Chromaflow 標(biāo)準(zhǔn)裝柱流程

1、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程目的：為了使Chromaflow層析柱裝柱過程可重復(fù)，并能夠得到較好的柱效，故建立此操作規(guī)范。范圍:配合AKTAprocess或Uvis-920手動系統(tǒng)進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)純化操作。責(zé)任人：層析工序操作人員標(biāo)準(zhǔn)操作程序：1、方法描述在位裝填技術(shù)（packing-in-place）是專門針對Chromaflow層析柱的新型裝柱方法，它利用特殊的噴嘴（nozzle）將填料裝進(jìn)柱體，因此在每次裝柱和拆柱的過程中就不需要移動柱體和柱頭。本標(biāo)準(zhǔn)的操作流程可以適用于不同填料裝于不同規(guī)格的Chromaflow層析柱中。12本操作流程以填料Q-SepharoseBB為例,將其快速有效地裝入Chroma

2、flow400層析中，柱高為30cm。2、材料和設(shè)備Chromaflow400層析柱（內(nèi)徑40cm，帶有50pm不銹鋼篩網(wǎng)）；裝柱站（packingstation）；不銹鋼儲罐2個(gè)（分別裝純水和膠懸液slurry）；10mmAKTAprocess系統(tǒng)或手動系統(tǒng)（Skid）；4路2通閥（10mm）；壓力表（0-60psi）；TC接頭卡箍和墊片若干；連接管道若干；壓縮空氣；50-70%濃度的Q-SepharoseBigBeadsslurry（純水中）；純水和20%乙醇；1%丙酮水溶液（V/V）,0.4MNaOH和2MNaOH水溶液.3、準(zhǔn)備工作3.1 柱體調(diào)水平3.1.1 配件連接將三通連接到MP

3、T上，并在其他2個(gè)出口依次連接壓力表和4路2通閥，在底部MPB上連接4路2通閥，將閥門的其他出口依次連接管道備用。利用合適的管道和配件將柱子的nozzles和packingstation（圖2）以及水、slurry的儲藏罐相連。將packingstation和壓縮空氣相連。用20%乙醇侵潤柱頭和密封圈，以便調(diào)節(jié)柱頭高度。3.1.2柱頭高度調(diào)節(jié)關(guān)閉MPT和MPB,并將頂部和底部nozzle分別調(diào)至UNPACK和PACK位置（圖1）。利用packingstation（圖2）調(diào)節(jié)handie至B和SIB位，將柱體內(nèi)裝滿水,縮回頂部nozzle至RUN位置。將支持頂部柱頭的螺絲擰松來調(diào)節(jié)柱頭高度。要升

4、高柱頭，就利用packingpump從底部nozzle將水泵入柱體。要降低柱頭，將底部nozzle調(diào)至UNPACK位置,頂部為RUN位置,并利用unpackingpump將水泵出同時(shí)產(chǎn)生吸力使柱頭降低。在柱頭高度調(diào)節(jié)的過程中，利用水平儀時(shí)刻關(guān)注柱頭各邊的高度，并精確測量管道頂部法蘭和柱頭法蘭之間的高度，確保各邊高度一致，頂部和底部nozzle均調(diào)至RUN位置。柱頭高度調(diào)節(jié)完畢后，擰緊各個(gè)螺絲。3.1.3篩網(wǎng)排氣泡和觀察密封性調(diào)節(jié)頂部和底部nozzle分別處于PACK和RUN位置，向柱體內(nèi)泵入水，觀察topnozzle的篩網(wǎng)上是否存在氣泡，若有氣泡調(diào)高泵速從而加大流速來除去氣泡，若還有氣泡，這時(shí)

5、將底部nozzle調(diào)至UNPACK位，使水從SOB管路流出直到水面脫離篩網(wǎng)，再調(diào)底部nozzle至PACK位使水慢慢侵沒篩網(wǎng)從而可保證除去篩網(wǎng)上氣泡；繼續(xù)泵入水使壓力接近3bar，將底部nozzle至RUN位，觀察10-20min，如果壓力保持不變則表明柱子的密封性是合格的；這時(shí)迅速打開底部MPB閥門放水再迅速關(guān)上，重復(fù)2-3次即可排除下篩網(wǎng)腔內(nèi)氣泡。同法排除上篩網(wǎng)腔內(nèi)氣泡。MPTIHMPBPACKRUNUNPACKsrrMPBMIPfi5圖1、Chromaflownozzls三種工作位置示意圖oMPT<s>MPBvalvepressgaugeLightHandleC-ilLiif

6、hriUnpackingpumpvalveLight、HandleP占亡khnpumpCollectionBuiferSlurry32膠懸液(slurry)準(zhǔn)備321slurry濃度及體積確定將slurry充分?jǐn)噭蚝螅∵m量于2ml或更大離心管中，適當(dāng)離心后觀察填料體積和總體積的比例確定slurry濃度，最終確定slurry的濃度為50%。以下面的公式來計(jì)算需要的slurry體積：VslurryL-CF-ACcslurryL為柱高，CF(compressionfactor)為填料的壓縮因子，Ac為柱體的橫截面積,Csiuny為slurry的濃度。在此例子丄=30cm,Q-SepharoseBB

7、的CF=1.15,Ac=1256cm2,Cslurry=50%,則：slurry=30*1.15*1256/0.5mL=87000mL=87L.圖2、Packingstation流程示意圖321管道中slurry體積確定確定以下組件中的所需的slurry死體積ECV(ExternalComponentsVolume)：slurry儲罐至Upackingstation管路,packingpump，packingstation到SIT管路,SOT到packingstation管路,packingstation到slurry儲罐管路。ECV的確定可以直接根據(jù)管道的長度和直徑來計(jì)算，也可以把組件中充滿

8、水再利用量筒來測量水的體積。一般情況下，ECV不會超過2-3L,將這2-3L的slurry加到slurry儲罐中作為總的Vslurry。4、層析柱裝填4.1利用頂部nozzle裝填法4.11將頂部nozzle調(diào)至RUN,將SOT管道放于slurry儲罐，利用packingstation將頂部nozzle和管道中充滿slurry以排除氣泡。將頂部nozzle調(diào)至PACK,打開MPB閥門，轉(zhuǎn)動handie打開packingpump，并利用微調(diào)旋鈕使packingstation面板上壓力表顯示為3.5bar，但由于氣動壓力表的指針會有波動，那么就保證波動范圍為3.2-3.6bar,同時(shí)可利用秒表和量

9、筒來測定MPB出口的液體流速，依次作為反饋來調(diào)節(jié)泵速。4.1.2 在packing的過程中，利用攪膠棒攪勻slurry儲罐中的膠懸液以免填料沉積下來，但是同時(shí)需避免產(chǎn)生漩渦，因?yàn)殇鰷u會會容易將氣泡泵入柱內(nèi)。4.1.3 一旦slurry儲罐中的膠懸液全部排空后，立即停泵，并同時(shí)調(diào)節(jié)頂部nozzle至RUN，關(guān)閉MPB出口。利用packingstation泵入純水排空回收所有管道中的殘留slurry。4.1.4將column連接到skid上，調(diào)節(jié)流速至1OOL/h,并采用UPFLOW和DOWNFLOW的流動方向分別走1-2CV的純水，這樣可以進(jìn)一步排除篩網(wǎng)氣泡和穩(wěn)定膠床。4.2利用底部nozzle

10、裝填法4.2.1將底部nozzle調(diào)至UNPACK，利用unpackingpump將柱體內(nèi)水排完后再將nozzle調(diào)至RUN，利用packingstation將底部nozzle和管道中充滿slurry以排除氣泡。將底部nozzle調(diào)至PACK，頂部nozzle調(diào)至UNPACK關(guān)閉MPT和MPB閥門。打開packingpump，調(diào)節(jié)壓力表使波動范圍為3.2-3.6bar。4.2.2 當(dāng)slurry充滿柱體并可以看到從SOT流出時(shí)，停泵并立即調(diào)節(jié)兩個(gè)nozzles至RUN。利用packingstation泵入純水排空頂部和底部nozzles所有管道中的殘留slurry，調(diào)節(jié)頂部nozzle至PAC

11、K，打開MPB排廢。打開packingpump，調(diào)節(jié)壓力表使波動范圍為3.2-3.6bar。4.2.3 在packing的過程中，利用攪膠棒攪勻slurry儲罐中的膠懸液以免填料沉積下來，但是同時(shí)需避免產(chǎn)生漩渦，因?yàn)殇鰷u會容易將氣泡泵入柱內(nèi)。4.2.4 一旦slurry儲罐中的膠懸液全部排空后，立即停泵，并同時(shí)調(diào)節(jié)頂部nozzle至RUN，關(guān)閉MPB出口。利用packingstation泵入純水排空回收所有管道中的殘留slurry。4.25將column連接到skid上，調(diào)節(jié)流速至1OOL/h，并采用UPFLOW和DOWNFLOW的流動方向分別走1-2CV的純水，這樣可以進(jìn)一步排除篩網(wǎng)氣泡和穩(wěn)

12、定膠床。5、柱效測定圖3、柱效測定示意圖5.1利用入KTAprocess測定柱效5.1.1連接。在MPT的4路2通閥上橫向連接一根管道，另一端連至紫外吸收AKTAprocess連接口COLUMNTOP,同時(shí)從MPB的4路2通閥橫向接出一根管道至AKTAprocess的連接口COLUMNBOTTOMo512平衡。將A1接口管道放入0.4MNaCl溶液中，將MPT的4路2通閥調(diào)至管路與大氣相連狀態(tài)，在UNICORN的systemcontrol窗口點(diǎn)擊manualvalveslnletA，選擇inletA1,insert；InletB，選擇closed,insert；Column,選擇downflo

13、w,insert；PumpFlow，再設(shè)定高流速(如180L/h),點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排完氣泡再將閥調(diào)至管路與柱頭相連狀態(tài)，平衡3-5個(gè)CV至電導(dǎo)曲線穩(wěn)定，點(diǎn)擊END；513上樣。將B1接口管道放入2MNaCl溶液，將MPT的4路2通閥調(diào)至管路與大氣相連狀態(tài)，在systemcontrol窗口點(diǎn)擊manualvalvesInletA，選擇closed,insert；InletB,選擇InletB1,insert；Column,選擇downflow,insert；PumpFlow,設(shè)定高流速(180L/h)點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排完氣泡，執(zhí)行pause；5.1.4在systemcontro

14、l窗口點(diǎn)擊manualOtherEnd_Timer,選擇Acc.Volumn,Timeout設(shè)上樣量為377mL(1%CV)；PumpFlow，設(shè)定上樣流速13L/h(10cm/h),點(diǎn)擊execute的同時(shí)將MPT的4路2通閥調(diào)至管路與柱頭相連，完成上樣；5.1.5洗脫。將MPT的4路2通閥調(diào)至管路與大氣相連狀態(tài)，在systemcontrol窗口點(diǎn)擊manualvalvesInletA,選擇inletA1,insert；InletB,選擇closed,insert；Column,選擇downflow,insert；PumpFlow,設(shè)定高流速（180L/h）點(diǎn)擊execute運(yùn)行，排氣泡，同

15、時(shí)將管路充滿0.4MNaCI溶液，調(diào)流速至13L/h(10cm/h)；待流速穩(wěn)定后，在systemcontrol窗口點(diǎn)擊manualvalvesInjectionMark,insert，點(diǎn)擊execute的同時(shí)將MPT的4路2通閥調(diào)至管路與柱頭相連，開始洗脫，在一個(gè)CV左右，電導(dǎo)檢測下將產(chǎn)生目的峰。5.1.6測柱效。在Evaluation窗口中，選擇實(shí)驗(yàn)保存的結(jié)果，在結(jié)果圖中點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，選擇Properties，點(diǎn)擊Clear，并選中Cond_102，點(diǎn)擊OK?；氐紼valuation窗口，選擇積分按鈕，在彈出窗口中，選擇Cond_102,peakwindow中調(diào)整積分的范圍,并在Rejec

16、tPeaks中，填Peakmustbeoneof1largest確定后，在積分結(jié)果窗口，點(diǎn)擊右鍵，選擇Properties，在peaktable選項(xiàng)中，勾選PlateHeight(HETP)和Asymmetry。確定后即可得到理論塔板高度HETP、每米理論塔板數(shù)N和對稱因子As，各填料要求的最低柱效見附表1,As要求0.8-1.5。注：若采用7%丙酮測定柱效，只要要將0.4MNaCl改成水，2MNaCl改成1%丙酮，cond改成UV即可。5.2利用UVis-920手動系統(tǒng)測定柱效圖4、UVis-920連接示意圖5.2.1柱子連接和系統(tǒng)排氣。按照圖4，連接蠕動泵入口管和出口管，并將入口管置于bu

17、ffer或水的液面下(如果泵入口裝有進(jìn)樣切換閥V1,需要把樣品管路和buffer管路都分別放置到相應(yīng)液面下；后面排氣的時(shí)候也要將樣品和buffer兩根不同的入口管分別排氣后方可切換V3使液體進(jìn)柱)。將蠕動泵出口管路連接于柱頭4路2通閥V3的側(cè)面入口，調(diào)節(jié)閥門使此側(cè)面入口和頂部port排氣端口相通。確定蠕動泵轉(zhuǎn)動方向是否正確，然后按住蠕動泵面板上的max按鈕半分鐘左右，使用最大流速來排掉柱前管路的氣泡。確認(rèn)柱前管路中氣泡排干凈后，調(diào)節(jié)正確的轉(zhuǎn)速并start，然后切換柱頭V3閥門，使液體進(jìn)柱，與此同時(shí)快速打開柱底閥門V4,使其和檢測器管路相通，并確認(rèn)出口管有液體平穩(wěn)流出，以保證各閥門位置正確。52

18、2消毒SIP和平衡。確認(rèn)進(jìn)樣切換閥V1的位置正確，使用清洗溶液（一般為0.5-1MNaOH）或水以正確的流速清洗/平衡柱子（分子篩一般20-60cm/h；離子交換等一般100-300cm/h）。清洗/平衡中間每次如需要更換泵入口的溶液,都需要切換柱頂部V3閥門進(jìn)行排氣，以免氣泡進(jìn)柱。清洗后的柱子一般需平衡2-5CV并待基線和壓力都平穩(wěn)后，且柱出口pH試紙測試為中性才能開始進(jìn)樣。柱子用水平衡的后期，打開Uvis-920檢測器和工作站來記錄并觀察基線是否平穩(wěn)。523進(jìn)樣和數(shù)據(jù)采集。打開Uvis-920電源，按左側(cè)的“run/end”按鈕打開光源，面板顯示running，并且吸光度數(shù)值x.xxxxx

19、AU在不斷的變化（AU為光吸收單位），則說明光源已經(jīng)打開。電腦中打開工作站和相應(yīng)通道開始預(yù)覽（preview）走基線，設(shè)置preview（預(yù)覽）的曲線顏色為紅色，采集的曲線顏色為藍(lán)色。平衡到相應(yīng)的柱體積后，觀察基線是否平穩(wěn)，如果不平穩(wěn)，則需要繼續(xù)平衡。如果基線平穩(wěn)，停泵，關(guān)閉柱底閥門V4,切換柱頭V3閥門與大氣相通，拿起在與V1相連的在水面下的管路，開泵max排干管路中水，切換V1與1%丙酮溶液相通，開泵max排掉管路中氣泡，調(diào)節(jié)泵速至13L/h，切換柱頭V3閥門進(jìn)柱的同時(shí)打開柱底閥門V4，并在V4出口端用量筒盛接流出的液體，待液體體積到達(dá)377mL（1%CV上樣量）時(shí)停泵。拿起在與V1相連的

20、在1%丙酮里的管路，開泵max排干管路中丙酮，切換V1與水相通，開泵max排掉管路中氣泡，調(diào)節(jié)泵速至13L/h。在Uvis-920面板上按右側(cè)的“Autozero”來使UV吸收值回零，然后電腦中點(diǎn)擊相應(yīng)通道的“U”按鈕進(jìn)行基線回零，切換柱頭V3閥門進(jìn)柱,打開柱底閥門V4,同時(shí)電腦中點(diǎn)擊采集左上角的“”按鈕，開始洗脫并采集數(shù)據(jù)。5.2.4測定柱效。待工作站顯示出峰后，點(diǎn)擊“”按鈕結(jié)束采樣，采集的譜圖會自動記錄于硬盤上，然后按Uvis-920檢測器左側(cè)的“run/end”按鈕關(guān)閉光源，用工作站打開記錄的圖譜，可直接讀出對應(yīng)峰值的理論塔板數(shù)N和對稱因子As，不過該塔板數(shù)是對應(yīng)柱高的數(shù)據(jù)，應(yīng)該換算為每

21、米的塔板數(shù)N/m。注：Uvis-920手動系統(tǒng)只可以測定UU值而無法測定電導(dǎo)值，故只能用丙酮來測定柱效。7GEHealthcareLifeSciencesChromaflow層析柱標(biāo)準(zhǔn)裝柱操作規(guī)程6、柱子拆卸將頂部和底部nozzle均調(diào)至UNPACK，利用packingpump泵入60-70水到柱子中并收集膠懸液到slurry儲罐中，再關(guān)閉水供給管道(B)并打開slurry供給管道(C),利用packingpump不間斷地泵入slurry直到膠床松散，比如柱子中充滿slurry。停止packingpump，打開unpackingpump,將slurry泵入儲罐中，并打開水供給管道(B)來清洗柱

22、子和管道里的剩余slurry至儲罐。附表1：各種填料基本性質(zhì)及柱效要求填料平均粒徑(pm)柱效要求理論塔板數(shù)N/m對稱因子As測定流速(cm/h)SOURCOURCE30301100050HP,Superdex34980030Sephacryl506700CaptoMMC,Adhere7544000.8-1.520MabSelect75/853900FastFlow903700CaptoQ,S903700BigBeads180170010附表2：各種填料操作壓力列表基質(zhì)臨界壓力(bar)最大裝柱壓力(bar)最大操作壓力(bar)Sepharose4FF1.00.80

23、.6Sepharose6FF3.02.01.5SepharoseXL3.02.01.5SepharoseBB3.02.01.5SepharoseHP3.53.02.5SephacrylHR1.51.20.9SephadexG-251.00.70.5Superdex(HP)3.53.02.5MabSelect4.03.02.0Source>6.06.06.0CaptoQ>4.04.03.0附表3：各種填料裝柱方法匯總（其他型號可參考）填料層析柱裝柱條件柱床高度壓縮因子方法來源Sepharose4FFCFV600130cm/h,0.3bar20cm1.15InstructionsforcolumnpackingCFV400430cm/hfor10min;240-190cm/hfor10min30cmLotusCFV400400cm/hfor10min;260-190cm/hfor10min25cmLotusCFV800600cm/hfor5min;430cm/hfor5min20cmLotusSepharose6FFCFV1000250cm/h,1.5bar20cm1.15InstructionsforcolumnpackingSepharoseHPCFV400-1000130cm/h