養(yǎng)細胞過程所用的試劑簡介

1、1.pbs緩沖液PBS是磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline）一般作為溶劑，起溶解保護試劑的作用。它是生物化學研究中使用最為廣泛的一種緩沖液，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它們有二級解離，緩沖的pH值范圍很廣；而NaCl和KCl主要作用為增加鹽離子濃度。如有需要PBS還可以補加1 mmol/L CaCl2和0.5 mmol/L MgCl2，以提供雙價陽離子。注：PBS不是磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PB）配制方法為：稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4

2、·12H2O)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，吐溫20 ，加水。PBS:Phosphate Buffered SalinePBS 1L配方pH7.4：磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.27g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g，氯化鈉(NaCl)：8g，氯化鉀(KCl)0.2g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L保存方法高溫高壓滅菌后置于4攝氏度冰箱保存待用。PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO4 2mmol/LPBS緩沖液一

3、般作為溶劑，起溶解保護試劑的作用，具體試劑一般也有不同的比例配方，在針對性上就有了更好的效果。1x PBS緩沖液就是0.01M的PBS,可直接使用,2x PBS就是2倍濃度,使用時稀釋一倍使用。0.1M的PBS一般不用來配置緩沖液,用于其它用處。作用PBS是磷酸緩沖鹽溶液的簡稱，不僅偽狂犬病毒要用它稀釋，一般的有活性的生物制劑都要用它來稀釋。原因就是它具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，蒸餾水不具有鹽平衡作用，可以破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性；生理鹽水不具有調(diào)整pH的作用，對完整的、具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng)，所以使用PBS是首選。PBS也不是萬能的，有的生物活性物質(zhì)需

4、要的條件比PBS還要高，就需要在平衡緩沖液中加入更多的成分，維持最佳的條件保證生物活性物質(zhì)保持其最完整的特性2.DMEM培養(yǎng)液DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細胞等DMEM是 dulbecco's modified eagle medium的縮寫，所以其特點主要包括以下：（1）氨基酸含量為依格爾培養(yǎng)基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；（2）維生素含量為依格爾培養(yǎng)基的4倍

5、；（3）含有糖酵解途徑中的重要物質(zhì)丙酮酸；（4）含有微量的鐵離子。DMEM(A) 細胞培養(yǎng)基（粉末型）成份不需要自己配序號化合物名稱含量 (mg/L)序號化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣 .2H 2 O265.0018L-絲氨酸42.002硝酸鐵 .9H 2 O0.1019L-蘇氨酸95.003氯化鉀400.0020L-色氨酸16.004無水硫酸鎂97.6721L-酪氨酸72.005氯化鈉6400.0022L-纈氨酸94.006無水磷酸二氫鈉109.0023D-泛酸鈣4.007丁二酸75.0024酒石酸膽堿7.208丁二酸鈉100.0025葉酸4.009L-鹽酸精氨酸84.0026肌醇

6、7.2010L-鹽酸胱氨酸63.0027煙酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黃素0.4012L-鹽酸組氨酸42.0029鹽酸硫胺4.0013L-異亮氨酸105.0030鹽酸吡哆辛4.0014L-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015L-鹽酸賴氨酸146.0032丙酮酸鈉110.0016L-甲硫氨酸30.0033酚紅9.30.0017L-苯丙氨酸66.00該類培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和各種初代病毒宿主細胞的細胞培養(yǎng)及單一細胞培養(yǎng);如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等細胞系的培養(yǎng)。3. 胰蛋白酶胰蛋白酶在細胞培養(yǎng)中的作用胰蛋白酶的

7、作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在 pH 為 8.0 、溫度為 37 時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。4.MTTMTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源

8、性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在540 或720nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在配制和保存

9、的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；

10、往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。5.冷凍細胞中用的DMSO（二甲基亞砜）在細胞凍存中的應(yīng)用二甲基亞砜是一種重要的滲透型細胞保護劑。在深低溫（零下200度）保存細胞時凍存過程中，為防止細胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結(jié)構(gòu)紊亂等導致的損傷，有必要使用含有DMSO冷凍保護劑。DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內(nèi)離子濃度，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細胞損傷。深低溫時二甲基亞砜的細胞毒性受到抑制。復蘇時動作要快，盡快洗掉二甲基亞砜，否則會造成對細胞嚴重的毒性。二甲基亞砜（DMSO）是目前最好的細胞凍存保護劑，但也是一種以細胞毒性很大的化學試驗劑。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中DMSO濃度為10%時，細胞生長抑制率近100%；1濃度時抑制率為35%，即使是0.04的濃度，DMSO對細胞的生長也有不利的影響。另外注意DMSO存在一定的毒性作用，用的時候要避免其揮發(fā)，要準備1%-5%的氨水備用，皮膚沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗滌.最為常見的為惡心、嘔吐、皮疹及在皮膚、和