抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則規(guī)范

1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則一、基本原則1.抗腫瘤藥物分類(1)細(xì)胞毒類藥物(cytotoxicagent):包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等；(2)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier)；(3)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑(resistancereersalagent);(4)腫瘤治療增敏劑(oncotherapysensitizer);(5)腫瘤血管生成抑制劑(tumorangiogenesisinhibitor);分化誘導(dǎo)齊U(differentiationinducingagent);(7)生長因子抑制劑(growthfactorinhib

2、itor);反義寡核甘酸(antisenseoligonucleotide)。2.抗腫瘤藥物藥效學(xué)需研究內(nèi)容2.1 包括體外抗腫瘤試驗(yàn)，體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。2.2 評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主，同時參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。2.3 I類抗腫瘤新藥應(yīng)進(jìn)行藥物作用機(jī)制初步研究。二、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)1 .試驗(yàn)?zāi)康?.1 對候選化合物進(jìn)行初步篩選；1.2 了解候選化合物的抗瘤譜；1.3 為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等。2 .試驗(yàn)方法選用10-15株人癌細(xì)胞株，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)；推薦使用四氮唾鹽MTT還

3、原法、XTT還原法、磺酰羅丹明B(SR染色法、或51Cr釋放試驗(yàn)、集落形成法等測定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時間一般為48-72小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。3 .評價標(biāo)準(zhǔn)以同一樣品不同濃度對腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng)曲線，然后采用Logit法計算半數(shù)有效濃度(IC50值或EC50值)。體外試驗(yàn)至少重復(fù)一次。附注：評價藥物抗癌活性的方法：1 .MTT還原法1.1 基本原理：是一種能接受氫MTT轉(zhuǎn)化成不溶(DMSO)溶密|甲四氮口坐MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)

4、-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的性的藍(lán)紫色的甲月替(formazan),而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷月替后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。1.2 操作步驟：1.2.1 選用對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成5000個/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種2001,37C,5%CO2培養(yǎng)24h。1.2.2 實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)35平行孔，37C,

5、5%CO2培養(yǎng)45d。1.2.3 棄去上清液，每孔加入200科新鮮配制的含0.2mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基.37C繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200科1DMSO,用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為570nm,參比波長為450nm測定光密度值。1.3 結(jié)果評定：按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率%=（1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對照）100%以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC50<10科"m1或植物粗提物的IC50<20科”m1時，則判斷樣品在體外

6、對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。2 .生長曲線法的基本原理：在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長，如取細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖可得一條直線，故稱此時為對數(shù)生長期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長逐漸減慢以致停止，此時稱高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對細(xì)胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。3 .染料排斥試驗(yàn)的基本原理：活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料，一定時間后，對著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，即可算出被殺死的細(xì)胞比例。4 .集落形成法的基本原理：克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力，當(dāng)單個細(xì)胞

7、分裂6代或6代以上時，其后代所組成的群體（集落）便含50個以上細(xì)胞。通過集落計數(shù)可對克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個細(xì)胞的增殖潛力，故能較靈敏地測定抗癌藥的活性，日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測方法。常用的集落形成法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)法兩種。5 .SRB法的基本原理：SRB（sulforhodamine是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515nm波長的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MTT法的一個缺點(diǎn)是OD值可隨放置時間而變，而SRB法無此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。三、體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)必須選用三

8、種以上腫瘤模型，其中至少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。試驗(yàn)結(jié)果三種模型均為有效，再重復(fù)一次也為有效，評定該化合物對這些實(shí)驗(yàn)性腫瘤具有治療作用。鼓勵使用人類腫瘤裸鼠移植瘤模型和多種類的移植瘤模型、原位接種模型和中空纖維測定（hollow-fiberassay）等方法。1 .動物動物要求健康，符合等級動物要求，有實(shí)驗(yàn)動物合格證。雌雄均可，但同一批實(shí)驗(yàn)中動物性別必須相同。小鼠鼠齡為5-6周，體重為18-22克。評價同一物質(zhì)的活性時，不同批次的實(shí)驗(yàn)必須采用同一品系的小鼠。2 .腫瘤模型2.1 小鼠腫瘤模型淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22

9、、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤(EAC)、肉瘤-180等，以及各種小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。2.2 人癌裸小鼠移植瘤模型應(yīng)選用體外試驗(yàn)敏感細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗(yàn)。模型建立和使用應(yīng)注意：(1)移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建立，對細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感性應(yīng)予了解。(2)移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。(3)對模型生長情況應(yīng)全面了解，尤其是生長快的模型(4)為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于15-20代3 .試驗(yàn)過程3.1 接種：腫瘤接種方法主要有皮下接種、

10、腹腔接種和原位接種。3.1.1 皮下腫瘤模型選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下(超凈臺或接種罩)，用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5mm3左右，用套管針接種于動物一側(cè)或雙側(cè)腋窩皮下；或制成細(xì)胞懸液，然后按一定比例加入無菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為(1-5)X106。3.1.2 腹水瘤模型無菌條件下，消毒動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水，以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動物腹腔，接種細(xì)胞數(shù)量一般為(1-5)X106。3.1.3 原位接種模型原位接種是指將來源于某臟器的腫瘤接種在動物的某臟器，如將人肝癌接種在裸小鼠的

11、肝臟。原位接種不是常規(guī)的方法，但有其優(yōu)越性，是鼓勵使用的方法。主要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內(nèi)等原位接種方法。3.2 動物分組3.2.1 試驗(yàn)設(shè)陰性對照組、陽性對照組、治療組。3.2.2 治療組設(shè)高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種后次日將動物隨機(jī)分組，裸鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100300mm3后將動物隨機(jī)分組。3.2.3 動物數(shù)普通小鼠每組10只，裸鼠6只。陰性對照組動物數(shù)為治療組動物數(shù)球驗(yàn)組數(shù)1/23.3 劑量設(shè)置3.3.1 治療組設(shè)高、中、低劑量治療組，一般按4:2:1設(shè)置，高劑量使用最大耐受量或LD10的劑量。3.3.2 陰性對照組給予相應(yīng)的溶劑；3.3.

12、3 陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物，3.3.4 如受試物為一抗癌藥物的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥物作為陽性對照藥。3.4 陽性對照藥選擇原則療效確切；與被試物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)類似；與被試物質(zhì)有類似的作用機(jī)理。3.5 藥物配制溶于水的藥物，用生理鹽水或蒸儲水配制；如用酸、堿溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或堿(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，調(diào)節(jié)pH在4.5-9.0的范圍內(nèi)。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMSO助溶的藥物，或用吐溫60、吐溫80、2-3%淀粉、0.5%竣甲基纖維素制成混懸液的藥物，可腹腔注射或口服，但必須設(shè)相同濃度的溶劑對照組。用注射

13、用花生油配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉注射。3.6 給藥方案和給藥途徑分組當(dāng)日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學(xué)和毒性反應(yīng)等確定給藥方案。給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同。給藥次數(shù)較多，或被試物質(zhì)溶解性較差，靜脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑是有差別的?？刹扇×鲋?、瘤內(nèi)、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗(yàn)時一般不能應(yīng)用腹腔給藥途徑。4評價標(biāo)準(zhǔn)4.1 腹水瘤模型接種給藥后，觀察和記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。如陰性對照組20%動物存活時間超過4周，表明腹水瘤生長不良，實(shí)驗(yàn)作廢。采用中位生存時間(即mediansurialtime,MST)來評價每組的生存

14、時間，其計算公式為：每組鼠數(shù)的中間數(shù)-中間生存天數(shù)前死亡的鼠數(shù)MST=(中間生存天數(shù)-0.5)+中間生存天數(shù)死亡的鼠數(shù)治療組與對照組的比較，采用T/C(%)來表示，計算公式為：TMSTT/C%=X100%CMSTTMST:治療組MST;CMST:陰性對照組MST。評價標(biāo)準(zhǔn)以125%為界，當(dāng)T/C%>125%時。視為有效，反之則無效。4.2 裸鼠移植瘤模型推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周2-3次，每次測量同時還需稱鼠重。腫瘤體積(tumorolume,T)的計算公式為：=1/2淚xb2或兀/6xaxbxc其中a、b、

15、c分別表示長寬高。兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一公式。根據(jù)測量結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relatietumorolume,RT),RT=t/0。其中0為分籠給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，t為每一次測量時的腫瘤體積?？鼓[瘤活性評價指標(biāo)為相對腫瘤增殖率T/C(%)TRTT/C%=X0%0CRTTRT:治療組RT;CRT:陰性對照組RT。療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C%>60%為無效；T/C%<60%,并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P<0.05為有效。4.3 小鼠腫瘤模型生長較慢小鼠腫瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價方法。生長較快小鼠腫瘤可采用稱瘤重的方法評價。試驗(yàn)結(jié)束后處死動物，稱體重，解剖剝離

16、瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重小于1克，或20%腫瘤重量小于400毫克，表示腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。療效評價公式：給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重腫瘤生長抑制率=X100%陰性對照組平均瘤重評價標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤生長抑制率<40%為無效；腫瘤生長抑制率40%,并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P<0.05為有效。4.4 原位接種模型不同原位接種模型可采用不同評價方法，主要有瘤重和生存時間評價法。如肝原位接種可用瘤重評價，顱內(nèi)接種可用生存時間評價。評價方法、標(biāo)準(zhǔn)和注意事項(xiàng)同腹水瘤模型和小鼠腫瘤模型。四、抗腫瘤藥物的特殊要求I類抗腫瘤新藥應(yīng)進(jìn)行藥物作用機(jī)制的初步研究。非細(xì)胞毒類藥物除完成體內(nèi)外抗腫瘤試驗(yàn)，

17、還應(yīng)進(jìn)行特定抗腫瘤作用研究。1 .生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑藥效學(xué)包括：體內(nèi)抗癌試驗(yàn)和免疫功能研究。1.1 體內(nèi)抗癌試驗(yàn)注意點(diǎn)：模型：裸鼠是免疫缺陷動物，一般應(yīng)用正常免疫鼠腫瘤模型。給藥時間：可按常規(guī)給藥，也可在接種前預(yù)先給藥，接種后繼續(xù)給藥或停藥。105個瘤細(xì)胞/小鼠。父腫瘤細(xì)胞接種量：可比細(xì)胞毒類藥物低一個數(shù)量級，一般為(1-5)給藥方法：可單獨(dú)給藥，也可與其它抗腫瘤藥物合并使用，觀察增效或減毒作用。1.2 免疫功能試驗(yàn)方法具有抑瘤作用的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，還需作免疫功能測定，以明確其抑瘤作用是否與免疫功能調(diào)控有關(guān)。免疫功能測定包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面。免疫功能測定有：(1)巨噬細(xì)胞功能測定(2) 天

18、然殺傷細(xì)胞(naturalkillcell)測定(3) 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(4) 淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞測定(lymphocyte-actiatedkillercell)(5) 各種細(xì)胞因子測定，如IL-2、IL-6、IL-12、IFN-rTNF-”等。(6) 遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測2 .腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑2.1 體外抗耐藥活性試驗(yàn)選才i2-3對腫瘤耐藥/敏感細(xì)胞株，采用MTT法或SRB法測定細(xì)胞毒性。一般在無毒劑量或相當(dāng)于IC10的劑量下設(shè)三個劑量，并設(shè)立相應(yīng)的陽性和陰性對照組。評價逆轉(zhuǎn)效果用逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(foldreersal,FR)表示：FR=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/IC50(加逆轉(zhuǎn)劑)。汪息的萬面：

19、耐藥株的耐藥性：耐藥株因傳代，尤其是撤藥后耐藥性可改變或消失；試驗(yàn)前必須對試驗(yàn)?zāi)退幹赀M(jìn)行耐藥倍數(shù)(FR)測定，確保試驗(yàn)的可靠性。若非逆轉(zhuǎn)多藥耐藥(MDR)而是逆轉(zhuǎn)單藥耐藥，則實(shí)驗(yàn)的瘤株中需有針對該藥的耐藥細(xì)胞株。陽性對照藥建議采用維拉帕米(erapamil)10(iM環(huán)抱菌素A(cyclosporinA)3科M2.2 體內(nèi)抗腫瘤耐藥活性試驗(yàn)小鼠敏感和對應(yīng)的耐藥腫瘤和人癌裸鼠敏感和對應(yīng)的耐藥移植瘤。2.3 耐藥基因及其表達(dá)產(chǎn)物測定可測定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度變化和耐藥基因及其表達(dá)產(chǎn)物，初步明確其逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制。包括多藥耐藥基因及其編碼蛋白(multidrugresistancegene/p-glyc

20、oprotein,Mdr1/Pgp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrugresistance-relatedprotein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lungresistance-relatedprotein,LRP)、其它與耐藥相關(guān)的基因/蛋白及酶等。3 .抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物腫瘤是否轉(zhuǎn)移不僅依賴于腫瘤細(xì)胞本身具有的內(nèi)在轉(zhuǎn)移潛能，而且也取決于機(jī)體抗轉(zhuǎn)移因素的消長。所以，抗轉(zhuǎn)移藥物只有在動物體內(nèi)模型上才能得出符合實(shí)際的結(jié)果。3.1 體外試驗(yàn)測定候選化合物作用下腫瘤細(xì)胞對基底膜的侵襲、粘附和腫瘤細(xì)胞趨化性運(yùn)動的能力。3.2 體內(nèi)試驗(yàn)3.2.1 模型：小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌等和人癌裸鼠

21、移植高轉(zhuǎn)移瘤模型。3.2.2 接種方法：常用靜脈注射方法，也可用皮下接種等方法。3.2.3 評價指標(biāo)接種給藥后，觀察記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后，稱動物體重、肺重、移植瘤重，解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶、測瘤徑(計算肺轉(zhuǎn)移瘤體積)和病理組織學(xué)切片觀察等；計算轉(zhuǎn)移率轉(zhuǎn)移抑制率=1-(治療組轉(zhuǎn)移率/對照組車t移率)M00%。4 .腫瘤血管生成抑制劑4.1 體外試驗(yàn)體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀校?1)人血管內(nèi)皮細(xì)胞模型：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和人微血管(肺、皮膚等)內(nèi)皮細(xì)胞。(2)血管形成促進(jìn)因子等刺激細(xì)胞DNA合成、增殖、遷移、血管形成(tubeformation)來觀察藥物的抗血管形成作用。如血管內(nèi)

22、皮生長因子(ascularendothelialgrowthfactor,EGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)(3)腫瘤細(xì)胞模型：主要應(yīng)用國內(nèi)已建立的人實(shí)體癌細(xì)胞系，確定EGF、FGF等高分泌的細(xì)胞株。檢測細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力及血管形成因子的基因表達(dá)狀況來評價藥物。4.2 體內(nèi)試驗(yàn)4.2.1 血管抑制試驗(yàn)經(jīng)典的血管形成評價方法有：雞絨毛膜尿囊和卵黃膜囊(CAM)、嚙齒動物虹膜和角膜等。也可用如皮下移植塑料或多孔的polytetrafluoroethylene管、皮下移植無菌的海綿；一些自然的或化學(xué)修飾的物質(zhì)如Matrigel和纖維凝膠等用于體內(nèi)模型。4.2.2 抗腫瘤試驗(yàn)通過觀察新生血管生成抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)檢測移植瘤的血管密度、血管生成因子和抑制因子的分泌和表達(dá)，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移情況等綜合評價腫瘤血管生成抑制劑的作用和作用機(jī)制。5 .分化誘導(dǎo)劑分化誘導(dǎo)劑的藥效學(xué)研究包括體外和體內(nèi)研究模型；目前的藥物主要能對急性白血病進(jìn)行有效的分化治療。陽性對照藥選用維甲酸類(retinoi