白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測

1、第四章第四章 白細(xì)胞抗原檢測白細(xì)胞抗原檢測嚴(yán)力行嚴(yán)力行目 錄第一節(jié) HLA血清學(xué)檢測 HLA抗原檢測 HLA抗體檢測第二節(jié) HLA細(xì)胞學(xué)檢測第三節(jié) HLA分子生物學(xué)檢測 HLA的分子生物學(xué)檢測方法 HLA常見基因分型方法比較 HLA分型模棱兩可結(jié)果的原因及其對策第四節(jié) 粒細(xì)胞抗原抗體檢測第一節(jié)第一節(jié) HLA HLA血清學(xué)檢測血清學(xué)檢測重點提示 HLA抗原檢測 掌握微量淋巴細(xì)胞毒實驗的原理及其影響因素 HLA抗體檢測方法 淋巴細(xì)胞毒方法 流式細(xì)胞儀方法 ELISA方法 Luminex檢測技術(shù) 掌握不同方法的原理及其優(yōu)缺點微量淋巴細(xì)胞毒試驗微量淋巴細(xì)胞毒試驗 HLA抗原的血清學(xué)分型方法 用一系列已

2、知的抗HLA標(biāo)準(zhǔn)分型血清來檢測未知淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原型別 微量淋巴細(xì)胞毒實驗原理 基于抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體免疫復(fù)合物在補體的作用破壞細(xì)胞膜 利用染料或其它方法鑒定和區(qū)分死活細(xì)胞 計分法：NIH計分法 HLA抗血清的來源抗血清的來源 HLA抗體血清來源 同種免疫刺激產(chǎn)生HLA同種抗體 HLA抗原免疫刺激動物 雜交瘤技術(shù) 人群存在的天然抗體微量淋巴細(xì)胞毒試驗的影響因素微量淋巴細(xì)胞毒試驗的影響因素 HLA抗血清 抗血清來源和抗體種類、抗血清效價、抗血清特性、抗血清質(zhì)量 淋巴細(xì)胞 淋巴細(xì)胞活性 、淋巴細(xì)胞純度、淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞上抗原表達(dá)異常 孵育時間和溫度 補體活性 染色和固定時間血清學(xué)

3、抗原分型方法評價血清學(xué)抗原分型方法評價 血清學(xué)方法抗原分型 檢測HLA-類和類抗原 檢測HLA-類抗原相對容易 檢測HLA-類抗原需要分離和純化淋巴細(xì)胞 易受多種因素影響 其錯誤率相對較高 HLA血清學(xué)某一座位上只能檢測到一個抗原，而基因分型存在兩個不同等位基因，應(yīng)考慮到無效等位基因HLA抗體檢測抗體檢測 補體依賴的淋巴細(xì)胞毒方法（CDC） 采用淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞抗原 易受多種因素影響，檢測敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能檢測HLA-I和HLA-II抗體 流式細(xì)胞術(shù) 采用淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞抗原 結(jié)合熒光檢測技術(shù)特點 Luminex檢測技術(shù) 結(jié)合熒光流式細(xì)胞儀和免疫標(biāo)記技術(shù) 可區(qū)分

4、HLA-I和HLA-II抗體 可鑒定抗體的屬性和強度HLA抗體檢測抗體檢測 Luminex檢測技術(shù)檢測技術(shù) 以包被抗原的微球磁珠作為靶細(xì)胞 每種磁珠上包被一種抗原 多種磁珠可以在同一體系內(nèi)反應(yīng) 待測血清與磁珠孵育 存在HLA抗體時，形成抗原-抗體復(fù)合物 加入熒光標(biāo)記的抗人IgG抗體 形成抗原-抗體-熒光標(biāo)記抗體復(fù)合物 Luminex儀測定微球磁珠上的熒光值 判定HLA抗體的強度和特異性 微球磁珠熒光值大小 每種磁珠的反應(yīng)特性第二節(jié)第二節(jié) HLA HLA細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞學(xué)檢測 重點提示 掌握下列方法的基本原理及其應(yīng)用 混合細(xì)胞培養(yǎng)方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 純

5、合分型細(xì)胞（homozygote typing cell,HTC） 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗（primed lymphocyte test,PLT）混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC） 二個無關(guān)個體的淋巴細(xì)胞在體外混合一起培養(yǎng) 二者組織相容性抗原不同，互相刺激對方的T細(xì)胞發(fā)生增殖 增殖反應(yīng)強度與組織相容性抗原的差異程度成正比 轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、核內(nèi)DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 實體器官移植前的快速相容性檢測 分為雙向MLC和單向MLC混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 雙向MLC 雙方的淋巴細(xì)胞互相刺激而增生、轉(zhuǎn)化，即雙方的淋巴細(xì)胞既

6、是刺激細(xì)胞，又是反應(yīng)細(xì)胞 抗原相同或相容，則刺激作用很小，細(xì)胞無變化 抗原不相容，則刺激作用大，細(xì)胞被活化并產(chǎn)生增殖 單向MLC 一方的淋巴細(xì)胞用X線照射或用絲裂霉素C處理 喪失增殖反應(yīng)能力而仍保留其抗原刺激效應(yīng) MLC只有一方淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，故可了解單一個體淋巴細(xì)胞的刺激強度和應(yīng)答程度純合細(xì)胞分型方法純合細(xì)胞分型方法 純合細(xì)胞分型方法（也稱為陰性分型） 已知HLA-Dw型別的經(jīng)滅活的純合子細(xì)胞作為刺激細(xì)胞 待檢細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞 兩種細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 若不發(fā)生或僅發(fā)生弱的增殖反應(yīng) 表明受檢細(xì)胞具有與純合子分型細(xì)胞相同的HLA-Dw型別，它可能為特定HLA-Dw型的純合子或雜合

7、子 發(fā)生增殖反應(yīng) 表明受檢細(xì)胞不具有純合子細(xì)胞擁有的HLA-Dw型別預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL） 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL） 僅對一種單體型具有識別增殖能力，而處于靜止?fàn)顟B(tài)的小淋巴細(xì)胞 作為應(yīng)答細(xì)胞參與了初次MLC反應(yīng)，經(jīng)過增殖后又回到小淋巴細(xì)胞 遇到相應(yīng)抗原刺激后，迅速發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗（又稱為陽性分型法) PL細(xì)胞作為已知的分型細(xì)胞 待檢淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞 待檢淋巴細(xì)胞分別與一系列的預(yù)致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向MLC 待檢細(xì)胞與預(yù)致敏淋巴細(xì)胞預(yù)先識別的抗原相同，預(yù)致敏淋巴細(xì)胞會迅速增殖 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗是用陽性反應(yīng)作為判定

8、標(biāo)準(zhǔn)第三節(jié)第三節(jié) HLA HLA分子生物學(xué)檢測分子生物學(xué)檢測 重點提示 HLA的分子生物學(xué)檢測方法 掌握PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex檢測技術(shù)、基因芯片、PCR-SBT的基本原理 掌握HLA常見基因分型方法的特點及其適用范圍 HLA高分辨分型中模棱兩可結(jié)果的原因及其對策 明確其形成原因 掌握4種常見方法的原理及其應(yīng)用HLA分子生物學(xué)檢測分子生物學(xué)檢測 HLA基因分型技術(shù)主要方法 PCR序列特異性引物（PCR sequence specific primer, PCR-SSP） PCR序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（PCR sequence specific oligonucleot

9、ide probe, PCR-SSO） Luminex檢測技術(shù) 基因芯片 核苷酸序列測定法（PCR sequence based-typing，PCR-SBT）PCR序列特異性引物序列特異性引物 PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HLA等位基因核苷酸堿基序列的差異性，設(shè)計出一系列特異性引物 引物3端最后一個堿基是否與其等位基因DNA模板配對起決定作用 根據(jù)多對引物擴增的結(jié)果可以指定HLA基因型 方法操作簡單，快速耗時較短，結(jié)果判斷簡便 有低分辨和高分辨分型試劑，為實驗室常用的方法之一 可能出現(xiàn)假陽性帶或漏帶現(xiàn)象 某些罕見的HLA等位基因存在錯誤結(jié)果PCR序列特異性寡核苷酸探針序列特異

10、性寡核苷酸探針 PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO) 利用核酸互補的雜交技術(shù) 特異性引物擴增目的DNA片段 PCR擴增產(chǎn)物與特異性探針進(jìn)行雜交 酶促反應(yīng)體系或顯色（影）溶液進(jìn)行顯色 無顏色顯示 基因片段與探針不互補 顯示顏色 基因片段與探針互補 根據(jù)多個探針雜交信號結(jié)果進(jìn)行HLA分型指定Luminex檢測技術(shù)檢測技術(shù) Luminex檢測技術(shù) 原理是利用核酸互補的雜交技術(shù) 每一種微球上只固定一種已知序列的特異性探針 利用特異性引物擴增目的DNA片段 PCR擴增產(chǎn)物與多種微球在同一孔內(nèi)進(jìn)行特異性雜交 雜交后加入熒光顯色劑 Luminex檢測儀綠色激光束檢測雜交信號 Luminex檢測儀紅

11、色激光束區(qū)分探針的種類 擴增基因片段與探針不互補，在微球上無熒光顯示 擴增基因片段與探針互補，在微球上有熒光顯示 根據(jù)熒光值強度大小可以判定待測片段是否與探針互補基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù) 技術(shù)原理是根據(jù)核酸互補的雜交技術(shù)，并結(jié)合激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)特性 在特定載體（玻璃、硅等）上高密度有序地排列特定寡核苷酸片段作為探針 對待檢標(biāo)本HLA基因片段進(jìn)行擴增并熒光標(biāo)記 將待測標(biāo)記的HLA基因片段與特定探針進(jìn)行雜交 基因片段與探針不互補，該探針位置無熒光顯示 基因片段與探針互補，該探針位置可顯示熒光 通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，根據(jù)熒光值強度大小可以判定待測片段是否與探針

12、互補核苷酸序列測定法核苷酸序列測定法 核苷酸序列測定法（PCR-SBT） 擴增目的DNA片段 對擴增片段進(jìn)行測序分析 指定HLA等位基因型別 根據(jù)測序序列中核苷酸多態(tài)性位點堿基情況，與已知可能的等位基因的序列進(jìn)行比較 直接檢測基因的核苷酸序列 屬于高分辨方法，結(jié)果準(zhǔn)確性最高 直接雙鏈測序過程中存在模棱兩可基因型結(jié)果新一代測序技術(shù)新一代測序技術(shù) 新一代測序（NGS）技術(shù) 市場上有多種技術(shù)平臺，其測序原理上存在差異 NGS已應(yīng)用于HLA分型 其關(guān)鍵在于如何系統(tǒng)建立好HLA位點的DNA文庫 片段擴增和測序步驟則取決于所用的技術(shù)平臺 應(yīng)用于HLA-I和HLA-II位點分型 單鏈測序結(jié)果 NGS進(jìn)行HL

13、A分型存在一定的偏差HLA常見基因分型方法比較常見基因分型方法比較模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因 PCR-SSP的模棱兩可結(jié)果 PCR-SSP方法針對同一座位上不同等位基因堿基多態(tài)性位點設(shè)計引物 引物可特異性針對單一或多個等位基因 只擴增某特定的單一等位基因 可直接指定特定單一等位基因 引物對常擴增HLA某一座位數(shù)個等位基因 存在多種可能性 PCR-SSP方法可產(chǎn)生一定的模棱兩可分型結(jié)果 采用不同引物對的組合方式來指定或排除某個等位基因 等位基因數(shù)量較多而且引物大多針對多個等位基因模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因 PCR-SSO的模棱兩可結(jié)果 探針的序列決定其特異性

14、部分探針只與某一等位基因序列互補雜交 標(biāo)本與該探針雜交可明確無誤地指定相應(yīng)特定等位基因 絕大多數(shù)探針能夠與多種等位基因序列互補雜交 無法單純依靠這種探針進(jìn)行等位基因指定 探針反應(yīng)格局表通過數(shù)理邏輯關(guān)系指定HLA基因型 大量探針往往針對多個等位基因，錯綜復(fù)雜的雜交格局，導(dǎo)致產(chǎn)生模棱兩可的分型結(jié)果模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因 PCR-SBT的模棱兩可結(jié)果 雙鏈測序反應(yīng)得到的序列是兩個等位基因序列的組合 測序獲得的序列與多種等位基因的組合序列完全匹配 有三種情況可能引起模棱兩可的結(jié)果 測序區(qū)域未包括這些等位基因核苷酸的區(qū)分點 A*74:01和A*74:02僅在第1號外顯子存在差別(第

15、67位) 大多數(shù)等位基因未測定全部外顯子序列 HLA-A*02:08、HLA-A*03:06缺乏第4外顯子序列 多種等位基因組合在測序區(qū)域內(nèi)具有相同的雜合序列 DRB1*03:01:01G+DRB1*13:32、DRB1*03:06+DRB1*13:93和DRB1*03:12+DRB1* 13:40的組合在2號外顯子表現(xiàn)為完全相同的雜合序列模棱兩可結(jié)果區(qū)分的策略模棱兩可結(jié)果區(qū)分的策略 模棱兩可結(jié)果區(qū)分的方法 常見及確認(rèn)等位基因原則（Common alleles and well documented alleles，CWD） 結(jié)合多種方法結(jié)果進(jìn)行綜合判斷 改用其它廠家的試劑 增加測序的范圍或雜

16、交的探針數(shù) 采用單鏈DNA抽提技術(shù) 采用單鏈擴增技術(shù) 采用組特異性測序引物技術(shù) 克隆轉(zhuǎn)染后形成單鏈后檢測CWD原則原則 HLA等位基因定義為三大類 常見等位基因（Common alleles） 指那些在參考群體中頻率大于0.001的等位基因 確認(rèn)等位基因（Well-documented alleles） 至少在五個獨立非親緣個體中或者三個獨立非親緣個體中并伴有特定的單體型被檢測到的等位基因 罕見等位基因（Rare alleles) 除常見等位基因和確認(rèn)等位基因以外的所有等位基因 它們的頻率很低CWD原則原則 CWD原則 CWD原則分型中將常見等位基因和確認(rèn)等位基因合并為CWD,當(dāng)模棱兩可的等位

17、基因組合中出現(xiàn)CWD等位基因可能需要進(jìn)一步區(qū)分，而出現(xiàn)罕見等位基因組合，其臨床分型中實際意義有限，可予以排除單鏈單鏈DNA抽提技術(shù)抽提技術(shù) 單鏈DNA抽提技術(shù)將個體兩個等位基因進(jìn)行分離 根據(jù)等位基因序列設(shè)計生物素標(biāo)記的特異性探針（僅與某一等位基因互補） 探針與標(biāo)本基因組DNA進(jìn)行雜交反應(yīng) 雜交后將形成單一等位基因DNA/特異性探針復(fù)合物 加入鏈親和素標(biāo)記磁珠，將形成單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物 洗滌后溶液中只含有單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物單鏈單鏈DNA抽提技術(shù)抽提技術(shù) 單鏈分離技術(shù) 探針結(jié)合雜交互補 選擇性獲取單體型 商業(yè)產(chǎn)品 HLA-C*01:02 Biotin

18、-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA 圖為單鏈抽提圖為單鏈抽提C*01:02后測序的一段序列后測序的一段序列單鏈擴增技術(shù)單鏈擴增技術(shù) 該技術(shù)原理類似于PCR-SSP 選擇合適的引物只擴增個體兩個等位基因的特定等位基因 比對序列 設(shè)計特異性引物 重點在于引物序列 TGGCGCCCCGAACCCTCG 圖為單鏈擴增圖為單鏈擴增A*24:02后測序的一段序列后測序的一段序列組特異性測序引物技術(shù)組特異性測序引物技術(shù) 該技術(shù)原理利用特異性引物進(jìn)行測序反應(yīng)在測序過程中設(shè)計特異性的測序引物該引物只能與某一個等位基因的序列互補該引物測序?qū)⒌玫脚c引物序列互補的某個特定等位基因的序列A-98T

19、CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA 圖為A*02:01,11:01用特異性引物測序后的比較 第四節(jié)第四節(jié) 粒細(xì)胞抗原抗體檢測粒細(xì)胞抗原抗體檢測 重點提示 掌握粒細(xì)胞抗原、抗體檢測血清學(xué)診斷方法的原理 粒細(xì)胞凝集試驗 粒細(xì)胞免疫熒光試驗 流式細(xì)胞技術(shù) 單克隆抗體粒細(xì)胞抗原捕獲試驗 ELISA方法 掌握HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù)原理及其適應(yīng)范圍 PCR限制性片段長度多態(tài)性 PCR序列特異性引物 PCR直接測序法 多重SNaPshot 技術(shù)粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞凝集試驗（GAT方法） 分離新鮮的粒細(xì)胞 在

20、Terasaki微量板上進(jìn)行實驗 待測粒細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗血清反應(yīng)后或標(biāo)準(zhǔn)粒細(xì)胞與待檢血清反應(yīng)后在顯微鏡下觀察粒細(xì)胞凝集情況 依據(jù)細(xì)胞凝集情況來判定抗原或抗體的特性早期建立的方法，操作簡單方法靈敏度、特異性都不高HLA抗體和某些高滴度的免疫復(fù)合物會導(dǎo)致假陽性結(jié)果粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞免疫熒光試驗（GIFT） 直接法用于檢測粒細(xì)胞抗原 熒光標(biāo)記的粒細(xì)胞抗體與待檢粒細(xì)胞反應(yīng) 有相應(yīng)的抗原存在時可形成抗原抗體反應(yīng) 通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況間接法用于檢測粒細(xì)胞抗體或抗原 分離出新鮮的粒細(xì)胞與待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標(biāo)記的抗人

21、IgG反應(yīng)，繼續(xù)形成抗原-抗體-熒光標(biāo)記抗人IgG結(jié)合物，洗滌后通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況敏感性、特異性均優(yōu)于GAT法需要熒光顯微鏡，實驗干擾因素較多粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法流式細(xì)胞技術(shù) 檢測粒細(xì)胞抗原或抗體 以抗體檢測為例闡述其原理 將粒細(xì)胞與待檢血清進(jìn)行反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標(biāo)記的抗人IgG-Fc、IgM-Fc 繼續(xù)形成抗原-待檢抗體-熒光標(biāo)記抗人Ig結(jié)合物 通過流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測熒光的情況 該方法敏感性、特異性較好粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法單克隆抗體粒細(xì)胞抗原捕獲試驗( MAIGA方法) 粒

22、細(xì)胞與待檢血清反應(yīng)，存在相應(yīng)抗體可形成抗原抗體復(fù)合物 加入特定的單克隆抗體，形成單克隆抗體-抗原-抗體三聯(lián)復(fù)合物 細(xì)胞裂解離心獲取上清液（含三聯(lián)復(fù)合物），將其加入到包被特定抗體的ELISA板微孔內(nèi)反應(yīng)，可形成包被抗體-單克隆抗體-粒細(xì)胞抗原-待測抗體復(fù)合物 洗滌后加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體形成包被抗體-單克隆抗體-粒細(xì)胞抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物 顯色劑比色分析，根據(jù)顯色程度判定抗體情況粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法粒細(xì)胞抗原、抗體檢測診斷方法ELISA方法 特異性單克隆抗體包被的微板 加入粒細(xì)胞抗原和待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體可形成包被抗體-抗原-待測抗體復(fù)合物 加入酶標(biāo)記的抗人IgG形成包被抗體-抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物 加顯色劑進(jìn)行比色分析 根據(jù)顯色程度判斷抗體的有無和強度 ELISA方法敏感性和特異性較好HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù)系統(tǒng)基因分型技術(shù)PCR限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) PCR擴增目的DNA片段，產(chǎn)物采用合適的限制性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，電泳后進(jìn)行分辨 HNA不同等位基因的酶切圖譜不同 PCR-RFLP方法簡便，分型時間較短 已成功用于HNA-4a 和-5a的分型PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HNA系統(tǒng)等位基因核苷酸堿基序列差