免疫共沉淀步驟

1、在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input是斷裂后的基因組DNA,需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測(cè)。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟。1.1.1免疫沉淀1)蛋白提取(1)取10盤長(zhǎng)滿10cm大皿的HepG2細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，吸凈PBS殘液。(2)加預(yù)冷的裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑)至培養(yǎng)皿中(每皿500-1000ul),冰上孵

2、育30min。(3)用細(xì)胞刮刮取，收集細(xì)胞裂解液并移至離心管，4c離心13,000g,10min。(4)將上清移至新離心管中，可用于蛋白濃度測(cè)定或遠(yuǎn)期研究。2)準(zhǔn)備磁珠(1)將proteinA和proteinG珠子分別搖晃5min混懸，各吸取50ul珠子到1.5mlEP管中，組成100ul珠子混合物。(2)小離心機(jī)離心20-30s,去上清。3)結(jié)合抗體(1)將肝細(xì)胞癌患者血清20ul和200ulAbBinding&WashingBuffer加入上述EP管中。(2)室溫旋轉(zhuǎn)10min孵育。(3)小離心機(jī)離心20-30s,去上清。(4)力口入200ulAbBinding&Washi

3、ngBuffer,輕柔吹打重懸珠子。4)免疫沉淀(1)將上述EP管離心，去上清。(2)取5ml蛋白裂解液輕柔吹打重懸珠子-抗體復(fù)合物。(3)室溫旋轉(zhuǎn)孵育30min(將抗原結(jié)合到珠子-抗體復(fù)合物上)。(4)離心機(jī)離心20-30s,將上清吸入干凈離心管備用。(5)使用200ulWashingBuffer清洗珠子-抗體-抗原復(fù)合物3次,即輕柔重懸、離心去上清3次。(6)100ulWashingBuffer重懸珠子-抗體-抗原復(fù)合物，將混懸液移至干凈EP管。5)洗脫目的抗原(1)將EP管離心，去上清。(2)力口20uLElutionBuffer,輕柔吹懸復(fù)合物，避免產(chǎn)生氣泡。(3)室溫旋轉(zhuǎn)孵育2min

4、,分離復(fù)合物。(4)EP管離心，將上清放吸入新EP管備用。完成WB實(shí)戰(zhàn)指南后，朋友曾央分享點(diǎn)免疫共沉淀方面的咚咚；當(dāng)時(shí)不得不回絕。因?yàn)?，WB指南是基于這些年的回復(fù)的匯總，基本上方方面面的問題都有提及，只需要做些串聯(lián)；而論及coIP,目前在國(guó)內(nèi)還不太普及，盡管它已經(jīng)是生化領(lǐng)域最基本的技術(shù)之一。因此，再想寫這么個(gè)長(zhǎng)篇頗耗時(shí)間，于我的時(shí)間和精力太為難；不過，今天是個(gè)特殊的日子，湊湊熱鬧吧。一一人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有虧欠，也許這就是上帝的公允吧。一一在自己最擅長(zhǎng)的地方找點(diǎn)成功的感覺吧，當(dāng)然我的失敗也只是因?yàn)闆]有更多的時(shí)間。oo哎！扯遠(yuǎn)了玩coIP也玩了5年多了，因?yàn)樯鲜志褪亲铍y的B

5、蛋白結(jié)合量多少的變化(假定IPA蛋白)而非檢測(cè)B蛋白的有無，說句吹牛皮的話，在我們這個(gè)小領(lǐng)域三家最強(qiáng)的lab唯有我們敢于通篇基于這種檢測(cè)手段，所以，對(duì)于coIP算是非常得有心得了。以下論述基于最難的B蛋白結(jié)合水平變化的檢測(cè)，所以部分實(shí)驗(yàn)操作非常苛求；學(xué)會(huì)這個(gè)，其他就是小菜了；所以，這也算一個(gè)進(jìn)階篇。一.樣品的制備。如WB指南，在這里我最強(qiáng)調(diào)從制備樣品開始的一致性。如果不觸及細(xì)胞的凋亡或死亡，那么任何處理組樣品和ctrl最后的終體積應(yīng)該保持一致；如果細(xì)胞有大量凋亡或死亡，可以通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)體積對(duì)樣品的體積粗略定量后再加裂解液，一般可以把誤差控制在WB的檢出范圍以下，基本保持樣品的均一；組織樣品可以

6、通過稱重添加相應(yīng)體積比的裂解液。裂解液的配方可以采用WB指南里給出的，原配方如下：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(0.5MPMSF)此裂解緩沖液裂解條件相對(duì)溫和，適合后續(xù)的coIP分析。不過"用它做coIP有明顯的缺陷；要理解此配方的缺陷，我們先聊聊如何在coIP實(shí)驗(yàn)中作偽”。偽造結(jié)果，也分為單純性造假和技術(shù)型偽造。撇去前者，從技巧上來講，如果要想獲得設(shè)定、預(yù)想的相互作用結(jié)果，可以從幾個(gè)角度著手一一此類結(jié)果可重復(fù)。a.在低鹽離子裂解液中進(jìn)行IP。很多蛋白復(fù)合體

7、對(duì)鹽濃度敏感，但敏感性有強(qiáng)弱之別。通常來說，真實(shí)存在著的蛋白復(fù)合體能耐受生理鹽(0.15M)或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會(huì)解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高鹽而不解體，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高鹽。因此，了解一個(gè)蛋白復(fù)合體對(duì)鹽濃度的耐受，既是一個(gè)幫助判斷蛋白復(fù)合體是否真實(shí)存在的一個(gè)重要依據(jù)，更是一個(gè)非常重要的生化數(shù)據(jù)；對(duì)某些體外生化反應(yīng)的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。例如，純化有生物活性的CDK和Cyclin,如果采用鹽濃度漂洗，則最低需0.6M以上以解離CKI。所以，在生化領(lǐng)域的coIP分析中，很多實(shí)驗(yàn)體系的鹽濃度是比生理

8、鹽濃度更高的。當(dāng)然，不排除某些弱相互作用需要生理鹽濃度，但這種情況不多見；也容易跟瞬時(shí)的相互作用混淆，某些實(shí)驗(yàn)中的弱相互作用實(shí)際是由于生化反應(yīng)的瞬時(shí)性，且缺乏有效的截留、富集手段，諸如酶和底物。很多非生化領(lǐng)域的，喜歡在生理鹽或更低鹽濃度下進(jìn)行coIP,這大大增加了假陽性的幾率一一很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來。這也成為了獲得設(shè)定的”相互作用的有效手段。b.過表達(dá)。現(xiàn)在已經(jīng)存世的相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)論文和數(shù)據(jù)，其蛋白復(fù)合體相互作用的數(shù)據(jù)是通過過表達(dá)，甚至原核GSTpulldown獲得的；筆者認(rèn)為，在閱讀這類文獻(xiàn)時(shí)，大家要特別小心，多長(zhǎng)一個(gè)心眼一一即始終抱懷疑的態(tài)度。并非說一定不可取，但是有一點(diǎn)很明確

9、，這樣的數(shù)據(jù)送到我們手里，首先我們會(huì)要求對(duì)方補(bǔ)充內(nèi)源性蛋白相互作用的證據(jù)，否則該結(jié)果一律不采信。在WB指南里面我提過，血清中豐富的BSA可以被任意抗體識(shí)別（其實(shí)也是一種相互作用），那么同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，為什么不可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作用呢？因此，如果想要特定”的相互作用，可以考慮過表達(dá)所有的蛋白，就是核蛋白結(jié)合胞漿蛋白甚至膜表面受體也不稀奇。c.不添加NP40一類表面活性劑，削弱對(duì)非特異性結(jié)合的拮抗。NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。因此，減少或不添加NP40也可以輔助預(yù)期”目的。實(shí)際上，掌握a、b兩點(diǎn)

10、技巧，基本上可以無往而不勝”一制底搞定一切想要的”相互作用。基于以上的原因，如果想獲得切實(shí)可靠的相互作用數(shù)據(jù)，那么裂解液的選取相當(dāng)講究。1 .首先鹽濃度至少0.15M或以上。鹽濃度主要指Na鹽濃度。有人會(huì)問為什么不是鉀鹽？因?yàn)殁淃}會(huì)更容易跟某些試劑（或離子）形成沉淀，諸如SDS,因此在某些情況下，鉀鹽會(huì)對(duì)后續(xù)的某些實(shí)驗(yàn)帶來未知的麻煩，所以一般鹽濃度指Na鹽。鹽濃度過低對(duì)某些與染色體結(jié)合較牢的蛋白的抽提（非破膜的溫和裂解）效率也較差，可能會(huì)丟失部分信息；而鹽濃度過高又會(huì)造成某些相互作用較弱的復(fù)合體解體，因此，通常選擇0.150.3M做細(xì)胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進(jìn)行IP。小技巧：最初幾

11、遍的漂洗buff要和IP時(shí)的鹽濃度相同。經(jīng)驗(yàn)上，純化蛋白時(shí)，若用低鹽裂解細(xì)胞、高鹽漂洗去雜質(zhì)，蛋白丟失較多；所以，一般如前所述。當(dāng)然，也可以高鹽裂解低鹽漂洗，但是對(duì)除雜質(zhì)不利。2 .通常IP體系中NP40含量0.20.5%。NP40在0.51.0%時(shí)，染色體很容易析出（很黏，成膠狀會(huì)裹住beads,同時(shí)粘下很多蛋白），用這樣的裂解液破碎細(xì)胞則可能需要超聲。通常由于習(xí)慣上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情況下，選擇前述的濃度區(qū)間。3 .可適當(dāng)添加EDTA,螯合金屬離子保護(hù)DNA和蛋白。特殊情況下還可選擇添加EGTA,螯合Ca2+研究鈣相關(guān)蛋白。止匕外，裂解液中甘油濃度一般介于15%-20%之

12、間。4 .很多市售或自制的裂解液過于溫和，需要考慮采用機(jī)械或者超聲等手段提高裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用）。但是，有些時(shí)候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液一一即最好裂解液制備好后立即進(jìn)行coIPo當(dāng)然，如果證實(shí)凍融無影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用，這對(duì)實(shí)驗(yàn)日程的安排會(huì)更平易。5 .裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。前幾日回復(fù)一貼子，不知道出于什么動(dòng)因該LZ主動(dòng)稀釋裂解樣品的蛋白濃度再IP,所幸不是做coIPo上面提到過表達(dá)會(huì)制造相互作用的假象，反過來說蛋白濃度過稀，某些相互作用就測(cè)不到（不一定是弱的相互作用）。因此，細(xì)胞的裂解效率會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

13、。通常細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá)7-8mg/ml左右，但是更常規(guī)的現(xiàn)象是達(dá)不到這種濃度；當(dāng)然不是說低于7-8mg/ml就不能進(jìn)行coIP,只是需要考慮這一因素。因此，在多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液?！狙a(bǔ)充1】：切記！實(shí)驗(yàn)要先有結(jié)果再來挑戰(zhàn)極限！在不少人的提問給出的流程中，其開始的樣品量往往是以6well或者60mmdish為單位的；不否認(rèn)某些蛋白或復(fù)合體確實(shí)可以在如此苛刻的條件下完成coIPo但是，更多的時(shí)候不是這樣子的。以我自己研究的復(fù)合體為例，其內(nèi)源性IP最低起始細(xì)胞數(shù)是40-50%confluence的145mmdish；比這個(gè)數(shù)目更低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就很不穩(wěn)定甚至無信號(hào)。當(dāng)某些藥

14、品、試劑非常昂貴時(shí)，鄙人才會(huì)勉為其難。否則，一律2dishes100%confluence,可以elute成30ul跑兩次；相互作用微弱時(shí)，15ul僅跑一次；再弱，多養(yǎng)幾塊板（CE增加抗后續(xù)若為質(zhì)譜分析,體和beads仍可保持不變，因此只浪費(fèi)培養(yǎng)基總比浪費(fèi)一個(gè)冗長(zhǎng)的時(shí)間走麥城要好）需考慮小規(guī)模量產(chǎn)。二、IP前的準(zhǔn)備工作：coIP:分為內(nèi)源性蛋白的相互作用和非內(nèi)源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之間以及外源拖內(nèi)源蛋白）。非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是通過過表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，通常為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)、提高IP效率會(huì)讓外源蛋白帶上標(biāo)簽（tagged；這也是沒有相應(yīng)的可用于IP的內(nèi)源蛋白抗體之前唯一可行的方案），因此

15、就tag的使用而言存在很多小技巧。a.His-tagged主要用于純化蛋白。有些人喜歡用His-tagged蛋白然后進(jìn)行coIP,實(shí)際上它存在潛在的隱患。當(dāng)初鄙人用Sigmaa-His（鼠單抗；免費(fèi)廣告）WB外源蛋白發(fā)現(xiàn)CE里面一塌糊涂（帶型漂亮就是非常多的帶），那時(shí)候還抱怨這個(gè)抗體特異性不好。后來，當(dāng)了解到很多蛋白會(huì)有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因?yàn)樾r(jià)非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識(shí)別。同理，如果用Ni-NTAbeads去PDHis-tagged的蛋白，完全有可能PD那些內(nèi)源性的富含histidinedomain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白

16、還非常多。那么，當(dāng)初開發(fā)Histag的主要目的，個(gè)人認(rèn)為主要是可以用廉價(jià)的化學(xué)試劑洗脫，且Ni-NTAbeads這類非抗體類的beads成本低廉，可大量工業(yè)生產(chǎn)。因此，用這個(gè)tag去生產(chǎn)有活性的蛋白是首選。b.tandem-tagged不能用于分析鈣調(diào)信號(hào)通路。tandemtag實(shí)際上從成本角度和Histag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain，天然會(huì)結(jié)合鈣信號(hào)相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號(hào)蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。當(dāng)然，筆者不太清楚近年來該方法有無改進(jìn)，但正是由于引入鈣調(diào)d

17、omain才實(shí)現(xiàn)了降低成本的目的，因此猜測(cè)可能性不大。c.Myc、HA、Flag-tagged:Myc仍然會(huì)有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白（有相應(yīng)的專利，因此目前無論抗體或交聯(lián)好的beads價(jià)格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，a-Flag效價(jià)比a-HA略高，因此更適合IP。當(dāng)然，公司仍在努力尋找效價(jià)更好的a-HA以及IPHA的抗體（Flag系Sigma專利，因此目前只能忍受其過高的定價(jià)）。那么，之前頗流行的a-HA鼠源單抗（其clone名稱為12CA5）為何被潛在地摒棄了？原因大概是：該克隆株可以輕易獲取，流傳甚廣，因此可以取腹

18、水自制；效價(jià)不高，特異性很差。尤其是特異性的問題，用該抗體去交聯(lián)的beads做coIP,隱患很大（可以輕易PD非常濃的非特異性蛋白）因此，購(gòu)買商品化a-HAbeads時(shí)，請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明（避開12CA5系列）。還有GST等等，不一一列舉了。d.tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號(hào)肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外泌時(shí)會(huì)被信號(hào)肽酶連同信號(hào)肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時(shí)候?qū)ag構(gòu)建在C端會(huì)影響蛋白原來的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時(shí)候還可能被遮蔽，

19、從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是N端、C端tagged同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬一。內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要依靠抗體IP,WB或者質(zhì)譜分析。另外一條途徑，是用外源性蛋白的coIP指代內(nèi)源性蛋白，上文提到的tandem-tag技術(shù)的目的就是為了實(shí)現(xiàn)這種可能。它的核心是將外源性蛋白的過表達(dá)降低極低水平用于模擬體內(nèi)環(huán)境。實(shí)際上，在構(gòu)建外源過表達(dá)體系的時(shí)候，通常可以得到一系列表達(dá)水平差異的穩(wěn)定單克隆，可以通過進(jìn)一步篩選獲得外源與內(nèi)源相加與原內(nèi)源蛋白水平相當(dāng)?shù)募?xì)胞株（在細(xì)胞調(diào)控承受的范圍以內(nèi)，內(nèi)源性蛋白水平會(huì)因?yàn)橄鄳?yīng)的外源蛋白表達(dá)而適當(dāng)下調(diào)），這樣的細(xì)胞株可以用于模擬內(nèi)源性蛋白的相互作用；因?yàn)槔?/p>

20、論上未改變細(xì)胞的生理特異，相應(yīng)的生命過程仍受內(nèi)源因素調(diào)控。當(dāng)然構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞株需要轉(zhuǎn)染并篩選，又因?yàn)橐刂票磉_(dá)量水平，篩選工作耗時(shí)更長(zhǎng)；并且細(xì)胞狀態(tài)會(huì)因?yàn)閭鞔^多而有些改變。因此，絕對(duì)的內(nèi)源性蛋白的相互作用仍是一個(gè)不可或缺的數(shù)據(jù)，尤其對(duì)一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白復(fù)合體。IP內(nèi)源性蛋白首先要確認(rèn)相應(yīng)的抗體是否能夠用于IP。能夠用于IP的抗體，通常其識(shí)別區(qū)域恰是天然狀態(tài)下靶蛋白暴露于外的區(qū)段，常為疏水性結(jié)構(gòu)域；因此在自己制備抗體的時(shí)候要更多考慮這個(gè)因素，至于商品化的要仔細(xì)閱讀說明。在確定抗體可以用于IPA蛋白以后，抗體投入量如何掌握呢？通常情況下0.1ug-3ug較常用（純化的抗體），其變化取決于抗體的效價(jià)

21、，但通常未知情況下0.5ug或1ug是最常用。一般如果樣品易制備則盡量用樣品過飽和抗體，讓投入抗體能物盡其用；相反，通常1ug抗體已經(jīng)是過量的。另外一個(gè)需要考慮的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。當(dāng)B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的時(shí)候，問題會(huì)比較復(fù)雜。因?yàn)樵谧詈笠徊较疵摰倪^程，很容易將輕鏈和重鏈帶入到IP終產(chǎn)物，它將嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。解決方案：1. IP外源tagged-A蛋白，洗脫盡量用相應(yīng)的peptide,一方面提高特異性，另一方面由于洗脫條件溫和，重鏈和輕鏈脫落也會(huì)較少；在IP前，尤其對(duì)于新Flag、HAbeads可以用washingbuffer或者低pHGlycine-H

22、Cl漂洗一下beads,把結(jié)合不牢的重鏈和輕鏈先洗掉。止匕外，F(xiàn)lag、HA-beads通常是鼠抗，那么IBB蛋白的抗體應(yīng)該選用兔抗。針又beads的新舊，反過來說，采用再生的舊beads有利于避免輕重鏈的干擾，且IP前的封閉可以省去一一不要指望高鹽、酸洗能徹底去除已經(jīng)非特異結(jié)合到beads上的雜質(zhì)，通常這些蛋白都比較黏。高鹽、大量純化蛋白時(shí)，采用再生的beads可以獲取即便銀染，背景仍非常干凈的高純度蛋白樣品。2. IP內(nèi)源性蛋白，尤其最后涉及低pHGlycine-HCl洗脫或者SDSLB煮beads（后者重、輕鏈更嚴(yán)重），如B蛋白為60KDa即能與55KDa重鏈分開時(shí)，且抗體效價(jià)許可的前提

23、下，降低抗體投入量會(huì)顯著減弱重、輕鏈信號(hào)，從而不會(huì)使得B蛋白信號(hào)不致被重鏈信號(hào)吞沒；若有條彳再配合交錯(cuò)抗體種屬來源，即IPA蛋白的抗體為兔抗，舊B蛋白用兔抗以外任何一種諸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交錯(cuò)抗體的種屬，實(shí)際上當(dāng)重輕鏈脫落過多時(shí)（尤其是重鏈），在舊的時(shí)候它符合WB實(shí)戰(zhàn)指南提到的雜蛋白過濃會(huì)非特異結(jié)合任意抗體，這在coIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中要格外小心。有人會(huì)說可以用未免疫的IgG做陰性對(duì)照，但是偶爾會(huì)發(fā)生一些未知意外，恰好IgG的重鏈沒有顯影（畢竟這不是抗原抗體特異性結(jié)合）?！綛TW:偶爾這樣的結(jié)果還能重復(fù)出來，但是反過來IPB蛋白，舊A蛋白可能就100%失敗。所以，當(dāng)?shù)鞍追肿恿拷咏亍?/p>

24、輕鏈的時(shí)候，下結(jié)論要格外小心，除嚴(yán)格陰性、陽性對(duì)照外，reverseIP的結(jié)果也很重要。最好加一個(gè)不相干的蛋白的同種屬的抗體做陰性對(duì)照】beads封閉和樣品的preclear:如果采用新beads,beads的封閉就顯得非常必要。封閉用1-5mg/mlBSA（ChIP還要加魚精DNA）扔buffer里一直靜置就好了；若臨時(shí)添加可考慮翻轉(zhuǎn)半小時(shí)；樣品preclear用proteinAbeads翻轉(zhuǎn)半小時(shí)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，雜蛋白若是很黏怎么處理都只是相對(duì)好一些。所以，IP、漂洗的鹽濃度影響更大。coIP:抗體劑量上文提過了；其他flag、proteinA等等beads一般用10ul足夠了，偶爾根據(jù)需要微

25、調(diào)，諸如過表達(dá)純化蛋白?？傊话鉉E的成本較低，若用CE飽和抗體、beads,只要你抗體、beads和操作始終一致，最后IP的A蛋白能保證一致，結(jié)果有效。干粉狀的beads用IPbuffer充分溶脹后離心去beads的碎片；其他液態(tài)的不需要此過程?，F(xiàn)在市售的商品化beads如sigmaflag可不需要IPbuffer漂洗直接IP,未發(fā)現(xiàn)對(duì)coIP結(jié)果的明顯干擾。通常，再生的beads由于放置-20度延長(zhǎng)保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分勻，從而造成不同tube間初始差異，這時(shí)候會(huì)對(duì)IP結(jié)果影響很大。用抗體做內(nèi)源性IP時(shí)，個(gè)人喜歡抗體2hr+beads1hr,抗體孵育可

26、過夜；beads不超過3hrs（含flag等等標(biāo)簽蛋白IP情況）。這里面提到一個(gè)細(xì)節(jié)，就是先加beads還是先加抗體。在某些情況下，CE離心去除細(xì)胞碎片后的上清是一個(gè)剛好的溶解平衡體系，添加其他物質(zhì)如beads這類可作為沉淀凝結(jié)核的物質(zhì)會(huì)破壞原本的溶解平衡；它可能類似水蒸氣凝結(jié)成雨水或雪花需要灰塵作為凝結(jié)核，其結(jié)果就是讓一些原本溶解完全的蛋白發(fā)生沉淀。那么，beads翻轉(zhuǎn)越久蛋白會(huì)沉淀越多，而這種沉淀無法靠漂洗去除干凈，最終進(jìn)入sample從而可以檢測(cè)到任意蛋白的結(jié)合。因此，限制beads翻轉(zhuǎn)孵育時(shí)間非常關(guān)鍵；通常beads孵育1-2hr已經(jīng)充分結(jié)合了。做IP的beads其物理性質(zhì)跟吸附DNA

27、的或諸如Ni-NTA之類的差異很大，不需要高速離心，通常臺(tái)式小離心機(jī)4-5K、30sec就足夠了；有時(shí)候忘記了，靜置較久beads已自然沉降甚至不需要離心。在這種情況下，不必要的高速離心只會(huì)給beads施加巨大的離心力，次數(shù)多了beads通通碎裂，嚴(yán)重影響再生beads的質(zhì)量一一避免一些不必要的操作；當(dāng)然不打算重復(fù)使用就無所謂了。Beads再生：商品化的beads尤其抗體交聯(lián)的，因?yàn)榭贵w和專利的原因價(jià)格相對(duì)昂貴，那么回收beads并再生就顯得非常必要。保管得好（防霉變）,beads可以重復(fù)用20-30次。再生beads沒有什么特別的，常做生化柱層析的，那簡(jiǎn)直就是家常便飯。IP用beads的再生，也無非就是高鹽接酸洗再高鹽，最后用IP漂洗buffer復(fù)性，加甘油和NaN3扔-20度長(zhǎng)期保存。高鹽即3MNaCl;酸洗，就是可用做elutionbuffer的0.1MpH3.0的Glycine-HCl。IPbeads尤其抗體交聯(lián)的，由于昂貴再加實(shí)驗(yàn)和回收過程的損失一般體積不大，所以Biorad公司一種小型塑料的柱層析管用來再生beads最合適（它是一次性的，但僅僅用于再生beads可以無限重復(fù)使用）；而常規(guī)的玻璃生化層析柱即便最小號(hào)的也太大，黏壁損失會(huì)很大，beads再生幾次可能就全損失了。再生操作就