化妝品微生物檢測培訓(xùn)

1、化妝品微生物檢測培訓(xùn)內(nèi)容一、化妝品檢測微生物種類1 .耐熱大腸桿菌群是一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5C培養(yǎng)24h-48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。2 .銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42C+C條件下能生長。3 .金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。4 .霉菌和酵母菌霉菌是真菌的一部分，其特點(diǎn)是菌絲體較發(fā)達(dá)，無較大的子實(shí)體。酵母菌是真菌的一部分，細(xì)胞寬度（直徑）約26小，長度530小，有的則更長，個(gè)體形態(tài)有球狀、卵圓、橢圓、柱狀和香腸狀等。

2、二、微生物檢測方法1.基本操作規(guī)范無菌操作用于防止微生物進(jìn)入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作。在各種生物實(shí)驗(yàn)中，為了防止微生物地生長和繁殖影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，也要在無菌的環(huán)境下進(jìn)行。無菌操作原則：1、環(huán)境要清潔，進(jìn)行無菌操作前半小時(shí)，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動，防止塵埃飛揚(yáng)。2、在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。3、執(zhí)行無菌操作前，先洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。4、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。進(jìn)行無菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。5、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與

3、非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為絕對無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。6、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。7、酒精棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。無菌操作規(guī)范：1、使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、三角瓶、藍(lán)蓋瓶、生理鹽水、（刻度）吸管、膠頭等都必須經(jīng)過無菌處理（高壓蒸汽滅菌鍋、75%酒精處理）。2、樣品外包裝、一次性針筒外包裝等在拆封前都必須用75%酒精棉球擦拭,3、使用超凈工作臺前必須提前20分鐘打開

4、紫外燈滅菌。4、酒精火T火焰5cm范圍內(nèi)可認(rèn)為無菌，在打開或塞上三角瓶或試管塞子必須將瓶口和塞子同時(shí)在火焰上燒一圈，并在火焰無菌范圍內(nèi)打開或塞上塞子，接種或取樣時(shí)也必須在火焰無菌范圍內(nèi)；接種環(huán)、銀子、剪刀等金屬器具使用前必須在火焰上灼燒。5、接種完成后應(yīng)立即將平板、三角瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用過的器具應(yīng)馬上清洗、滅菌。樣品供試液的制備（注意無菌操作）洗發(fā)水、沐浴液一般為水溶性液體樣品，配制供試液時(shí)用滅菌吸管吸10mL樣品加到90mL滅菌生理鹽水（含玻璃珠的三角瓶）中，混勻后，制成1:10（10-1稀釋度）檢液。取樣、移液（注意無菌操作）取樣、移液時(shí)必須使用無菌的吸管或一次性滅菌針筒進(jìn)行操作，每一

5、支吸管或針筒只能吸取同一樣品的同一稀釋度液體，取樣必須精確，進(jìn)行移液時(shí)不能將吸管或針頭伸入容器中。劃線接種（注意無菌操作）提前配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，滅菌，倒平板，待凝固后提前放入超凈工作臺中；選取平整、圓滑的接種環(huán)按無菌操作法挑取少量菌種，將沾菌接種環(huán)在培養(yǎng)基的邊緣劃原始線，而后使接種環(huán)在指力作用下作輕快的滑移動作，從培養(yǎng)皿的一個(gè)邊緣滑向另一個(gè)邊緣，滑動時(shí)用力要均勻，切勿將接種環(huán)嵌入培養(yǎng)基內(nèi)。劃完后將接種環(huán)在酒精燈火燃燒滅菌，放于原處，蓋好皿蓋，倒置培養(yǎng)皿，劃線全部完成后放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2.革蘭氏染色原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚，經(jīng)過

6、初染和媒染，結(jié)晶紫和碘液形成特殊復(fù)合物，留在細(xì)胞壁內(nèi)，酒精無法脫色去除，呈現(xiàn)紫色；革蘭氏陰性菌由于其細(xì)胞壁較薄，酒精脫色能將結(jié)晶紫顏色脫去，經(jīng)過蕃紅（或沙黃）復(fù)染，最終呈紅色。操作步驟：革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：1）涂片固定。2）草酸錢結(jié)晶紫染1分鐘（初染）。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘（媒染）。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）用95%酒精清洗，洗去染液（脫色）。7）蕃紅（或沙黃）染色液染1分鐘后，自來水沖洗（復(fù)染）。干燥，鏡檢。3鏡檢將待檢標(biāo)本取樣、制片，在顯微鏡下觀察、分析、判斷。顯微鏡操作步驟：1）調(diào)節(jié)合適亮度。2）將臨時(shí)裝片在

7、載物臺上適當(dāng)位置固定好。3）低倍物鏡對準(zhǔn)通光孔，使用粗準(zhǔn)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，眼睛在側(cè)面觀察，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。4）通過目鏡觀察視野的變化，同時(shí)調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩慢上移，直至視野清晰為止。5）如果在視野中沒有被觀察對象，可以移動裝片，原則為欲上反下，欲左反右。6）如果不夠清晰，可以用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)一步調(diào)節(jié)。7）如果需要在高倍物鏡下觀察，可以轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器調(diào)換物鏡。如果視野較暗，可通過1的方法調(diào)節(jié)；如果不夠清晰，可通過6的方法調(diào)節(jié)，但是不可以用4的方法。8）如果需要在油鏡下觀察，現(xiàn)在高倍鏡下找到菌的位置，放下載物臺，在裝片上滴一滴香柏油，轉(zhuǎn)動接物鏡轉(zhuǎn)換盤，使油鏡頭

8、于鏡筒下方，俯身鏡旁側(cè)面在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止，轉(zhuǎn)動細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使視野物象達(dá)到最清晰的程度，觀察結(jié)束后，轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋放下載物臺，用沾乙醴的擦鏡紙向同一個(gè)方向擦拭油鏡，將香柏油擦凈。4微生物生化檢測1、耐熱大腸桿菌群：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；G-;靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)陽性。2、銅綠假單胞菌：G",氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性，綠膿菌素實(shí)驗(yàn)陽性為銅綠假單胞菌；液化明膠實(shí)驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)陽性，42C生長試驗(yàn)陽性亦為銅綠假單胞菌。3、金黃色葡萄球菌：G+;甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性；凍干兔血漿實(shí)驗(yàn)陽性。4、霉菌和酵母菌（計(jì)數(shù)）：虎紅培養(yǎng)基置28c±2C培養(yǎng)5do

9、三、微生物全檢過程1 .培養(yǎng)基的配制及滅菌需使用的培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SCDLP培養(yǎng)基、十六烷三甲基澳化錢瓊脂培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、硝酸鹽蛋白陳水培養(yǎng)基、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、BairdParkeri養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基、凍干兔血漿培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基一般買配制好的成品，按照說明進(jìn)行配制。配制完成后分裝入三角瓶、藍(lán)蓋瓶、試管或培養(yǎng)皿中，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件一般為121C,20min。2 .單項(xiàng)檢測流程1、細(xì)菌總數(shù)：吸取1ml供試液（10-1）移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-2稀釋度菌液，

10、再吸取1ml10-2菌液移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-3稀釋度菌液；分別取1ml各稀釋度菌液移入培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度各用2個(gè)平皿，注入融化并冷至45C±1C左右的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36c±1C培養(yǎng)48h±2h,觀察并記錄。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36C±1C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h,為空白對照。2、耐熱大腸桿菌群：取10mL1:10稀釋的檢液，力口到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44.5C±0.

11、5C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48h,如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為耐熱大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36C±1C培養(yǎng)18h24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白陳水中，置44.5C±0.5C培養(yǎng)24h±2h0經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。在蛋白陳水培養(yǎng)液中，加入靛基

12、質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。3、銅綠假單胞菌：增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)18h24h0如有銅綠假單胞菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基澳化錢瓊脂平板上，置36c±1C培養(yǎng)18h24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基澳化錢瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液

13、劃線接種于平板上，置36C±1C培養(yǎng)24h±2h,銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基呈紅色，其他菌不生長。染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液，在15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗(yàn)陰性。綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落2個(gè)一3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置36C±1C培養(yǎng)24h±

14、2h,加入氯仿3mL5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽陳水培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽陳水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)?。明膠液化試驗(yàn)：取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36c±1C培養(yǎng)24h±

15、;2h,取出放置于4c±2C冰箱10min30min,如仍呈溶解狀或表面溶解時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽性；如凝固不溶者為陰性。42c生長試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于42c±1C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h,銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。5、金黃色葡萄球菌：增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h±2h0分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在BairdParker平板培養(yǎng)基，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置36

16、c±1C培養(yǎng)48h0在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純在血瓊脂平板上，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h0染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直至約為0.5m1mo甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)

17、酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2mm3mm的滅菌液體石蠟，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取1:4新鮮血漿0.5mL,置于滅菌小試管中，加入待檢菌24h±2h肉湯培養(yǎng)物0.5mL?；靹?，置36C±1。叵溫箱或恒溫水浴中，每半小時(shí)觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL,分別加入無菌1:4血漿0.5mL,混勻,作為對照。6、霉菌和酵母菌：吸取1ml供試液（10-1）移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-2稀釋度菌液,再吸取1ml10

18、-2菌液移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-3稀釋度菌液；分別取1ml各稀釋度菌液移入培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度各用2個(gè)平皿，注入融化并冷至45c±1C左右的虎紅培養(yǎng)基，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置28c±2C培養(yǎng)5d,觀察并記錄。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL虎紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置28c±2C培養(yǎng)5d,為空白對照。3檢測全過程圖解oowO。AmS飛(OQOgod。9ml滅菌生理鹽水加入約15ml卵磷混勻、靜置、冷卻、凝固、倒置*脂吐溫80培養(yǎng)基36+1C,48+h計(jì)數(shù)加入約15ml虎紅混勻、靜置、冷卻、凝固、倒置培養(yǎng)基*28±2C,5d計(jì)數(shù)90mlSCDLP液體培養(yǎng)基10ml雙倍乳糖膽鹽快培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基蛋白陳水36±1C,18-24h*有菌生長>44.5+0.5C,24+2h>加入靛基質(zhì)0.5mlM判斷陰陽性,十六烷三甲基漠化鏤瓊脂培養(yǎng)基BairdParker平板培養(yǎng)基*36+1,36+1,結(jié)論四、其他驗(yàn)證1 .凍干菌粉傳代培養(yǎng)購買回來的凍干粉菌種（0代）加入5ml適合增殖培養(yǎng)的培