PCR反向反向PCR套式套式PCR不對稱不對稱PCR長程長程PCR鍋柄鍋柄

14、PCR免疫免疫PCRRAPD定量定量PCR原位原位PCR第40頁/共59頁 F R （1）特異特異PCR 擴增所用的引物是特異的，擴出的產(chǎn)物也是特擴增所用的引物是特異的，擴出的產(chǎn)物也是特定的。定的。 （2）RT-PCR： 是一類以是一類以mRNA為最初模板的基因的擴增。為最初模板的基因的擴增。A A A A A A A A A A5CAPT T T T T T T T T T T第41頁/共59頁 （3）反向反向PCR： 根據(jù)已知序列擴增兩側(cè)序列的方法。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列酶切酶切酶切酶切引物引物2引物引物1此PCR操作過程：酶切基因組DNA連接環(huán)化目的DNA用引物

15、1和引物2組合擴增出側(cè)翼序列第42頁/共59頁 （4）定量PCR用途：用途：分析基因組中某個基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達豐度。第43頁/共59頁 實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。概念：概念：第44頁/共59頁 原理：通過原理：通過實時檢測實時檢測PCRPCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對來實現(xiàn)對起始模板進行定量及定性的分析。初始模板量初始模板量X0的對數(shù)值與的對數(shù)值與C(T) 值之間呈線性關(guān)系：值之間呈線性關(guān)系：log X0=

16、- log(1+Ex) *Ct+ log N 第45頁/共59頁Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04閾值線閾值線CtCt值值CtCt值值Ct 值的定義 在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段時到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示）第46頁/共59頁 PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcyc

17、le 6-15 熒光域值（threshold）的設(shè)定第47頁/共59頁 研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04閾值線閾值線CtCt值值CtCt值值第48頁/共59頁熒光信號如何產(chǎn)生？熒光信號如何產(chǎn)生？熒光化學試劑熒光化學試劑第49頁/共59頁思考題1 假設(shè)通

18、過基因槍轟擊技術(shù)，獲得一株具有抗旱目的性狀的轉(zhuǎn)基因水稻，但此轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了株高比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账咀儼姆前行誀睢?用PCR相關(guān)技術(shù)回答下列問題： 1、如何確認此苗是轉(zhuǎn)基因苗？ 2、目的基因是否表達？表達量如何？ 3、株高變矮的可能原因分析。提示： 轉(zhuǎn)基因時，目的基因是通過T-DNA的整合作用把T-DNA的左右邊界和其中間的目的基因和選擇標記基因一起整合進受體細胞基因組中。T-left標記基因promoterT- right目的基因第50頁/共59頁植物組織中基因組DNA的提取原理： 用機械研磨使組織和細胞破碎，然后加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，使細胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（

19、并與蛋白質(zhì)形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性劑的作用下使蛋白變性，再經(jīng)離心除去組織和變性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第51頁/共59頁抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒DNA所需的溶液：所需的溶液：、溶液溶液：50 mol/L葡萄糖，葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；、溶液溶液： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)， 現(xiàn)配現(xiàn)用；現(xiàn)配現(xiàn)用；、溶液溶液：3 mol/L KAc，用冰醋酸調(diào)，用冰醋酸調(diào)pH值至值至 5.2；第52頁/共59頁 DNA染色劑 熒光染色劑,溴化已錠：（ EB, Ethidium bromid）吸收300360nm UV（紫外光）放出590nm可見光（橙紅色） 硝酸銀：常用0.1% Goldview染料染料吸收紫外光，放出綠光（雙鏈DNA）或橙紅色光（單鏈DNA）第