分子生物學論文

1、摘要：分子生物技術(shù)近幾年來得到了飛速發(fā)展，廣泛應用于環(huán)境微生物的研究，本文詳細介紹了聚合酶鏈式反應技術(shù)，描述了PCR引物是什么以及PCR引物的設(shè)計原則，并且從硝化細菌方面，詳細描述了PC做術(shù)在污水處理方面的應用。關(guān)鍵字：PCR引物，設(shè)計原則，硝化細菌，污水處理Abstract:Molecularbiologicaltechnologyhasbeenrapiddevelopedinrecentyears,widelyusedinthestudyofenvironmentalmicrobiology,Thispaperdescribedpolymerasechainreaction(PCR)tec

2、hniqueindetail,anddescribetheprinciplesofdesignPCRprimers.DescribedTheapplicationofPCRtechnologyinwastewatertreatment.Keywords:PCRprimer,designprinciple,Nitrificationbacteria,wastewatertreatment聚合酶鏈式反應(PolymerasechainreacLion,PCR)20世紀后期發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片斷的技術(shù)，具有快速、簡便及高度敏感等優(yōu)點，能極大地縮短目的基因擴增時間。因此，其一直是生物學者

3、們致力于構(gòu)建cDNA文庫、基因克隆以及表達調(diào)控研究的必要前提和基礎(chǔ)f21。近年來，該技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛應用，并大大推進了分子生物學和相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展。眾所周知，引物設(shè)計是影響PCR式驗的重要參數(shù)之一。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，污水生物處理系統(tǒng)也隨這發(fā)生了改進。污水生物脫氮是污水處理中最重要的環(huán)節(jié)，共包括兩個階段：硝化和反硝化。硝化階段主要利用硝化菌進行處理，如氨氧化菌(AOB亞硝酸鹽氧化菌（NOB痔。保證硝化細菌的存活和穩(wěn)定繁殖是污水生物脫氮的關(guān)鍵所在。所以，利用分子生物技術(shù)對硝化細菌的活性、分布等進行研究，可有效促進污水脫氮系統(tǒng)的穩(wěn)定與發(fā)展。目前，應用最多的分子生物技術(shù)是FISH技術(shù)

4、（熒光標記的原位雜交）與PCR支術(shù)（聚合酶鏈式反應）。1.1 設(shè)計原則1.1.1 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板的序列要緊密互補。引物設(shè)計中，特別需要判斷引物互補配對情況是否影響模板與引物的結(jié)合，這需要估計模板與引物結(jié)合及引物配對結(jié)合的自由能。A,T由2個氫鍵連接，G,C由3個氫鍵連接。一般來說，出現(xiàn)3個堿基的序列互補便有些危險，尤其在引物3末端。若3末端出現(xiàn)3個堿基的序列互補或堿基為GC的2個堿基的序列互補，只好將這個引物放棄，重新設(shè)計fl1.1.2 在選擇用來擴增不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5和3末端非翻譯區(qū)序列。不同物種mRNA的5和3末端非翻譯區(qū)序

5、列可能沒有任何的同源性fl,如果選擇的不同物種DNA序列同源性非常低，那么就無法保證獲得一段或幾段高度保守的序列，將會為引物設(shè)計帶來很大得一段或幾段高度保守的序列，將會為引物設(shè)計帶來很大的困擾，特別是在BLAST比對和PrimerPremier5.0軟件進行評價分析時，各項參數(shù)指標將會遠遠達不到要求，無法充分保證引物設(shè)計的高度敏感性和特異性，更會為后期的RT-PCRM驗帶來諸多麻煩。1.1.3 不同類型引物設(shè)計的特別原則。特異性引物的錯配率很低，甚至為零，其中，RT-PC咫|物最女?跨過1個以上的內(nèi)含子序列；非特異性引物的擴增位點數(shù)要在合適范圍內(nèi)；簡并性引物的簡并性要合適等。2.PCR技術(shù)的應

6、用2基于PC做術(shù)的分析方法在以往的檢測方法中，人們通常是從污水中提取硝化菌，但這種硝化菌的DNA含量很低，為檢測工作帶來了很大麻煩。而PCRK術(shù)能夠大量擴增DNA片段，從而解決了上述問題。2.1 amoA基因與16SrRNA基因如果想要實現(xiàn)硝化菌DNA序列的擴增，首先應提取一段硝化菌帶有進化標記的DNA序列，找出該序列的保守區(qū)，制作出與之匹配的探針。氨氧化菌的帶有進化標記的基因一般是amoA基因與16SrRNA因。2.1.1 amoA基因amoA基因是編碼氨單加氧酶的一種基因，編碼氨單加氧酶是氨氧化菌獨有的胞內(nèi)酶，共有三個基因，分別是amoA,amoB,amoC,而amoA中含有編碼氨單加氧酶

7、的活性位點能夠?qū)⑤^催化成輕胺，為氨氧化菌的成長供應能量。一個氨氧化菌中含有23個amoA,不同的amoA功也不一樣。2.1.2 16SrRNA因研究人員對16SrRNA基因的研究具有劃時代的意義，增加了人們對微生物生長的認識。16SrRNA基因有很強的保守性，根據(jù)微生物中16SrRNA基因的不同可以將微生物分為兩類，古細菌和細菌。許多書籍中對微生物的命名都是根據(jù)不同的16SrRNA基因分析的。一個氨氧化菌中只有一條16SrRN醍因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，從這些差異中可以看出不同氨氧化菌的關(guān)聯(lián)與進化差異。有關(guān)專家對不同氨氧化菌中的amoA基因和16SrRNA基因的排列

8、順序進行研究后發(fā)現(xiàn)，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹都比較相似，正是由于這一相似性，導致用16SrRNA基因制作的探針檢測的精確度受到影響。而amoA由于只在氨氧化菌中存在，盡管它對系統(tǒng)發(fā)育樹影響不大，但由于它的差異性使得利用amoA基因制作的探針精確性與特異性比16SrRNA基因要強，能準確地辨別氨氧化菌的種屬。目前，這兩種探針都只能在自養(yǎng)型氨氧化菌中使用，而無法對實際污水中種群的多樣性進行分析。2.2 PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)PCR一變性梯度凝膠電泳（PCR-DGG膝術(shù)是將利用PCR技術(shù)擴增的DNA片段植入到凝膠中進行電泳的一種技術(shù)。凝膠一般是聚丙烯

9、醐胺凝膠，且加人了梯度變性劑，一般是尿素和甲醐胺。利用PC做術(shù)擴增的DNA片段長度是可控的，可以保證長度的一致性，但是DNA內(nèi)部的堿基排列卻有所不同。在進行電泳時，不同的堿基排列會根據(jù)梯度變性劑濃度的變化而發(fā)生變性,電泳速度越來越慢，最終各自停留在相應的位置，之后對其進行染色，凝膠上就會出現(xiàn)若干條DNA譜帶，一條譜帶就是一個DNA片段。而這種方法經(jīng)常會受到單鏈DNA、探針特異性等的影響，導致檢測結(jié)果不準確。為避免這一影響因素，研究專家經(jīng)常會在測驗后再進行Cloning儻?。┖蚐equencing刎序），以對檢測結(jié)果進行進一步確認，即所謂的PCR-DGGE-cloning-sequencing（

10、PCF變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)）。研究人員利用此技術(shù)對污水處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群進行了研究，發(fā)現(xiàn)在污水處理過程中，氨氧化菌的數(shù)量是會改變的。但是若受到外界因素（如溫度、水質(zhì)）的影響,氨氧化菌的種群結(jié)構(gòu)會發(fā)生較大的改變。研究人員在研究曝氣對污水中硝化細菌的結(jié)構(gòu)與脫氮效率造成的影時注意到，供氧時間的長短對污水中硝化菌的種群結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生一定的影響。經(jīng)過研究，脫氮效率與氨氧化菌的含量以及種群多樣性并無關(guān)系。利用PCF變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)能夠清晰的展示污水處理中硝化菌的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化。然而，凝膠中DNA片段的堿基對一般不超過500,這一片段的序列又要與檢測序列的重合度大于85%,否則就不能對

11、硝化菌進行準確的分類，無法收集有關(guān)硝化菌的數(shù)據(jù)。另外，此技術(shù)的靈敏度不高，凝膠配置濃度不容易掌握，導致此技術(shù)對微生物含量少的種群沒有理想的檢測能力。結(jié)論：1.1 分子生物技術(shù)從細微層面研究了影響污水處理系統(tǒng)中硝化菌生長的條件。1.2 在未來的發(fā)展中，應完善分子生物技術(shù)研究時的具體操作流程，積極引進新技術(shù)、新方法，提高檢測的準確性以及特異性，PC做術(shù)的操作流程應進一步完善，使其能更精確地反映出微生物種群活性與外界環(huán)境的關(guān)系。相信在未來的污水處理中，分子生物技術(shù)會隨著科技的進步，研究方法更方便快捷，在對污水處理系統(tǒng)的檢測中更為穩(wěn)定、精確。參考文獻：C1律磊，曾薇，張悅，楊瑩瑩.分子生物技術(shù)在污水處理系統(tǒng)內(nèi)稍化菌群研究中的應用J.應用與環(huán)境生物學報，2010(1):135142.2朱文優(yōu)，張忠剛.分子生物學技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應用