--疏水作用色譜

1、第九節(jié)疏水作用色譜疏水作用色譜（HydrophobicinteractionchromatographyHIC）是采用具有適度疏水性的填料作為固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，利用溶質(zhì)分子的疏水性質(zhì)差異從而與固定相間疏水相互作用的強(qiáng)弱不同實(shí)現(xiàn)分離的色譜方法。關(guān)于在疏水作用色譜條件下進(jìn)行分離的概念最早在1948年就由Tiselius提出，該技術(shù)真正得到發(fā)展和應(yīng)用是在20世紀(jì)70年代早期開發(fā)出一系列適合進(jìn)行疏水作用色譜的固定相以后。此后隨著新型色譜介質(zhì)的開發(fā)生產(chǎn)和對(duì)機(jī)理認(rèn)識(shí)的逐步深人，該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，并且隨著高效疏水作用色譜介質(zhì)的出現(xiàn)，HIC已在HPLC平臺(tái)上被使用，稱為高效疏水作用色譜（

2、HighperformancehydrophobicinteractionchromatographyHP-HIC）。由于疏水作用色譜的分離原理完全不同于離子交換色潛或凝膠過濾色譜等色譜技術(shù)，使得該技術(shù)與后兩者經(jīng)常被聯(lián)合使用分離復(fù)雜的生物樣品。目前該技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。一、疏水作用色譜基本原理（一）疏水作用疏水作用是一種廣泛存在的作用，在生物系統(tǒng)中扮演著重要角色，它是球狀蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成、寡聚蛋白亞基間結(jié)合、酶的催化和活性調(diào)節(jié)、生物體內(nèi)一些小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合等生物過程的主要驅(qū)

3、動(dòng)力，同時(shí)也是磷脂和其他脂類共同形成生物膜雙層結(jié)構(gòu)并整合膜蛋白的基礎(chǔ)。根據(jù)熱力學(xué)定律，當(dāng)某個(gè)過程的自由能變化（4G）為負(fù)值時(shí)，該過程在熱力學(xué)上是有利的，能夠自發(fā)發(fā)生，反之則不能。而根據(jù)熱力學(xué)公式GMH-TzXS（6.9-1）式中，4G是由該過程的除變（4H）,嫡變（$）和熱力學(xué)溫度（T）決定的。當(dāng)疏水性溶質(zhì)分子在水中分散時(shí)，會(huì)迫使水分子在其周圍形成空穴狀結(jié)構(gòu)將其包裹，此有序結(jié)構(gòu)的形成會(huì)導(dǎo)致嫡的減小（S<0）,致使G為正值，在熱力學(xué)上不利。在疏水作用發(fā)生時(shí)，疏水性溶質(zhì)分子相互靠近，疏水表面積減少，相當(dāng)一部分水分子從有序結(jié)構(gòu)回到溶液相中導(dǎo)致嫡值增加（S>0）,引入了負(fù)的G,從而在熱力學(xué)

4、上有利。因此非極性分子間的疏水作用不同于其他的化學(xué)鍵，而是由自由能驅(qū)動(dòng)的疏水分子相互聚集以減少其在水相中表面積的特殊作用（二）生物分子的疏水性對(duì)于小分子物質(zhì)，根據(jù)其極性的人小可以分為親水性分子和疏水性分子，一般來說親水性的小分子是很難與HIC介質(zhì)發(fā)生作用的。但對(duì)于疏水作用色譜的主要對(duì)象生物大分子如蛋白質(zhì)而言，其親水性或疏水性是相對(duì)的，即使是親水性分子也會(huì)有局部疏水的區(qū)域，從而可能與HIC介質(zhì)發(fā)生疏水作用，因此能夠根據(jù)其疏水性的相對(duì)強(qiáng)弱不同進(jìn)行分離。以蛋白質(zhì)為例，球狀蛋白質(zhì)在形成高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，總體趨勢是將疏水性氨基酸殘基包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而將親水性氨基酸殘基分布在分子表面。但實(shí)際上真正能完全包裹

5、在分子內(nèi)部的氨基酸側(cè)鏈僅僅占總氨基酸側(cè)鏈數(shù)的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的數(shù)量和種類，以及部分肽鏈骨架的疏水性所決定的。因而可以認(rèn)為蛋白質(zhì)分子表面含有很多分散在親水區(qū)域內(nèi)的疏水區(qū)（疏水補(bǔ)?。?，它們在HIC過程中起著重要的作用。然而研究表明不同的球狀蛋白質(zhì)的疏水表面占分子表面的比例差異并不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白質(zhì)，其在HIC中的色譜行為卻可能有很大的差別。造成這一現(xiàn)象的原因是蛋白質(zhì)分子表面的不規(guī)則性，即使是球狀蛋白質(zhì)，其分子表面也遠(yuǎn)非平滑球面，而是粗糙而復(fù)雜的，由于空間位阻的關(guān)系，有些疏水補(bǔ)丁是無法與HIC介質(zhì)發(fā)生作用

6、的，因此蛋白質(zhì)在HIC中的色譜行為不僅取決于分子表面疏水區(qū)的大小和疏水性的強(qiáng)弱，還取決于其疏水區(qū)在分子表面的分布。（二）生物分子與疏水作用色譜介質(zhì)間的作用HIC介質(zhì)是在特定的基質(zhì)如瓊脂糖上連接疏水配基如烷基或芳香基團(tuán)組成的。HIC介質(zhì)與具有疏水性的生物分子間的作用被認(rèn)為與疏水性分子在水溶液體系中的自發(fā)聚集一樣，是由嫡增和白由能的變化所驅(qū)動(dòng)的。鹽類在疏水作用中起著非常重要的作用，高濃度鹽的存在能與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致可以在疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進(jìn)了疏水性分子與色譜介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。因此在HIC過程中，在樣品吸附階段采用高鹽濃度的溶液，使得目標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱中，而在洗

7、脫階段，采用降低洗脫劑中鹽濃度的方式使溶質(zhì)與色譜介質(zhì)間的疏水作用減弱，從而從色譜柱中解吸而被洗脫下來。對(duì)于以芳香基團(tuán)作為疏水配基的色譜介質(zhì)來說，還存在潛在的發(fā)生冗-冗作用的可能當(dāng)待分離物質(zhì)表面具有芳香基時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出疏水作用和冗-冗作用的混合分離模式。較大的生物分子與色譜介質(zhì)發(fā)生結(jié)合時(shí)的情況是比較復(fù)雜的，一般來說每個(gè)分子被吸附的過程都會(huì)有一個(gè)以上的配基參與，換句話說，分子在色譜介質(zhì)上發(fā)生的結(jié)合是多點(diǎn)結(jié)合。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)吸附過程是多步反應(yīng)過程，其中的限速步驟并非酶與色譜介質(zhì)接觸的過程，而是酶在色譜介質(zhì)表面發(fā)生緩慢的構(gòu)象改變和重新定向的步驟。（四）疏水作用色譜與反相色譜的區(qū)別從理論上看，HIC和RPC

8、是兩種密切相關(guān)的液相色譜技術(shù)，它們都是基于生物分子表面的疏水區(qū)域與色譜介質(zhì)上的疏水配基（烷基或芳香基）之間的疏水相互作用，然而在分子水平的色譜機(jī)理以及實(shí)踐層面上這兩種技術(shù)是有所不同的。RPC介質(zhì)上疏水配基的取代程度大大高于HIC介質(zhì)。RPC介質(zhì)可以認(rèn)為是連續(xù)的疏水相，其配基如C4Ci8烷基的取代程度通常在數(shù)百微摩/rnL凝膠；而HIC介質(zhì)上配基如C2C8烷基或簡單芳香基的取代程度通常在1050mmol/mL凝膠范圍內(nèi)，可以看作是不連續(xù)（低密度分布）的疏水相，在與生物分子結(jié)合時(shí)由一個(gè)或數(shù)個(gè)配基參與。那么很顯然，疏水溶質(zhì)與RPC介質(zhì)間的作用力要比HIC介質(zhì)強(qiáng)得多，需要使用有機(jī)溶劑梯度等劇烈的洗脫條

9、件才能將溶質(zhì)從色譜柱中洗脫下來，對(duì)于球狀蛋白質(zhì)，在這樣劇烈的洗脫條件下往往會(huì)發(fā)生變性，因此RPC更適合在水-有機(jī)溶劑體系中具有良好穩(wěn)定性的肽和小分子蛋白質(zhì)的分離純化。而HIC過程的洗脫條件要溫和得多，通常降低洗脫劑的鹽濃度就能達(dá)到目的，因此HIC既利用了蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)，又能夠在更為極性和低變性的環(huán)境中進(jìn)行，因而在蛋白質(zhì)的純化中有著更為廣泛的應(yīng)用。盡管這兩種技術(shù)都是利用生物分子的疏水性質(zhì)進(jìn)行分離，但由于在吸附的分子機(jī)理上存在差異，它們對(duì)于同一組樣品的選擇性往往是不同的。例如，有人研究用疏水色譜柱TSKGelPhenyl-5-PW和反相色譜柱SynChropak對(duì)12種常見蛋白質(zhì)進(jìn)行色譜，對(duì)選擇

10、性作了比較，如表6.9-1所示，各種蛋白質(zhì)被洗脫的順序全然不同。表6.9-112種蛋白質(zhì)在疏水色譜柱和反相色譜柱中的選擇性比較最白庖珅英假TSKGPhenyl-tPW也樂色南柱力中的保M時(shí)間min在SynCKgpik反相色拙U6里益（色素C以61舞白機(jī)紅城在也8總精搐幗茂A1007偉清31口機(jī)317.1陽消如有5ia.s港浦然隊(duì)3產(chǎn)即都結(jié)仔薛06軋3嘴般丸俄白13.6隹貓乳熊白海第出116.3乳過低北朝醉19.5缸3中清白班百維$如W1軋6疏水作用色譜：色譜柱尺寸55mmx200mm,流動(dòng)相A為含1.0mol/LNaSO4的1mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.0）,流動(dòng)相B為10mmol/L磷

11、酸鉀緩沖液（pH7.0）,梯度為20min內(nèi)0100%B,流速為1mL/min。反相色譜：色譜柱尺寸4.6mmx50mm,流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液（pH2.0）,流動(dòng)相B為含0.1%TFA的60%異丙醉溶液，梯度為20min內(nèi)0100%B,流速為1mL/min。（五）影響疏水作用色譜過程的參數(shù)影響疏水作用色譜過程的因素來自于固定相類型、流動(dòng)相組成和色譜條件。1 .固定相固定相條件，包括采用基質(zhì)的類型、配基的種類和取代程度都會(huì)影響對(duì)樣品的分離效果，這也是色譜時(shí)合理選擇色譜介質(zhì)的依據(jù)。疏水配基的種類直接決定著目標(biāo)分子在色譜時(shí)的選擇性，是選擇疏水作用色譜介質(zhì)時(shí)首先要考慮的問題。常見的配基包括烷

12、基和芳香基兩大類，其中烷基配基與溶質(zhì)問顯示出單純的疏水作用，而芳香族配基往往由于和溶質(zhì)問存在冗-冗作用而呈現(xiàn)出混合模式的分離行為。對(duì)于烷基配基，烷基的鏈長決定著色譜介質(zhì)疏水性的強(qiáng)弱，同時(shí)還影響著色譜介質(zhì)的結(jié)合容量。在其他條件相同的情況下，HIC介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合容量隨著烷基鏈長的增加而增加。在配基種類確定的情況下，取代程度的高低決定著HIC介質(zhì)的結(jié)合容量和疏水作用強(qiáng)度。在色譜介質(zhì)上配基取代程度較低時(shí)，隨著取代程度的增加。色譜介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合容量會(huì)增加，這是由于配基數(shù)量的增加使得蛋白質(zhì)在色譜介質(zhì)表面的結(jié)合位點(diǎn)增多，從而單位體積的色譜介質(zhì)能夠吸附更多的溶質(zhì)分子。但是當(dāng)取代程度達(dá)到一定數(shù)值后，結(jié)合

13、容量就會(huì)趨于穩(wěn)定，此時(shí)進(jìn)一步提高取代程度并不能再增加結(jié)合容量。這是由于空間位阻決定了單位色譜介質(zhì)表面只能結(jié)合特定數(shù)量的蛋白質(zhì)，因此當(dāng)這些表面飽和后結(jié)合容量就不再隨取代程度而變化了。但是需注意的是取代程度的進(jìn)一步上升將會(huì)使得與每個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生作用的配基數(shù)量增加，從而使蛋白質(zhì)更為牢固地結(jié)合于色譜介質(zhì)上而難以洗脫?；|(zhì)同樣會(huì)對(duì)色譜結(jié)果產(chǎn)生影響，具有相同配基種類和取代程度但不同基質(zhì)的吸附劑會(huì)具有不同的選擇性。通常HIC介質(zhì)所采用的是高度親水性的基質(zhì)。2 .流動(dòng)相流動(dòng)相條件對(duì)HIC的影響主要表現(xiàn)在所用鹽的種類和濃度、流動(dòng)相的pH,以及其他添加劑的影響。HIC過程是在高鹽濃度下實(shí)現(xiàn)樣品的吸附，而后在低鹽濃度

14、下完成洗脫過程。顯然，流動(dòng)相中鹽的種類和濃度是HIC中至關(guān)重要的參數(shù)。不同的離子，特別是陰離子在HIC中的作用是不同的。有些離子存在于溶液中時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，它們能夠增加疏水作用；而另一些離子的存在卻會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為促溶鹽類，它們的存在會(huì)破壞疏水作用。Hofmeister系列指出了不同離子對(duì)疏水作用的影響（表6.9-2）,表中左邊的離子能夠促進(jìn)疏水作用，因而經(jīng)常在HIC中使用，而右邊的離子屬于促溶離子，它們能破壞疏水作用，有時(shí)在對(duì)色譜介質(zhì)進(jìn)行清洗時(shí)可以用來洗脫一些結(jié)合特別牢固的雜質(zhì)。表6.9-2不同離子對(duì)疏水作用強(qiáng)弱產(chǎn)生影響的Hofmeister系列*白-:iif磕析）初加AM&

15、gt;porsoj-.CHiCCKTTcriBr|N（YCJ'SCfT留白（洛城一墻加一在所用鹽的種類已經(jīng)確定的情況下，鹽濃度的高低會(huì)影響到溶質(zhì)分子與色譜介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度及色譜介質(zhì)的結(jié)合容量。鹽濃度的升高能促進(jìn)疏水作用，因此HIC通常都是在高鹽濃度下加樣并完成吸附，而通過降低洗脫劑中鹽濃度的方法進(jìn)行洗脫。除此之外，色譜過程的起始鹽濃度的高低還會(huì)影響色譜介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合容量。流動(dòng)相的pH對(duì)色譜行為的影響比較復(fù)雜。多數(shù)情況下pH升高會(huì)使得疏水作用減弱，而降低pH則增強(qiáng)此作用力，但是對(duì)于一些等電點(diǎn)較高的蛋白質(zhì)，在高的pH下卻能夠牢固地結(jié)合在HIC介質(zhì)上。流動(dòng)相中的其他添加劑主要指能夠減弱疏水

16、作用的醇類、去污劑、促溶鹽類等，它們的存在能有效地將溶質(zhì)分子從HIC介質(zhì)上洗脫下來，同時(shí)它們還會(huì)影響分離過程的選擇性。但是它們的存在一般會(huì)破壞蛋白質(zhì)等生物大分子的本間結(jié)構(gòu)，使后者喪失部分或全部活性，所以在HIC過程中盡量避免使用此類試劑。3.色譜條件除了固定相和流動(dòng)相之外，色譜過程中的一些其他條件，例如溫度、流速等也會(huì)影響到色譜結(jié)果。其中溫度對(duì)HIC的影響比較復(fù)雜，根據(jù)疏水性溶質(zhì)在水相中相互作用的理論，一方面疏水作用隨溫度的升高而增強(qiáng)，但另一方面溫度的升高會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)和在水中的溶解性等產(chǎn)生影響，從而表現(xiàn)為復(fù)雜的特征，由于溫度對(duì)疏水作用的明顯影響，在執(zhí)行一個(gè)特定的色譜任務(wù)時(shí)應(yīng)當(dāng)維持恒定的

17、溫度。流速對(duì)HIC的影響與其他色譜技術(shù)類似，然而由于HIC的分離對(duì)象主要是蛋白質(zhì)這類大分子。對(duì)流速的敏感性相對(duì)較低，因此流速的選擇主要考慮分離時(shí)間和色譜介質(zhì)類型等因素。二、疏水作用色譜介質(zhì)（一）疏水作用色譜介質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)HIC介質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其他吸附技術(shù)所用的吸附劑類似，由作為骨架的基質(zhì)和參與疏水作用的配基。許多類型的基質(zhì)都可以用來合成HIC介質(zhì)，但是使用最為廣泛的是瓊脂糖、硅膠和有機(jī)聚合物等。瓊脂糖凝膠是很早就被采用的一種基質(zhì)，至今仍被大范圍地使用，具優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，表面經(jīng)基密度非常大，衍生化后可以產(chǎn)生取代程度和結(jié)合容量較大的HIC介質(zhì)，并且其大孔結(jié)構(gòu)可以容納體積很大的分子，適合于大分子蛋白質(zhì)的

18、分離，而且pH穩(wěn)定性良好。硅膠的特點(diǎn)是硬度大，夠承受很高的流速和壓力，有良好的機(jī)械穩(wěn)定性，能適合于在HP-HIC系統(tǒng)中使用。但是其表面可供衍生的基團(tuán)少，pH穩(wěn)定性也差（pH28范圍內(nèi)穩(wěn)定），因此其應(yīng)用受到了限制。但隨后誕生了聚合物包裹技術(shù)，在硅膠或其他有機(jī)聚合物表面包裹一層帶有可衍生基團(tuán)的高分子材料，從而克服了硅膠基質(zhì)的上述缺點(diǎn)，使其具備良好的色譜性能而被廣泛地使用。HIC介質(zhì)所用的疏水配基分為烷基和芳香基，與反相色譜介質(zhì)相比，其烷基通常在C8以下，而很少使用疏水性更強(qiáng)的具有更長碳鏈的烷基，芳香基則多為苯基。圖6.9-1顯示了幾種經(jīng)常使用的疏水配基連接至基質(zhì)的情況。OH(b)辛基(c)葷荔W新

19、戊基圖6.9-1偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型方框內(nèi)部分為疏配基；斜杠部分代表基質(zhì)；剩余部分是將配基連接至基質(zhì)的基團(tuán)將疏水配基偶聯(lián)至基質(zhì)的方法視基質(zhì)的表面基團(tuán)而定，其中最有代表性的是羥基，瓊脂糖基團(tuán)帶有大量的羥基、而硅膠及其他聚合物基質(zhì)也會(huì)因表面包裹修飾后帶上羥基。將疏水配基連接至羥基通常是使用帶有環(huán)氧化物基團(tuán)的配基分子與羥基發(fā)生成醴反應(yīng)而形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，環(huán)氧化物基團(tuán)反應(yīng)后開環(huán)形成配基與基質(zhì)之間的連接部分。OH/EF曲OI式中R疏水配基；M基質(zhì)。通過調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可以方便地控制所得疏水作用色譜介質(zhì)的配基密度。(二)常見疏水作用色譜介質(zhì)的種類表6.9-3列出了部分已經(jīng)商品化的HIC介質(zhì)(包括部

20、分色譜柱)的類型及特性。表6.9-3部分商品化的HIC介質(zhì)和色譜柱的類型及特性產(chǎn)晶名*昵率學(xué)費(fèi)特性福統(tǒng)也架J,T.lUktrHIFropyl由慕瞎赭班康,郎猱l5j!E和電tn.亂15ZUtitn加27nmMmhrJHK甲茶%闋舁r加熊，履徑5%足r-BviylHIC丁堇露質(zhì)異JR津1駝稅8加EPhftfnraaciftPhenylScphiTOM««希端燎曲箭，較捶MptnButylStphiroae4Rr«基質(zhì)用軀精無艷州15班U1(Jciy!Stpharn虹CL-4B擎屋年姐尊胎款.粒越45一1*umPhtnylStphAroftrCL-1B«&#

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24、cHlNT二解M質(zhì)跋股,收租期小孔稅lOfimSynChromS抑iChm網(wǎng)k內(nèi)削.瞿內(nèi)星，軍M莒JS辟股，依艷班皿扎他MMmFiber5-PW稟聚乙二牌啊W*Phenyl-5-PW笨耳EQym,孔鞋lOQnltoButylNPRT*敕柱乜5pmr無孔5YMCVMCTicK-HIC攵軍聚俄蕨包，西*事盾破或，寂糧瓦爾皿fL艷釉廂)新書分陶色諾介質(zhì)MiHiporeMtmStpchnwwoa叫飽,cAFiri&&POHOSPH笨條而電化的再生好推索迷域冏狀軸枸tL電m孔Pemplivc%”悄七皿POKOSPEFCJKOSBU弟基1£PS/DYB累戟，用交基景昌基鐵臺(tái)物也盛

25、,大孔4POROSETft三、疏水作用色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)（一）疏水作用色譜介質(zhì)的選擇和色譜柱的準(zhǔn)備由于HIC介質(zhì)的基質(zhì)類型、疏水配基類型和取代程度都會(huì)影響到色譜行為，因此在選擇疏水作用色譜介質(zhì)種類時(shí)對(duì)這些因素都需要進(jìn)行考慮。基質(zhì)的類型會(huì)影響疏水作用色譜介質(zhì)的選擇性，但這種對(duì)選擇性的影響往往是難以預(yù)測的，因此確定疏水作用色譜介質(zhì)時(shí)帶有經(jīng)驗(yàn)性。然而色譜過程中需要采用的流速和承受的壓力在選擇基質(zhì)種類時(shí)必須予以考慮，若操作過程在HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行，則應(yīng)當(dāng)選用機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)。止匕外，若待分離物質(zhì)是分子量很大的蛋白質(zhì)，并且樣品量也較大，則應(yīng)當(dāng)選擇大孔型基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠，這樣能夠獲得較高的結(jié)合容量；若待

26、分離物質(zhì)為較小的分子，或者樣品量很小，但對(duì)于分辨率的要求較高，則可以考慮選用孔徑較小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)，以便獲得較高的柱效和良好的分辨率。疏水配基類型和取代程度實(shí)際上決定了色譜介質(zhì)的疏水性強(qiáng)弱和結(jié)合容量的高低，配基（烷基）鏈越長，取代程度越高，則疏水性越強(qiáng)；反之，鏈長越短，取代程度低，則疏水性越弱。在HIC介質(zhì)中，烷基配基的鏈長大多在C4C8,苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，不過由于可能與溶質(zhì)發(fā)生兀-冗相互作用，它與戊基有著不同的選擇性，寡聚乙二醇固定相的疏水性界于丁基與苯基之間。選用何種疏水程度的色譜介質(zhì)，最終依據(jù)是目標(biāo)分子的疏水性強(qiáng)弱，總體趨勢是在分離疏水性弱的分子時(shí)選用疏水性強(qiáng)的色譜介質(zhì)，

27、分離疏水性強(qiáng)的分子時(shí)選用疏水性弱的色譜介質(zhì)。如果目標(biāo)分子疏水性很弱，在分離時(shí)需要確保有足夠強(qiáng)的疏水作用使其能夠與色譜介質(zhì)發(fā)生結(jié)合，提高結(jié)合時(shí)流動(dòng)相的鹽濃度是增加疏水作用的方法之一，但如果色譜介質(zhì)本身疏水性不夠強(qiáng)，單方面提高鹽濃度將是事倍功半，并且疏水作用色譜時(shí)鹽的消耗量很大，鹽濃度的高低直接關(guān)系到分離過程的成本，另外含高濃度鹽類的廢水在排放時(shí)涉及環(huán)保問題，因此在可能的情況下，人們更愿意采用鹽濃度較低的流動(dòng)相，此時(shí)選用配基鏈長更長，取代程度更高因而有著更強(qiáng)疏水性的固定相將是十分有效的手段。反之，如果日標(biāo)分子疏水性很強(qiáng)，則應(yīng)當(dāng)考慮該分子是否會(huì)與色譜介質(zhì)結(jié)合得過于牢固而難以洗脫，一般的考察方法是用不

28、含鹽的緩沖液作為流動(dòng)相，看是否能夠?qū)⒛繕?biāo)分子從色譜柱中洗脫，對(duì)于特別難以洗脫的物質(zhì)，原則上通過往流動(dòng)相中加入非極性溶劑可以達(dá)到洗脫目的，但是對(duì)于蛋白質(zhì)等生物分子，有機(jī)溶劑的添加很容易造成其失活，因此在這種情況下，人們更愿意選用疏水性較弱的色譜介質(zhì)以減弱溶質(zhì)與色譜介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度。由于在第一次進(jìn)行色譜時(shí)，樣品中目標(biāo)分子的疏水性并不能確定，因此在選擇色譜介質(zhì)前可以進(jìn)行一次預(yù)備實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜介質(zhì)進(jìn)行篩選。具體的方法一般是選出疏水性強(qiáng)弱存在明顯差異的幾種色譜介質(zhì)填充成很小規(guī)模的色譜柱，以含有1mol/L硫酸錢的緩沖液作為流動(dòng)相A,不含鹽的緩沖液作為流動(dòng)相B,采用鹽濃度下降的線性梯度進(jìn)行洗脫，觀察目標(biāo)分子與固

29、定相結(jié)合及被洗脫的情況來確定合適的色譜介質(zhì)。在色譜柱的選擇方面，由于疏水作用色譜屬于吸附色譜技術(shù)，一般采用較粗而短的色譜柱，其中柱長的選擇一定程度上取決于所需的分辨率，而柱內(nèi)徑的大小與分離樣品的規(guī)模有關(guān)。（二）樣品的準(zhǔn)備與其他色譜技術(shù)相比，HIC在樣品準(zhǔn)備方面的要求比較低，一般來說，往色譜柱中加樣前無需改變樣品的緩沖液體系，所需采取的措施是往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)到與流動(dòng)相A中基本一致，并根據(jù)需要調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件。往樣品中添加鹽時(shí)既可以以固體形式加入，也可以以濃縮鹽儲(chǔ)液形式加入，前一種方式有時(shí)會(huì)因?yàn)榫植葵}濃度過大導(dǎo)致出現(xiàn)沉淀，因此后一種加鹽方式更為人們

30、所常用。需要注意的是，有時(shí)為了確保目標(biāo)分子發(fā)生吸附，需要很高的鹽濃度條件，但在此鹽濃度下部分樣品組分會(huì)發(fā)生沉淀，為了解決此矛盾，可以采取樣品如溶液中鹽濃度適當(dāng)?shù)陀诹鲃?dòng)相A中鹽濃度的方式。加樣前色譜柱先用流動(dòng)相A充分平衡，加樣時(shí)雖然樣品中鹽濃度較低，但樣品進(jìn)入鹽濃度較高的色譜柱后還是能有效發(fā)生吸附。與其他吸附色譜技術(shù)類似，HIC的樣品體積主要受到樣品中組分濃度和色譜介質(zhì)的結(jié)合容量的影響。對(duì)于稀釋樣品無需濃縮可以直接加樣。但如果遇到上述樣品溶液鹽濃度低于流動(dòng)相A的情況時(shí)一次加樣體積不能太大，否則無法確保樣品有效吸附，此時(shí)如果樣品體積較大?？梢圆捎脤悠贩肿鋈舾煞葸M(jìn)行加樣的方式，加完一份樣品后用一定

31、體積的流動(dòng)相A通過色譜柱，重新提高柱中鹽濃度，使組分完成吸附，再進(jìn)行下一份樣品的加樣，如此循環(huán)直到樣品添加完畢對(duì)于所有色譜實(shí)驗(yàn)，黏度過大的樣品均會(huì)導(dǎo)致色譜結(jié)果不理想，遇到這種情況，同樣可以通過稀釋的方法降低樣品貓度。另外在加樣前樣品中如有顆粒狀物質(zhì)，必須通過過濾或離心的方法除去。（三）色譜條件的確定和優(yōu)化確定色譜條件的目標(biāo)是在目標(biāo)分子達(dá)到所需純度的基礎(chǔ)上，獲得盡可能高的回收率，同時(shí)力求縮短分離所需時(shí)間、降低分離成本等。在HIC中，色譜條件主要包括流動(dòng)相A、流動(dòng)相B、洗脫方式、色譜柱的柱長、流速、溫度等。流動(dòng)相A是色譜的起始條件，在絕大多數(shù)情況下，人們采用使目標(biāo)分子結(jié)合至色譜柱而疏水性較弱的雜質(zhì)

32、不被吸附而穿透的方式。此時(shí)需要確定的是流動(dòng)相A中緩沖液的種類、鹽的種類和濃度、pH等條件。確定緩沖液的種類主要考慮所需采用的pH,緩沖液在此pH附近必須具備強(qiáng)的緩沖能力，此外所用緩沖鹽不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性造成不利影響。由于流動(dòng)相中鹽濃度主要依靠額外添加的鹽類維持，緩沖液中緩沖鹽本身的濃度一般不需要很高，通常0.010.05mol/L,僅需具有足夠的緩沖能力即可。不同鹽類疏水作用的影響在前面已經(jīng)討論過，在HIC中最有效并且使用最廣泛的鹽是（NH4）2SO4和Na2SO4,此外NaCl有時(shí)也被使用，不同鹽類除了對(duì)疏水作用的強(qiáng)度有影響外，在色譜中表現(xiàn)出的選擇性也會(huì)不盡相同。所以鹽的濃度也隨樣品中目標(biāo)

33、分子的疏水性而異，使用（NH4）2SO4作為色譜鹽時(shí)常用的濃度為0.752mol/L,使用NaCl時(shí)濃度多在14mol/L。在理想的狀態(tài)下，所選擇的鹽的種類和濃度應(yīng)當(dāng)能夠使得目標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱上，而主要的雜質(zhì)成分不被吸附而穿過色譜柱。在試探性實(shí)驗(yàn)中，1mol/L的（NH4”SO4是常用的條件，根據(jù)洗脫后的出峰情況再對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。如果目標(biāo)分子在洗脫過程的早期就從色譜柱中洗脫，可以適當(dāng)提高流動(dòng)相A中鹽的濃度，當(dāng)然也可換用疏水性較強(qiáng)的色譜介質(zhì)；如果目標(biāo)分子在洗脫過程中很晚才被洗脫，則可以適當(dāng)降低流動(dòng)相A中的欲濃度，或者換用疏水性較弱的色譜介質(zhì)。流動(dòng)相A的pH條件對(duì)吸附過程至關(guān)重要，它直接影響著目標(biāo)

34、分子在色譜介質(zhì)上的結(jié)合強(qiáng)度及分離過程的選擇性。但是pH對(duì)色譜結(jié)果的影響并不存在一般規(guī)律，因此色譜操作大多是在能夠使目標(biāo)蛋白保持良好穩(wěn)定性的pH條件下進(jìn)行的。如果在這種pH下目標(biāo)蛋白與色譜介質(zhì)不能有效結(jié)合，或者色譜結(jié)果選擇性不佳，可以考慮對(duì)色譜過程的pH進(jìn)行優(yōu)化，即分別在具有不同pH的流動(dòng)相條件下進(jìn)行色譜分離，確定分離過程的最佳pH。當(dāng)然這個(gè)過程也必須考慮到目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，確保色譜分離后目標(biāo)蛋白有足夠高的活性回收率。當(dāng)樣品被添加至色譜柱，并用12個(gè)柱體積的流動(dòng)相A通過色譜柱完成樣品的吸附過程后，就要對(duì)吸附樣品進(jìn)行洗脫了。HIC中將樣品洗脫的方式主要有3種：采用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫，隨著

35、鹽濃度的下降，樣品組分與色譜介質(zhì)間的疏水作用不斷減弱從而各組分按疏水性由弱到強(qiáng)的順序被洗脫，這是HIC中最常用的洗脫方式；通過往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑，例如，乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫，極性的降低會(huì)大大減弱疏水作用，從而使得一些與色譜介質(zhì)問存在強(qiáng)疏水作用，較難被洗脫的組分從色譜介質(zhì)上解吸而被洗脫，這種方式常常與第一種方式結(jié)合使用，即洗脫過程中在降低鹽濃度的同時(shí)逐漸增加有機(jī)溶劑的濃度，但由于溶劑的存在往往對(duì)生物大分子的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，因此這種洗脫方式僅限于在溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)的分離；往流動(dòng)相中添加去污劑等試劑進(jìn)行洗脫，去污劑本身能與色譜介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其

36、上的目標(biāo)組分置換下來，但是去污劑一般會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，并且有的與色譜介質(zhì)結(jié)合過于牢固而難以被清洗下來，對(duì)色譜介質(zhì)的再次使用非常不利，因此這種洗脫方式有較大的局限性，一般在分離膜蛋白時(shí)會(huì)采用。對(duì)于最為常用的降低鹽濃度的洗脫方式，又可分為梯度洗脫和階段洗脫，具概念在離子交換色譜等節(jié)中已有闡述。在進(jìn)行試探性實(shí)驗(yàn)時(shí)首選梯度洗脫，并且一般采用簡單下降的線性梯度，梯度的終點(diǎn)即流動(dòng)相B多為不含鹽的與流動(dòng)相A具有相同pH的緩沖液。一方面，梯度的斜率直接影響著色譜過程的分辨率，斜率較低的梯度能產(chǎn)生好的分辨率，但是另一方面，如果洗脫過程都是從100%的流動(dòng)相A（或者表示為0%流動(dòng)相B）過渡到100%的流動(dòng)相

37、B,斜率降低會(huì)使分離所需時(shí)間延長。解決這一矛盾的方法有兩種，一種是在試探性實(shí)驗(yàn)后對(duì)梯度進(jìn)行優(yōu)化，采用復(fù)合梯度，在目標(biāo)分子的洗脫峰附近降低梯度斜率以獲得足夠的分辨率，而在其他部分提高梯度斜率以縮短色譜時(shí)間，當(dāng)然這些部分組分間的分辨率會(huì)變差，但不會(huì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生影響（圖6.9-2a）。另一種優(yōu)化方法是采用低的梯度斜率，同時(shí)根據(jù)首次色譜分離時(shí)目標(biāo)分子的出峰位置適當(dāng)降低流動(dòng)相A中的鹽濃度或增加流動(dòng)相B中的鹽濃度，這樣由于梯度的范圍變窄，所需時(shí)間也會(huì)縮短，從而彌補(bǔ)斜率降低對(duì)分離時(shí)間產(chǎn)生的不利影響。對(duì)于特別復(fù)雜的樣品，還能采用凹形、凸形等更為復(fù)雜的梯度形式以達(dá)到滿意的分辨率。階段洗脫的優(yōu)脫問樣有一足的優(yōu)勢

38、在于操作簡單，不同批次間重復(fù)性良好，因此在大規(guī)模分離純化中較常使用。在分析型分離時(shí)只要流動(dòng)相條件選擇恰當(dāng)，階段洗脫同樣有一定的優(yōu)勢，可以縮短分離時(shí)間，得到濃度較高的分離后產(chǎn)物，同時(shí)也能提高分辨率，因?yàn)殡A段洗脫相當(dāng)于在每一階段內(nèi)部采用斜率為零的梯度進(jìn)行洗脫（圖6.9-2b）。同聚用K合悌度冼脫洗脫體粗優(yōu)脫體貌b采用冊壁跑蛻圖6.9-2根據(jù)試探性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)洗脫進(jìn)行優(yōu)化陰影部分代表目標(biāo)分子的洗脫峰；直線代表洗脫過程中鹽濃度的變化在HIC過程中溫度對(duì)色譜結(jié)果的影響是顯著的，這是由于溫度升高會(huì)增加疏水作用這在前面已經(jīng)提到過。因此從溶質(zhì)結(jié)合至色譜介質(zhì)的角度看，升高溫度是有利的，但是蛋白質(zhì)等生物大分子在較高溫度下會(huì)發(fā)生變性，所以事實(shí)上HIC過程并不主張?jiān)谏邷囟鹊臈l件下進(jìn)行。但是對(duì)于特定的分離任務(wù)，操作過程的溫度需要保持恒定，這樣才能確保色譜結(jié)果具有良好的重復(fù)性。（四）色譜介質(zhì)的再生、清洗和儲(chǔ)存對(duì)于不同類型的色譜介質(zhì)，再生和清洗的方法有所不同。最常規(guī)的再生方法是在洗脫過程完成后用蒸儲(chǔ)水清洗，如果有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在色譜介質(zhì)上則需