PCR優(yōu)化問題匯總

1、PCR優(yōu)化問題匯總一、PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤？參考見解：1. 聚合酶忠實性低：使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如PlatinumPfxDNA聚合酶。2. 循環(huán)數(shù)太多：降低循環(huán)數(shù)。3. 四種dNTP的濃度不同：制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。二、PCR跑膠，目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象？參考見解：1. 模板可能有降解，建議避免反復(fù)凍融，放置時間不能太長。模板的質(zhì)量是最重要的。2. 抽提RNA時有污染，包括基因組DNA污染和蛋白質(zhì)污染，需重做抽提。3. 提高退火溫度，減少非特異性擴增。4. 減少循環(huán)次數(shù)，減少非特異性擴增。5. 電泳緩沖液時間太長，

2、PH值和鹽離子濃度明顯改變。6. 電泳時電壓不能太高，8V/cm。7. 一般來講，基于promega和TaKaRa的PCR反應(yīng)體系中，Mg和dNTP的濃度是相匹配的，不需改動。&加樣的量過大。過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。9. 制膠過程中膠孔沒制好。10. EB沒有沖洗干凈。11. 模板混有基因組DNA，或模板中混有蛋白。12. 非特異反映。引物設(shè)計的不好，非特異，這種情況容易出現(xiàn)非特異擴增造成有非特異性擴增帶或拖尾現(xiàn)象。13. 電泳液用久了不換，電泳膠臟了。14. 擴增的條件不合適，一般退火溫度低時容易使引物在非特異位置結(jié)合引發(fā)擴增反應(yīng)造

3、成拖尾。15. 針對以上情況，可以先提高退火溫度試試，如果實在不行，再看看引物是不是合適。如果內(nèi)參可以擴出來，只能說明程序可能是適合的，但不能完全說明體系合適。體系內(nèi)的各組分，如模板、dNTP、Mg離子、引物等都可能造成拖尾。先得考慮換了那種成分后出現(xiàn)了拖尾，逐項試驗。引物當然是最重要的因素，但絕非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不會是引物的問題，尤其是已經(jīng)被用過證明能擴出特異片段的引物，更不可能是它的問題了。先不要加Taq酶，等到其他東西都加完了以后，放到PCR儀上去，到那時再加，馬上開啟PCR程序試試。檢查一下你的dNTP的量夠不夠。適當減少23個循環(huán)試試，可能會有效果。三、PCR

4、結(jié)果總是不滿意，請問要注意些什么？參考見解：1. 將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。2. 當酶反應(yīng)混合物以70°C“熱啟動”開始循環(huán)時，切記在加入酶之后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。3. 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。4. 對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預(yù)變性，后加模板進行正常PCR擴增。5. 沒有擴增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。6. 泳道中

5、出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2,因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。7. 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。8. 檢查模板和引物的用量。9. 增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。10泳道中出現(xiàn)模糊條帶：減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68°C。重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。11. 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92C時不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以

6、得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2:350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2：500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。12. 基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻。降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為2434個核苷酸，溶點在6068C間。使用這類引物可提高PCR反

7、應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。13. 變性：第一步變性在94C下進行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94C下進行2030秒），除非模板中富含GC，則95C下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。14. 延伸：68-72C下進行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3'-末端帶有一個突出的A,

8、因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進行。測序時酶的混合物帶有3'-5'外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。15. 引物設(shè)計：一般長度20-30bp；至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)；引物對的Tm值應(yīng)該接近。四、假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶？PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。參考見解：1. 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白

9、，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。2. 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴化乙錠。3. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看0D值，更要注重引

10、物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。4. Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。5. 反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?0

11、0ul,應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一一定要模索條件，否則容易失敗。6. 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。7. 靶序列變異：比如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或由于靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。五、出現(xiàn)非特異性擴

12、增帶？PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶？參考見解：非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物。減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93°C變性，65°C左右退火與延伸）。六、PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地

13、毯樣帶？參考見解：其原因往往由于酶的量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。七、克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？參考見解：最佳插入片段：載體比需要實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul2X連接液，50ng質(zhì)粒DNA,lWeiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要

14、求，為提高連接效率，需4C過夜。八、如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？參考見解：1. 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。2. 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA，用SOC稀釋到1000u后含10ngDNA，用1/10鋪板，共用1ngDNA。

15、轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。3. 如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去To可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804,M1794）質(zhì)量標準好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酶替換。4. 用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的

16、實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍斑,沒有菌落或少有菌落，連接有問題。九、對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？參考見解：1. 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。2. 插入片段帶有污染，使3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3'-T缺失。3. 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度

17、照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。4. 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。5. 高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞十、PCR體系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一層水氣，需不需要覆蓋礦務(wù)油？加多少，具體步驟應(yīng)怎樣？參考見解：是否覆蓋礦物油，要看你用的是那種PCR儀了，目前新出的PCR儀都用不著加，

18、因為有熱蓋技術(shù)、密封嚴格，如PE2700，2400，9600,9700等PCR儀，可以看看所用PCR儀的說明書，應(yīng)該提到的。去除石蠟油比較有效的方法：1。PCR反應(yīng)之后，把反應(yīng)管放的-20C，凍上20-30分，石蠟是不會凍住的，等水相結(jié)凍之后，拿出管子，迅速把上面的石蠟油吸掉。用一張干凈的Parafilm，將反應(yīng)液點到上面，輕輕移動或提起膜，石蠟油比較粘膜而水相會流開，分開后吸取水相。十一、PCR加樣孔上有很亮的條帶，但沒有產(chǎn)物條帶？參考見解：最大的可能性是蛋白質(zhì)（Taq酶）與產(chǎn)物結(jié)合，滯留在加樣孔。解決方案，loadingbuffer加入0.1%SDS為了排除其它可能（例如大片段），可以作一

19、個無反應(yīng)對照，所有條件都一樣，就是不上PCR儀器。然后同時跑電泳，看看上樣孔內(nèi)情況。十二、PCR的產(chǎn)量有許多因素決定他們的主次關(guān)系是什么，各因素又是怎么調(diào)節(jié)的？參考見解1. 退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。2. 減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。3. 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。4. 改變MgCL2（有時KCL）濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對Taq酶的直接作用。5. 模板中如果存在次級結(jié)構(gòu),例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR混合物中的4XdNTPs中加入

20、7-脫氮-2'脫氧鳥苷-5'三磷酸（7-deaza-2'-deoxyguanosine-5-trihosphate）（de7GTP）。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150umol/lde7GTP+50卩mol/LdGTP）代替200卩mol/ldGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。十三、PCR產(chǎn)物大約有900bP，哪種測序方法比較好？直接用純化的PCR產(chǎn)物測序還是克隆到T載體上再測序？純化PCR產(chǎn)物的方法哪種比較好？參考見解：1. PCR產(chǎn)物直接測序?qū)CR產(chǎn)物純度要求較高。體系中不得有雜帶，引物二聚體等。另外PCR產(chǎn)物在體系中需達到一定量，一些低豐度的模

21、板，則需通過增加循環(huán)數(shù)來達到，但循環(huán)數(shù)太多易出現(xiàn)突變?？寺〉絋載體上比較好。經(jīng)典，且利于保存。酶切鑒定后，選取有正確插入片段的克隆，在將此克隆菌種搖過夜，用1.5毫升EP管裝菌液，送公司測序。這樣的好處是：公司可以自行鋪板子保存菌種，如果第一次測序失敗，還可以挑菌落繼續(xù)測。2. 測序的一個反應(yīng)大約可以測500bp，在T載體多克隆位點兩側(cè)有T7和SP6兩種測序引物，如果片段小于500bp，只測一端就夠了。如果大于500bp，建議采用雙向測序，同時測T7和SP6兩個反應(yīng)，然后將測序結(jié)果拼接起來。這項可以讓公司完成，也可以自己用軟件完成（如DNASTAR）。3. 關(guān)于純化PCR產(chǎn)物，建議采用經(jīng)典的切

22、膠方法。這種方法回收率為50%左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，這是從溶液中去除有機膠必需的。這也是造成產(chǎn)物損失的主要步驟。十四、引物間形成了比較多的二聚體，使產(chǎn)物很少。這種情況該怎么處理?參考見解:1. 不能重新設(shè)計就試試降低一下引物濃度，調(diào)整一下體系如優(yōu)化鎂離子濃度或改變模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化，還有program，退火溫度太高，時間太短，延伸時間太短都可能是原因。2. 適當提高退火溫度并調(diào)整體系中的Mg2+濃度，結(jié)合熱啟動，通?？梢杂行p少引物二聚體的量。當然，同時也可以減少引物的量，也會有一定的幫助。3. 還可以做套式PCR:即在目的片段兩端外面選擇序列設(shè)計一

23、對引物這對引物因為沒有位置的限制可以設(shè)計的理想一點,擴增出比目的片段稍長的一段后,作為模板用樓主現(xiàn)在的引物來擴增,比直接擴更有效.十五、為什么會產(chǎn)生彌散（smear）條帶？如何解決？參考見解：在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高。1. 減少引物的用量。2. 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)。3. 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。十六、出現(xiàn)多種擴增產(chǎn)物條帶？怎么解決？參考見解：1. 應(yīng)用降落PCR，最好再結(jié)合熱啟動PCR或加強PCR（boosterPCR）。2. 優(yōu)化MgCl2、模板DNA、熱穩(wěn)定DNA聚合酶及dNTP的濃度。3. 用首次擴增的PCR產(chǎn)物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復(fù)性溫度條件下進行30個循環(huán)的