實驗專題模塊三血液生化檢驗.ppt課件

1、實驗專題模塊三實驗專題模塊三 血液生化檢驗血液生化檢驗p血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳p血清尿素氮的測定血清尿素氮的測定p血液是在心臟和血管腔內(nèi)循環(huán)流動的一種組織。成人的血液約占體重的十三分之一，相對密度為1.0501.060，pH值為7.37.4，浸透壓為313 mmol/L。p血液由血漿和血細(xì)胞組成。血漿內(nèi)含血漿蛋白白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原、脂蛋白等各種營養(yǎng)成分以及無機(jī)鹽、氧、激素、酶、抗體和細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。p利用生物化學(xué)的方法，檢測存在于血液中的各種離子、糖類、脂類、蛋白質(zhì)以及各種酶、激素和機(jī)體的多種代謝產(chǎn)物的含量，叫做血生化檢查。p在正常生理情況下，其各種化學(xué)成分的

2、含量非常恒定。但是，機(jī)體的生理變化和病理情況，可導(dǎo)致血液的某些化學(xué)成分的含量發(fā)生較大的變化。所以分析血液的化學(xué)成分可以了解人體物質(zhì)代謝的情況，并協(xié)助診斷或者判別預(yù)后。p本專題將引見血清蛋白與血尿素氮等兩種生化目的的檢測，使同窗們對臨床生化檢驗有一個初步的了解。實驗一實驗一 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?. 掌握分別血清蛋白的根本原理及其臨掌握分別血清蛋白的根本原理及其臨床意義。床意義。2. 了解醋酸纖維薄膜電泳的方法及相關(guān)了解醋酸纖維薄膜電泳的方法及相關(guān)儀器的操作。儀器的操作。二、背景與原理二、背景與原理血清蛋白的血清蛋白的pI都在都在7.5以下，在

3、以下，在pH為為8.6的巴比妥緩的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子的方式存在，分子大小、外形也各沖液中以負(fù)離子的方式存在，分子大小、外形也各有差別。所以在電場作用下，可在醋酸纖維薄膜上有差別。所以在電場作用下，可在醋酸纖維薄膜上分別成分別成A、1、2、和和五條區(qū)帶。電泳終了后，五條區(qū)帶。電泳終了后，將醋酸纖維薄膜置于染色液，使蛋白質(zhì)固定并染色，將醋酸纖維薄膜置于染色液，使蛋白質(zhì)固定并染色，再脫色洗去多余染料。將染色后的區(qū)帶分別用再脫色洗去多余染料。將染色后的區(qū)帶分別用剪刀分別出來，將其溶于堿液中，進(jìn)展比色測定，剪刀分別出來，將其溶于堿液中，進(jìn)展比色測定，最后計算出各區(qū)帶蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。也可將染色后最后計

4、算出各區(qū)帶蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。也可將染色后的醋酸纖維薄膜透明處置后在掃描光密度計上繪出的醋酸纖維薄膜透明處置后在掃描光密度計上繪出電泳曲線，并可根據(jù)各區(qū)帶的面積計算各組分的百電泳曲線，并可根據(jù)各區(qū)帶的面積計算各組分的百分?jǐn)?shù)。分?jǐn)?shù)。+白蛋白白蛋白(A)12 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子方式存在，在電場中遷移速度不同，可以在醋酸纖維薄膜上分別成A、1、2、和五條區(qū)帶。蛋白名稱蛋白名稱等電點等電點分子量分子量白蛋白4.88690005.061：200002：300005.1290000-1500006.85-7.50156000-300000p 醋酸纖維素二乙酸纖

5、維素薄膜具有勻一的泡沫狀構(gòu)造，浸透性強(qiáng)，對分子挪動無阻力，用它作區(qū)帶電泳的支持物，具有用樣量少，分別明晰，無吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分別和免疫電泳等方面。p 醋酸纖維素薄膜經(jīng)1,4二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處置即透明，因此可得背景為無色的電泳圖譜。醋酸纖維素薄膜的特性四、四、 實驗操作實驗操作1. 預(yù)備與點樣：預(yù)備與點樣：1 將薄膜切成將薄膜切成2.58cm的小塊，在薄膜無光澤面距一的小塊，在薄膜無光澤面距一端端1.5cm處用鉛筆劃一線，表示點樣位置。處用鉛筆劃一線，表示點樣位置。2 將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上

6、緩沖液盛于培育皿中，使膜條自然浸濕下沉。緩沖液盛于培育皿中，使膜條自然浸濕下沉。3 將充分浸透指膜上沒有白色斑痕的膜條取出，將充分浸透指膜上沒有白色斑痕的膜條取出，用濾紙汲取多余的緩沖液，把膜條兩端各貼于兩塊玻用濾紙汲取多余的緩沖液，把膜條兩端各貼于兩塊玻片上，使點樣線空架。片上，使點樣線空架。4 用血色素吸管汲取人新穎血清用血色素吸管汲取人新穎血清35ul，涂于寬，涂于寬2厘厘米的點樣器末端處，或用點樣器在盛有血清的小燒杯米的點樣器末端處，或用點樣器在盛有血清的小燒杯中蘸一下，使其末端粘上薄層血清，然后緊按在薄膜中蘸一下，使其末端粘上薄層血清，然后緊按在薄膜點樣線上，待血清全部滲入膜內(nèi)，移開

7、點樣器。點樣線上，待血清全部滲入膜內(nèi)，移開點樣器。2. 電泳:將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時無光澤面即點樣面向下，點樣端置于陰極。槽架上以四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙需貼緊，待平衡5分鐘后通電，電壓為10V/cm長指膜條與濾紙橋總長度，電流為0.40.6mA/cm寬，通電一小時左右封鎖電源。3. 染色: 通電終了后用鑷子將膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分鐘取出，立刻浸入盛有漂洗液的培育皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。4. 定量：取試管6支，編好號碼，分別用吸管汲取0.4N氫氧化鈉4ml。剪開薄膜上各條蛋白色帶，另一空白部位剪一平均大小的薄膜條作為分光

8、光度法調(diào)零管，將各條分別浸于上色述試管內(nèi)，不時搖動，使藍(lán)色洗出。約半小時后，用分光光度計進(jìn)展比色，波長650nm，以空白薄膜條洗出液為空白對照，讀取白蛋白、1、2、球蛋白各管的吸光度值A(chǔ)。5. 計算: 光吸收總和A總AA+A1+A2+A+A各部分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)為：白蛋白%= AA / A總100%; 1球蛋白%= A1/ A總100%; 2球蛋白%= A2 / A總100%；球蛋白%= A / A總100%； 球蛋白%= A / A總100%臨床意義p 正常值： 白蛋白： 5772% p 1球蛋白：25% p 2球蛋白：49% p 球蛋白： 6.512%p 球蛋白： 1220%p 急性肝炎：發(fā)

9、病早期蛋白質(zhì)電泳無變化，發(fā)病兩周后白蛋白、2及球蛋白減少，球蛋白增高。 p 慢性肝炎：球蛋白升高，白蛋白下降較急性肝炎顯著。 p 肝硬化：白蛋白、1、2球蛋白均明顯下降，球蛋白極度升高，甚至A/G比值倒置。p 腎病綜合征時，白蛋白降低，2 、球蛋白升高。實驗二實驗二 血清尿素氮的測定血清尿素氮的測定一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?. 掌握血尿素氮的定義及其測定的意掌握血尿素氮的定義及其測定的意義。義。2. 了解二乙酰一肟顯色法的原理與操了解二乙酰一肟顯色法的原理與操作。作。二、背景與原理尿素的生成是肝臟的解毒功能之一。通常腎臟為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球濾過后在各段小管均可重吸收，因此在血液中

10、會有少量的尿素存在，普通用血尿素氮BUN來衡量。腎小管內(nèi)尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即到達(dá)了最大去除率。假設(shè)腎功能出現(xiàn)了損害，那么有能夠?qū)е履蛩嘏懦鰷p少，或者是重吸收增多，使得BUN升高。和血肌酐SCR一樣，在腎功能損害早期，血尿素氮可在正常范圍。當(dāng)腎小球濾過率下降到正常的50%以下時，血尿素氮的濃度才迅速升高。正常情況下，血尿素氮與肌酐之比BUN/Scr值約為10.1，高蛋白飲食、高分解代謝形狀、缺水、腎缺血、血容量缺乏及某些急性腎小球腎炎，均可使比值增高，甚至可達(dá)2030；而低蛋白飲食，肝疾病常使比值降低，此時可稱為低氮質(zhì)血癥。血尿素氮的檢測方法有很多，在本實驗中我們將運(yùn)用二乙酰一肟

11、顯色法。該方法的原理是，尿素與二乙酰在酸性環(huán)境中加熱可縮合成紅色的二嗪衍生物，顏色深淺與尿素的含量成正比，可經(jīng)過分過光度法獲得尿素含量。因二乙酰不穩(wěn)定，故用二乙酰一肟來替代。二乙酰一肟與強(qiáng)酸作用，可產(chǎn)生二乙酰，進(jìn)而再與尿素反響，過程如下：反響在強(qiáng)酸中進(jìn)展，產(chǎn)生的羥胺是干擾物質(zhì)，所以須用氧化劑將其氧化除去，可用的氧化劑有過硫酸鹽、砷酸、過氯酸、氯胺T以及一些陽離子等。另外，在顯色反響中產(chǎn)生的復(fù)合物存在著對光不穩(wěn)定的問題。參與硫氨脲既能提高尿素與二乙酰反響的靈敏度，又能添加其顯色的穩(wěn)定性。硫氨脲假設(shè)結(jié)合三價鐵離子或鎘離子一同運(yùn)用更能提高靈敏度。這樣就可以進(jìn)不除血清蛋白的超微量尿素氮測定。四、實驗操

12、作四、實驗操作試管編號試管編號1234尿素氮標(biāo)準(zhǔn)液ml1234蒸餾水ml5432尿素氮的濃度mg/100ml10203040系列規(guī)范溶液的配制測定液的配制試管編號試管編號123456蒸餾水L0000200分別從上表1-4管汲取液體參加對應(yīng)編號管L2020202000血清樣品L20酸性試劑mL5555552% 二乙酰一肟mL0.50.50.50.50.50.5混勻后置于沸水中水浴12分鐘。置冷水中冷卻5分鐘后，用540nm進(jìn)展比色，以5號管作為空白，讀取各管光吸收讀數(shù)。將所得讀數(shù)作縱座標(biāo)與相應(yīng)尿素氮濃度作橫坐標(biāo)在座標(biāo)紙上作圖，繪成規(guī)范曲線查規(guī)范曲線，得待測血清中尿素氮含量。五、本卷須知五、本卷須

13、知如血漿或血清尿素氮濃度超越如血漿或血清尿素氮濃度超越40mg時，那么時，那么必需將標(biāo)本用生理鹽水稀釋后再操作，結(jié)必需將標(biāo)本用生理鹽水稀釋后再操作，結(jié)果乘稀釋倍數(shù)即可。果乘稀釋倍數(shù)即可。六、臨床意義六、臨床意義1. 正常值范圍：正常值范圍：519mg/100ml2. 能夠臨床提示：能夠臨床提示：1血液尿素濃度增高分生理性和病理性要素兩方面。血液尿素濃度增高分生理性和病理性要素兩方面。A生理要素：高蛋白飲食引起血清尿素濃度和尿液排出量顯生理要素：高蛋白飲食引起血清尿素濃度和尿液排出量顯著增高。血清尿素濃度男性比女性平均高著增高。血清尿素濃度男性比女性平均高0.30.5mmol/L，隨年齡添加有增

14、高傾向。成人日間生理變異平均為隨年齡添加有增高傾向。成人日間生理變異平均為0.63mmol/L。B病理要素病理要素a. 腎前性：最重要的緣由是失水，因血液濃縮使腎血流量減腎前性：最重要的緣由是失水，因血液濃縮使腎血流量減少，腎小球濾過率減低而致血液尿素濃度添加。少，腎小球濾過率減低而致血液尿素濃度添加。b. 腎性：腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎腎性：腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎等影響腎小球濾過的疾病，都可使血液尿素炎及中毒性腎炎等影響腎小球濾過的疾病，都可使血液尿素含量增高。含量增高。c. 腎后性疾病：一切使尿路阻塞的要素都可引起血液中尿素腎后性疾病

15、：一切使尿路阻塞的要素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺腫大、尿路結(jié)石、尿道狹窄、膀胱腫瘤含量增高，如前列腺腫大、尿路結(jié)石、尿道狹窄、膀胱腫瘤致使尿道受壓等。致使尿道受壓等。2血尿素濃度降低除嬰兒、孕婦以及低蛋白高糖飲食者外，血尿素濃度降低除嬰兒、孕婦以及低蛋白高糖飲食者外，常見于肝功能衰竭患者。常見于肝功能衰竭患者。課堂分組討論課堂分組討論患者女性，患者女性，47歲，農(nóng)民。因反復(fù)發(fā)作性昏迷半年，歲，農(nóng)民。因反復(fù)發(fā)作性昏迷半年，近發(fā)作近發(fā)作7小時入院。體檢：中度昏迷，肝未觸及，小時入院。體檢：中度昏迷，肝未觸及，無癱瘓體征。心電監(jiān)測以及頭顱無癱瘓體征。心電監(jiān)測以及頭顱CT均未發(fā)現(xiàn)明顯均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。立刻便用甘露醇靜脈滴注，異常。立刻便用甘露醇靜脈滴注，3小時后患者清小時后患者清醒。詰問病史，患者來自血吸蟲病區(qū)，醒。詰問病史，患者來自血吸蟲病區(qū)，3年前因脾年前因脾臟腫大行脾切除術(shù)。每次昏迷前均有進(jìn)食高蛋白食臟腫大行脾切除術(shù)。每次昏迷前均有進(jìn)食高蛋白食物史，但未引起注重。本次發(fā)病前在親戚家進(jìn)食雞物史，但未引起注重。本次